Мышиная модель легочного фиброза, вызванного распылением назального блеомицина

Резюме

Были созданы различные животные модели легочного фиброза с использованием блеомицина для уточнения патогенеза легочного фиброза и поиска новых мишеней для лекарств. Тем не менее, большинство моделей легочного фиброза, нацеленных на легочную ткань, имеют неравномерное введение препарата. В данной работе мы предлагаем модель равномерного легочного фиброза, вызванного назальной небулизацией блеомицина.

Аннотация

Фиброз легких характерен для нескольких заболеваний легких человека, которые возникают по различным причинам. Учитывая, что варианты лечения довольно ограничены, мышиные модели продолжают оставаться важным инструментом для разработки новых антифибротических стратегий. В этом исследовании внутрилегочное введение блеомицина (BLM) осуществляется путем небулизации носа для создания мышиной модели легочного фиброза, которая точно имитирует клинические характеристики заболевания. Мыши C57BL/6 получали BLM (7 ЕД/мл, 30 мин/сут) путем небулизации носа в течение 3 дней подряд и были умерщвлены на 9, 16 или 23 день для наблюдения за воспалительными и фиброзными изменениями в легочной ткани. Назальный аэрозольный BLM был направлен непосредственно на легкие, что приводило к широкому и равномерному воспалению легких и фиброзу. Таким образом, мы успешно создали экспериментальную мышиную модель типичного легочного фиброза человека. Этот метод может быть легко использован для изучения влияния введения различных назальных аэрозолей на патофизиологию легких и валидации новых противовоспалительных и антифибротических методов лечения.

Введение

Легочный фиброз – это прогрессирующий патологический процесс, при котором чрезмерное отложение компонентов внеклеточного матрикса, в первую очередь коллагена I типа, в интерстиции легких приводит к нарушению функции легких¹. Патофизиология легочного фиброза сложна, и возможности лечения в настоящее время весьма ограничены. Мышиные модели остаются важным инструментом для изучения патогенетических механизмов, способствующих возникновению и прогрессированию заболевания, а также новых стратегий разработки лекарств.

Различные животные модели легочного фиброза основаны на интратрахеальном инстилляции BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Тем не менее, распределение фиброзных изменений, которые вызывает BLM в легких, неравномерно, и животные подвержены риску удушья в процессе закапывания. Хотя внутрибрюшинное введение BLM вызывает относительно равномерные фиброзные изменения в легких, оно требует многократных доз из-за недостаточного нацеливания препарата. Внутритрахеальное введение аэрозоля через ларингоскоп не требует трахеотомии или пункции, а полученное в результате распределение препарата в легких является оптимальным. Однако аэрозольные частицы имеют большие размеры (5-40 мкм) и, таким образом, не могут достичь субплевральной области легочной ткани.

В данном исследовании внутрилегочное введение BLM осуществляется методом назальной небулизации. Во время распыления мыши самопроизвольно дышали и вдыхали частицы препарата. Аэрозольные частицы имели размер 2,5-4 мкм, что позволяло им не только равномерно распределяться по всему легкому, но и достигать субплевральной области. При малом увеличении наиболее значимыми гистопатологическими особенностями легких у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом (ИЛФ) являются различная тяжесть поражений, непоследовательное распределение, чередование различных фазовых поражений, а также наличие интерстициального воспаления, фиброзных поражений и сотовых изменений легких, чередующихся с нормальной легочной тканью. Эти патологические изменения преимущественно затрагивают периферическую субплевральную паренхиму или лобулярную перегородку вокруг бронхиол. Таким образом, учитывая, что такой подход позволяет частицам BLM достигать субплевральной области легких, данная модель точно имитирует клинические характеристики заболевания у человека.

протокол

Комитет по исследованиям на животных Больницы китайско-японской дружбы (Пекин, Китай) одобрил все процедуры на мышах, которые были выполнены в рамках этого исследования (NO190108). Мышей содержали в стерильном помещении для животных Китайско-японского института клинических медицинских исследований дружбы при комнатной температуре 20-25 °C, относительной влажности 40-70%, интенсивности света животных 15-20 лк, чередовании света и темноты в течение 12 часов/12 часов. Животные имели свободный доступ к пище и воде.

1. Мыши

1. Убедитесь, что все животные акклиматизированы в жилом помещении за 7 дней до распыления.
2. Для распыления используйте мышей-самцов C57BL/6 в возрасте 8-10 недель.

