Ein Mausmodell der Lungenfibrose, die durch nasale Bleomycin-Vernebelung induziert wird

Zusammenfassung

Verschiedene Tiermodelle der Lungenfibrose wurden unter Verwendung von Bleomycin etabliert, um die Pathogenese der Lungenfibrose zu klären und neue Angriffspunkte für Medikamente zu finden. Die meisten Lungenfibrosemodelle, die auf Lungengewebe abzielen, weisen jedoch eine ungleichmäßige Medikamentenverabreichung auf. Hier schlagen wir ein Modell der uniformen Lungenfibrose vor, die durch nasale Bleomycin-Vernebelung induziert wird.

Zusammenfassung

Lungenfibrose ist charakteristisch für mehrere Lungenerkrankungen des Menschen, die aus verschiedenen Ursachen entstehen. Angesichts der Tatsache, dass die Behandlungsmöglichkeiten recht begrenzt sind, sind Mausmodelle nach wie vor ein wichtiges Instrument für die Entwicklung neuer antifibrotischer Strategien. In dieser Studie wird die intrapulmonale Verabreichung von Bleomycin (BLM) durch Nasenvernebelung durchgeführt, um ein Mausmodell der Lungenfibrose zu erstellen, das die klinischen Krankheitsmerkmale genau nachahmt. C57BL/6 Mäuse erhielten BLM (7 U/ml, 30 min/Tag) durch Nasenvernebelung an 3 aufeinanderfolgenden Tagen und wurden an Tag 9, 16 oder 23 getötet, um entzündliche und fibrotische Veränderungen im Lungengewebe zu beobachten. Nasale aerosolisierte BLM zielte direkt auf die Lunge ab, was zu einer weit verbreiteten und gleichmäßigen Lungenentzündung und Fibrose führte. Auf diese Weise ist es uns gelungen, ein experimentelles Mausmodell der typischen humanen Lungenfibrose zu generieren. Diese Methode könnte leicht verwendet werden, um die Auswirkungen der Verabreichung verschiedener nasaler Aerosole auf die Lungenpathophysiologie zu untersuchen und neue entzündungshemmende und antifibrotische Behandlungen zu validieren.

Einleitung

Lungenfibrose ist ein fortschreitender Krankheitsprozess, bei dem eine übermäßige Ablagerung von extrazellulären Matrixbestandteilen, vor allem Typ-I-Kollagen, im Interstitium der Lunge zu einer Beeinträchtigung der Lungenfunktion führt¹. Die Pathophysiologie der Lungenfibrose ist komplex, und die Behandlungsmöglichkeiten sind derzeit recht begrenzt. Mausmodelle sind nach wie vor ein wichtiges Instrument, um die pathogenen Mechanismen zu untersuchen, die zur Entstehung und zum Fortschreiten der Krankheit beitragen, sowie neue Strategien für die Arzneimittelentwicklung.

Eine Vielzahl von Tiermodellen der Lungenfibrose beruht auf der intratrachealen Instillation von BLM 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Die Verteilung der fibrotischen Veränderungen, die BLM in der Lunge verursacht, ist jedoch nicht gleichmäßig, und die Tiere sind während des Instillationsprozesses erstickungsgefährdet. Obwohl die intraperitoneale Injektion von BLM relativ gleichmäßige fibrotische Veränderungen in der Lunge induziert, erfordert sie aufgrund unzureichender Wirkstoffausrichtung mehrere Dosen. Die intratracheale Aerosolverabreichung über ein Laryngoskop erfordert keine Tracheotomie oder Punktion, und die resultierende Wirkstoffverteilung in der Lunge ist optimal. Die aerosolisierten Partikel sind jedoch groß (5-40 μm) und können daher nicht in den subpleuralen Bereich des Lungengewebes gelangen.

In dieser Studie erfolgt die intrapulmonale Verabreichung von BLM durch Nasenvernebelung. Während der Vernebelung atmeten die Mäuse spontan und inhalierten die Wirkstoffpartikel. Die aerosolisierten Partikel waren 2,5-4 μm groß, was es ihnen ermöglichte, sich nicht nur gleichmäßig in der Lunge zu verteilen, sondern auch den subpleuralen Bereich zu erreichen. Bei geringer Vergrößerung sind die wichtigsten histopathologischen Merkmale der Lunge bei Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF) die unterschiedlichen Schweregrade der Läsionen, die inkonsistente Verteilung, die abwechselnde Verteilung der verschiedenen Phasenläsionen und das Vorhandensein von interstitiellen Entzündungen, fibrotischen Läsionen und wabenförmigen Lungenveränderungen, die sich mit normalem Lungengewebe abwechseln. Diese pathologischen Veränderungen betreffen überwiegend das periphere subpleurale Parenchym oder das lobuläre Septum um die Bronchioli. Da dieser Ansatz es BLM-Partikeln ermöglicht, den subpleuralen Bereich der Lunge zu erreichen, simuliert dieses Modell die klinischen Merkmale der Krankheit beim Menschen genau.

Protokoll

Das Animal Studies Committee des China-Japan Friendship Hospital (Peking, China) genehmigte alle Eingriffe an Mäusen, die im Rahmen dieser Studie durchgeführt wurden (Nr. 190108). Die Mäuse wurden im sterilen Tierraum des China-Japan Friendship Clinical Medical Research Institute bei einer Raumtemperatur von 20-25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%-70%, einer Lichtintensität der Tiere von 15-20 LX und abwechselnd Hell und Dunkel für 12 h/12 h gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.

1. Mäuse

1. Stellen Sie sicher, dass alle Tiere 7 Tage lang an die Haltungseinrichtung gewöhnt sind, bevor sie vernebelt werden.
2. Verwenden Sie männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen zur Vernebelung.

2. Nasale Bleomycin-Vernebelung

1. Bleomycin Zubereitung
   ACHTUNG: BLM ist ein chemisches Gift, das Tumore abtötet, aber auch normale Zellen und normales Gewebe schädigen kann.
   1. Bereiten Sie die BLM-Lösung an einer sauberen Werkbank vor.
      1. Um die Arbeitskonzentration (7 U/ml) zu erhalten, resuspendieren Sie 15 U BLM-Hydrochlorid in 2,14 mL normaler Kochsalzlösung. Mischen Sie das resuspendierte BLM vorsichtig, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
   2. Die Arbeitslösung bei 4 °C oder auf Eis lagern und innerhalb von 1 Tag verbrauchen. Bringen Sie die BLM-Lösung vor der Vernebelung auf Raumtemperatur.
2. Anästhesie
   1. Bereiten Sie sich auf die Anästhesie vor, indem Sie 0,1 g Pentobarbital-Natrium in 10 ml normaler Kochsalzlösung auflösen. Lagern Sie die funktionierende Anästhesielösung an einem dunklen Ort bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 3 Tagen.
   2. Betäuben Sie die Mäuse, indem Sie das Pentobarbital-Natrium mit einer 1-ml-Spritze und einer 26-g-Nadel in einer Enddosis von 75 mg/kg Körpergewicht in den Bauch injizieren.
      HINWEIS: In dieser Studie reagierten die Mäuse mindestens 30 Minuten lang nicht auf diese Dosis. Passen Sie bei Bedarf die Dosis in Absprache mit dem Tierarzt an die Reaktion der Maus an.
   3. Nach einigen Minuten drücken Sie mit Zeigefinger und Daumen auf die Zehen der betäubten Maus, um sicherzustellen, dass der Gliedmaßen-Rückzugsreflex verschwunden ist.
3. Vorbereitung des Verneblungssystems
   1. Sichern Sie nach der Kalibrierung des Instruments die anästhesierte Maus mit einer weichen Netzabdeckung (Abbildung 1A), geben Sie die BLM-Arbeitslösung mit einer Pipette auf den oberen Zerstäubungskopf des Expositionsturms (Abbildung 1B) und lassen Sie den Vernebler 30 Minuten lang laufen, um eine stabile Zerstäubung zu erreichen.
      HINWEIS: Der Arbeitsablauf ist in Abbildung 1C,D dargestellt. Detaillierte Bedienungsschritte der Software finden Sie in den ergänzenden Abbildungen S1 und Ergänzende Abbildungen S2, die die Schritte 2.3.1.1 bis 2.3.1.9 veranschaulichen.
      1. Doppelklicken Sie auf das FlexiWare 8-Symbol (Ergänzende Abbildung S1A), klicken Sie auf Experimentiersitzung (Ergänzende Abbildung S1B) und klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Studie (Ergänzende Abbildung S1C).
      2. Bearbeiten Sie den Namen des Experiments (Ergänzende Abbildung S1D), und bearbeiten Sie den Titel und den Besitzer (Ergänzende Abbildung S1E).
      3. Wählen Sie die IX-4DIO-Vorlage (Ergänzende Abbildung S1F), geben Sie den Operator ein (Ergänzende Abbildung S1G), klicken Sie auf die Schaltfläche Bestätigen (Ergänzende Abbildung S1H) | Schaltfläche Weiter (Ergänzende Abbildung S1I).
      4. Wählen Sie die Pumpe aus und klicken Sie auf Weiter (Ergänzende Abbildung S1J) | Schaltfläche "Weiter " (Ergänzende Abbildung S2A) | Schaltfläche "Weiter " (Ergänzende Abbildung S2B) | Schaltfläche "Fertig stellen " (Ergänzende Abbildung S2C).
      5. Klicken Sie auf die Einstellungen für Continuous-1Lmin (drei Punkte, Supplemental Figure S2D) | DIO1, stellen Sie das Tastverhältnis (%) auf 25 % ein, und klicken Sie dann auf OK (Ergänzende Abbildung S2E).
      6. Klicken Sie auf DIO2, stellen Sie das Tastverhältnis (%) auf 25 % ein, und klicken Sie dann auf OK (Ergänzende Abbildung S2F).
      7. Klicken Sie auf DIO3, stellen Sie das Tastverhältnis (%) auf 25 % ein, und klicken Sie dann auf OK (Ergänzende Abbildung S2G).
      8. Klicken Sie auf DIO4, stellen Sie das Tastverhältnis (%) auf 25 % ein, und klicken Sie dann auf OK (Ergänzende Abbildung S2H).
      9. Klicken Sie auf die obere grüne Schaltfläche (links), um den Betrieb zu starten, und klicken Sie auf die rote Schaltfläche (rechts), um die Arbeit zu beenden. Klicken Sie auf das x in der oberen rechten Ecke, um den Vorgang zu beenden (Ergänzende Abbildung S2I).
   2. Zerstäuben Sie in der BLM-Gruppe jeweils 12 Mäuse, insgesamt viermal, bis zu insgesamt 48 Mäusen. Zerstäuben Sie jeweils sechs Mäuse in der normalen Kontrollgruppe mit normaler Kochsalzlösung.
4. Rückgewinnung von Tieren
   1. Bewegen Sie die Maus nach einer 30-minütigen Behandlung im Vernebler in einen Aufwachkäfig, der mit einem Heizkissen ausgestattet ist.
   2. Beobachten Sie die Mäuse, bis sie bei vollem Bewusstsein sind.
   3. Sobald bestätigt wurde, dass sich die Maus in einem guten Zustand befindet, was bedeutet, dass sie sich frei bewegen kann, bringen Sie sie in ihren ursprünglichen Käfig zurück. Legen Sie es nicht zu anderen Tieren, bis es sich vollständig erholt hat.
   4. Überprüfen Sie die physiologischen Indizes, einschließlich Atemfrequenz, Überleben und Symptome, zweimal während der 24 Stunden nach der Behandlung mit BLM.

3. Verarbeitung des Lungengewebes

1. 9, 16 und 23 Tage nach der BLM-Verabreichung opfern Sie sechs Mäuse, indem Sie ihnen Pentobarbital-Natrium in den Bauch injizieren (Enddosis 100 mg/kg Körpergewicht).
2. Entfernen Sie die Luftröhre und die Lunge und spülen Sie sie sofort mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus.
3. Fixieren Sie die linke Lunge 24 h lang in 10% neutralem Formalinpuffer, bevor Sie Paraffin einbetten.
4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E-Färbung)
   1. Dehydrieren Sie das fixierte Lungengewebe in einem Dörrgerät.
   2. Legen Sie den dehydrierten Lungengewebeblock für 1 h bei 56 °C in eine Wachsauflösungsbox.
   3. Gießen Sie zum Einbetten das geschmolzene Paraffin in den Formkasten und legen Sie dann den mit Paraffin imprägnierten Gewebeblock schnell auf den Boden des Formkastens, kühlen Sie es ab und verfestigen Sie es.
   4. Fixieren Sie den eingebetteten Wachsblock auf dem Mikrotom, stellen Sie den Schneidetisch auf und ab in eine geeignete Position, drücken Sie die Klinge, stellen Sie die Skala ein und schneiden Sie eine Scheibe mit einer Dicke von 4 μm. Lege die Scheibe mit einer Pinzette in eine mit Wasser gefüllte Displaybox, um sie abzurollen (mit der Vorderseite nach oben).
   5. Die Scheiben flicken und backen. Nachdem sich die Wachsscheibe vollständig entrollt hat, legen Sie den Objektträger in einem Winkel von 135° gegen die Wachsscheibe, schieben Sie die Wachsscheibe mit einer Pinzette auf den Objektträger, heben Sie den Objektträger an und passen Sie die Position der Wachsscheibe nach Bedarf an. Legen Sie die Objektträger mit den montierten Wachsscheiben 1 Minute lang bei konstanter Temperatur bei 47 °C auf einen Tisch mit konstanter Temperatur, damit sich die Scheiben wieder abrollen können. Sobald die Scheiben vollständig flach sind, legen Sie die Objektträger für 1 h in einen 62 °C heißen Inkubator.
   6. Zum Entparaffinieren die gebackenen Objektträger zweimal 20 min in Xylol legen.
   7. Legen Sie die Objektträger zur Rehydrierung in eine abgestufte Alkoholserie, um die Lungengewebescheiben zu rehydrieren: 100 % Alkohol für 2 Minuten, 95 % Alkohol für 1 Minute, 90 % Alkohol für 1 Minute, 85 % Alkohol für 1 Minute, 75 % Alkohol für 1 Minute und destilliertes Wasser für 3 Minuten.
   8. Färben Sie die Abschnitte 5 Minuten lang mit Hämatoxylin. Zweimal 1 min waschen, dann 5 s in eine 0,5%ige Salzsäurealkohol-Differenzierungslösung legen, zweimal 1 min mit Wasser waschen, 8-10 s in blaue Färbelösung legen, zweimal mit Leitungswasser spülen und 30 s mit Eosin färben.
   9. Zur Dehydrierung und Entfärbung legen Sie die befleckten Abschnitte 1 Minute lang in 75 % Alkohol, 1 Minute lang 85 % Alkohol, 1 Minute lang 90 % Alkohol, 1 Minute lang 95 % Alkohol, 1 Minute lang 100 % Alkohol und dann zweimal 1 Minute lang Xylol und entfernen Sie die restliche Flüssigkeit mit saugfähigem Papier.
   10. Für die Montage einen Tropfen neutrale Gummidichtungslösung in die Mitte der Scheibe geben und ein Deckglas anbringen.
5. Morphologischer Einstufungsstandard für Lungengewebe von Mäusen
   1. Unter Verwendung der von Ashcroft et al. beschriebenen Methode lassen Sie einen Untersucher, der für die Versuchsgruppe verblindet ist, nach dem Zufallsprinzip drei mikroskopische Felder aus jeder Probe auswählen und den Grad der Lungenfibrose bei 100-facher Vergrößerung beobachten: Grad 0, normale Lunge; Grad 1, leicht geschwollene Alveolen, lokalisierte leichte Fibrose; Grad 2, ausgeprägte Fibrose (Dicke der Alveolarwand größer als das Dreifache des Normalwerts), mit fibrösen Herden; Grad 3, kontinuierliche Bereiche der Fibrose (Dicke der Alveolarwand dreimal größer als normal); Grad 4, Fusion von fibrösen Herden, wobei der fibrotische Bereich weniger als 10 % des Lungengewebes ausmacht; Grad 5, die fibrösen Herde sind verschmolzen, der Fibrosebereich beträgt 10% bis 50% und die Alveolarstruktur ist erheblich geschädigt; Grad 6, große zusammenhängende fibröse Herde (mehr als 50 % des Lungengewebes); Grad 7, der Alveolarraum ist mit fibrösem Gewebe gefüllt, Lungenbullen sind vorhanden; Grad 8, vollständige Fibrose.
   2. Weisen Sie jedem Sichtfeld eine Punktzahl zu, die der Note entspricht (z. B. Note 4 entspricht vier Punkten), und bewerten Sie jede Gruppe von sechs Stichproben separat.

Ergebnisse

Die Lungenschädigung wurde durch vernebeltes BLM induziert, und die Kontrolltiere wurden mit dem gleichen Volumen normaler Kochsalzlösung vernebelt. Die Mäuse wurden 3 Tage lang einmal täglich zu 30 Minuten pro Tag mit einer BLM-Konzentration von 7 U/ml vernebelt. Mäuse wurden an den Tagen 9, 16 und 23 nach BLM-Verabreichung zur H&E-Färbung getötet (Abbildung 2B). Diffuse pneumonische Läsionen mit Verlust der normalen Alveolararchitektur, Septumverdickung, vergr?...

Diskussion

Die intratracheale Injektion von Bleomycin führt zu einer akuten entzündlichen und fibrotischen Reaktion in beiden Lungen und kann als wirksamer Ansatz zur Etablierung eines experimentellen Mausmodells der interstitiellen Lungenerkrankung beim Menschen angesehen werden. Die intratracheale Verabreichung ist der am häufigsten verwendete Verabreichungsweg 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
bleomycin	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	Fibrosis model drugs
0.9% saline for injection	Baxter Healthcare(Tianjin)Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
1 mL syringe	BD	300481	Anesthetize animals
10% neutral formalin buffer	TechaLab Biotech Company		Fix lung tissue
15 mL centrifuge tube	corning	430790	Prepare for anesthesia
20 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
4 °C refrigerator	New-fly group	BCD-213K	Store drugs
Adobe illustrator cc2020	Adobe		Process images
blue back liquid	Beijing Chemical Works		tissue staining
clean bench	Suzhou Sujie Purifying Equipment Co.,Ltd.		Bleomycin preparation
differentiation fluid	Beijing Chemical Works		tissue staining
Electronic balance	METTLER TOLEDO	AA-160	Prepare for anesthesia
eosin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
Heating pad	HIDOM		Mice incubation
hematoxylin stain	Beijing Yili Fine Chemicals Co,Ltd.		tissue staining
phosphate buffered saline (PBS) buffer	Hyclone	SH30256.01	Clean lung tissue
Photoshop drawing software	Adobe		Process images
SCIREQ INEXPOSE	EMKA Biotech Beijing Co.,Ltd.		Atomizing device
Upright fluorescence microscope	Olympus	BX53	Observe the slice