2. Небулайзеризация назального блеомицина

1. Приготовление блеомицина
   ВНИМАНИЕ: BLM - это химический яд, который убивает опухоли, но также может повредить нормальные клетки и нормальные ткани.
   1. Приготовьте раствор BLM на чистом стенде.
      1. Для получения рабочей концентрации (7 Ед/мл) ресуспендировать 15 Ед гидрохлорида BLM в 2,14 мл нормального физиологического раствора. Тщательно перемешайте ресуспендированный BLM до полного растворения.
   2. Храните рабочий раствор при температуре 4 °C или на льду и используйте в течение 1 суток. Перед распылением доведите раствор BLM до комнатной температуры.
2. Анестезия
   1. Подготовьтесь к анестезии, растворив 0,1 г пентобарбитала натрия в 10 мл обычного физиологического раствора. Храните рабочий раствор для анестезии в темном месте при температуре 4 °C и используйте в течение 3 дней.
   2. Обезболивайте мышей путем введения пентобарбитала натрия в брюшную полость с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 г в окончательной дозе 75 мг/кг массы тела.
      Примечание: В этом исследовании мыши не реагировали на эту дозу в течение как минимум 30 минут. При необходимости корректируйте дозу по согласованию с ветеринарным врачом в соответствии с реакцией мыши.
   3. Через несколько минут надавите на пальцы ног мыши, находящейся под наркозом, указательным и большим пальцами, чтобы убедиться, что рефлекс отведения конечности исчез.
3. Подготовка системы распыления
   1. После калибровки прибора закрепите мышь под наркозом мягкой сетчатой крышкой (рис. 1А), добавьте рабочий раствор BLM в верхнюю распылительную головку экспонируемой башни с помощью пипетки (рис. 1В) и запустите небулайзер в течение 30 мин для достижения стабильного распыления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс показан на рисунке 1C,D. Подробные инструкции по работе с программным обеспечением см. на Дополнительном рисунке S1 и Дополнительном рисунке S2, которые иллюстрируют шаги 2.3.1.1-2.3.1.9.
      1. Дважды щелкните по значку flexiWare 8 (дополнительный рисунок S1A), нажмите на сеанс экспериментирования (дополнительный рисунок S1B) и нажмите кнопку « Новое исследование » (дополнительный рисунок S1C).
      2. Измените название эксперимента (дополнительный рисунок S1D) и заголовок и владельца (дополнительный рисунок S1E).
      3. Выберите шаблон IX-4DIO (Дополнительный рисунок S1F), введите оператор (Дополнительный рисунок S1G), нажмите кнопку «Подтвердить » (Дополнительный рисунок S1H) | Кнопка «Далее» (дополнительный рисунок S1I).
      4. Выберите насос и нажмите «Далее» (дополнительный рисунок S1J) | Кнопка "Далее" (Дополнительный рисунок S2A) | Кнопка «Далее» (дополнительный рисунок S2B) | Кнопка «Готово» (дополнительный рисунок S2C).
      5. Нажмите на настройки для Continuous-1Lmin (три точки, дополнительный рисунок S2D) | DIO1, установите Коэффициент заполнения (%) на 25% и нажмите OK (Дополнительный рисунок S2E).
      6. Нажмите DIO2, установите коэффициент заполнения (%) на 25%, а затем нажмите OK (дополнительный рисунок S2F).
      7. Нажмите кнопку DIO3, установите коэффициент заполнения (%) на 25%, а затем нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок S2G).
      8. Нажмите кнопку DIO4, установите коэффициент заполнения (%) на 25%, а затем нажмите кнопку OK (дополнительный рисунок S2H).
      9. Нажмите верхнюю зеленую кнопку (слева), чтобы начать работу, и нажмите красную кнопку (справа), чтобы остановить работу. Нажмите x в правом верхнем углу, чтобы выйти (дополнительный рисунок S2I).
   2. В группе BLM распыляйте 12 мышей за раз, в общей сложности четыре раза, всего до 48 мышей. Распыляйте одновременно шесть мышей в нормальной контрольной группе с помощью физиологического раствора.
4. Восстановление животных
   1. После лечения в небулайзере в течение 30 минут переместите мышь в клетку для восстановления, оборудованную грелкой.
   2. Наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не придут в полное сознание.
   3. Как только подтвердится, что мышь находится в хорошем состоянии, что означает, что она может свободно двигаться, верните ее в исходную клетку. Не помещайте его вместе с другими животными, пока он полностью не выздоровеет.
   4. Проверяйте физиологические показатели, включая частоту дыхания, выживаемость и любые симптомы, дважды в течение 24 часов после лечения BLM.

3. Обработка легочной ткани

1. Через 9, 16 и 23 дня после введения BLM принесите в жертву шесть мышей, введя им в брюшную полость пентобарбитал натрия (конечная доза 100 мг/кг массы тела).
2. Удалите трахею и легкие и немедленно промойте холодным фосфатно-солевым раствором.
3. Зафиксируйте левое легкое в 10% нейтральном формалиновом буфере на 24 ч до введения парафина.
4. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E окрашивание)
   1. Обезвоживайте неподвижную легочную ткань в дегидраторе.
   2. Поместите обезвоженный блок легочной ткани в коробку для растворения воска при температуре 56 °C на 1 час.
   3. Для заделки залейте расплавленный парафин в формовочную коробку, а затем быстро поместите пропитанный парафином тканевый блок на дно формовочной коробки, охладите и затвердите.
   4. Закрепите встроенный восковой блок на микротоме, отрегулируйте стол для нарезки вверх и вниз в нужное положение, нажмите на лезвие, отрегулируйте масштаб и отрежьте ломтик толщиной 4 мкм. С помощью пинцета поместите ломтик в коробку, наполненную водой, чтобы развернуть ее (лицевой стороной вверх).
   5. Залатать и запечь ломтики. После того как восковой срез полностью развернется, приложите предметное стекло к восковому срезу под углом 135°, с помощью пинцета переместите восковой срез на предметное стекло, поднимите предметное стекло и при необходимости отрегулируйте положение воскового слияния. Поместите предметные стекла с установленными восковыми ломтиками на стол с постоянной температурой при температуре 47 °C на 1 минуту, чтобы снова дать ломтикам развернуться Когда ломтики станут полностью плоскими, поместите предметные стекла в инкубатор с температурой 62 °C на 1 час.
   6. Для депарафинизации дважды поместите запеченные предметные стекла в ксилол на 20 минут.
   7. Для регидратации поместите предметные стекла в серию с градуированным содержанием алкоголя для регидратации срезов легочной ткани: 100% спирт на 2 мин, 95% спирт на 1 мин, 90% спирт на 1 мин, 85% спирт на 1 мин, 75% спирт на 1 мин и дистиллированная вода на 3 мин.
   8. Окрашивайте срезы в гематоксилин в течение 5 мин. Дважды постирать в течение 1 минуты, затем поместить в 0,5% раствор соляной кислоты для дифференциации спирта на 5 секунд, дважды промыть водой в течение 1 минуты, поместить в раствор для окрашивания «Синь» на 8-10 секунд, дважды прополоскать водопроводной водой, и запачкать эозином в течение 30 секунд.
   9. Для обезвоживания и задержания поместите испачканные участки в 75% спирт на 1 мин, 85% спирт на 1 мин, 90% спирт на 1 мин, 95% спирт на 1 мин, 100% спирт на 1 мин, а затем дважды на 1 мин ксилол и удалите всю оставшуюся жидкость абсорбирующей бумагой.
   10. Для монтажа нанесите каплю нейтрального герметизирующего раствора на середину среза и установите покровное стекло.
5. Стандарт морфологической градации легочной ткани мыши
   1. Используя метод, описанный Ashcroft et al., попросите исследователя, ослепленного экспериментальной группой, случайным образом выбрать три микроскопических поля из каждого образца и наблюдать за степенью легочного фиброза при 100-кратном увеличении: степень 0, нормальное легкое; 1 степень, слегка отечные альвеолы, локализованный фиброз легкой степени; 2 степень, выраженный фиброз (толщина альвеолярной стенки более чем в три раза от нормы), с фиброзными очагами; 3 степень, сплошные участки фиброза (толщина альвеолярной стенки в три раза больше нормы); 4 степень, сращение фиброзных очагов, при этом фиброзная зона составляет менее 10% легочной ткани; 5 степени фиброзные очаги сросшиеся, площадь фиброза составляет от 10% до 50%, а альвеолярная структура значительно повреждена; 6 степень, большие сплошные фиброзные очаги (более 50% легочной ткани); 7 степень, альвеолярное пространство заполнено фиброзной тканью, присутствуют легочные буллы; 8 степень, полный фиброз.
   2. Назначьте балл, соответствующий оценке, каждому полю зрения (например, оценка 4 равна четырем баллам) и оцените каждую группу из шести образцов отдельно.

Результаты

Повреждение легких было вызвано распылением BLM, а контрольные животные были распылены тем же объемом нормального физиологического раствора. Мышей распыляли один раз в день в течение 3 дней по 30 минут в день, используя концентрацию BLM 7 Ед/мл. Мышей приносили в жертву на 9...

Обсуждение

Интратрахеальная инъекция блеомицина приводит к острой воспалительной и фиброзной реакции в обоих легких и может считаться эффективным подходом к созданию экспериментальной мышиной модели интерстициального заболевания легких человека. Интратрахеальное введение ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice