تحضير الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي من الخلايا الأولية والمستزرعة

Summary

يقدم البروتوكول الحالي طريقة فعالة ومرنة لعزل الحمض النووي الريبي من الكسور النووية والسيتوبلازمية باستخدام الخلايا المستزرعة ، ثم التحقق من صحتها باستخدام qPCR. هذا يعمل بشكل فعال كبديل لمجموعات إعداد الحمض النووي الريبي الأخرى.

Abstract

كان فصل المكونات داخل الخلايا أداة رئيسية في البيولوجيا الخلوية لسنوات عديدة حتى الآن وتمكن من توفير نظرة ثاقبة مفيدة حول كيفية تأثير موقعها على وظيفتها. على وجه الخصوص ، أصبح فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي مهما في سياق الخلايا السرطانية والسعي لإيجاد أهداف جديدة للأدوية. يمكن أن يكون شراء مجموعات لاستخراج الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي النووي مكلفا عندما يمكن العثور على العديد من المواد المطلوبة في بيئة معملية نموذجية. باستخدام الطريقة الحالية ، التي يمكن أن تحل محل مجموعات أكثر تكلفة أو غيرها من العمليات التي تستغرق وقتا طويلا ، لا يلزم سوى مخزن مؤقت محلي الصنع ، وأجهزة طرد مركزي على الطاولة ، وأعمدة تنقية عزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي. يستخدم المخزن المؤقت للتحلل لتحلل الغشاء الخارجي للخلية برفق دون التأثير على سلامة الغلاف النووي ، مما يسمح بإطلاق مكوناته داخل الخلايا. بعد ذلك، يمكن عزل النوى عن طريق خطوة طرد مركزي بسيطة؛ لأنها تحتوي على كثافة أعلى من محلول التحلل. يستخدم الطرد المركزي لفصل هذه المناطق بناء على اختلافات كثافتها لعزل العناصر تحت الخلوية في النواة عن تلك الموجودة في السيتوبلازم. بمجرد أن يقوم الطرد المركزي بعزل المكونات المختلفة ، يتم استخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي لتنقية محتوى الحمض النووي الريبي ، ويتم إجراء qPCR للتحقق من جودة الفصل ، ويتم تحديدها كميا بكمية الحمض النووي الريبي والسيتوبلازمي في الأجزاء المختلفة. تم تحقيق مستويات ذات دلالة إحصائية من الفصل ، مما يوضح فعالية البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذا النظام لعزل أنواع مختلفة من الحمض النووي الريبي (الكلي ، الحمض النووي الريبي الصغير ، إلخ) ، مما يسمح بالدراسة المستهدفة لتفاعلات السيتوبلازم والنواة ، ويساعد في فهم الاختلافات في وظيفة الحمض النووي الريبي الموجودة في النواة والسيتوبلازم.

Introduction

يسمح التجزئة الخلوية إلى مكونات دون خلوية بعزل ودراسة المجالات البيوكيميائية المحددة ويساعد في تحديد توطين عمليات خلوية محددة وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على وظيفتها¹. يمكن أن يسمح عزل الحمض النووي الريبي من مواقع مختلفة داخل الخلايا بتحسين دقة التحليل الجيني والكيميائي الحيوي لأحداث مستوى النسخ والتفاعلات الأخرى بين النواة والسيتوبلازم ، والتي تعمل كغرض أساسي للبروتوكول^{الحالي 2}. تم تطوير هذا البروتوكول لضمان عزل الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي والنووي لتحديد دور كل منهما في التصدير النووي وفهم كيفية تأثير توطين الحمض النووي الريبي تحت الخلوي في النواة والسيتوبلازم على وظيفتها في العمليات الخلوية. وباستخدام مواد من بيئة مختبرية نموذجية، كان من الممكن تحقيق التجزئة النووية والسيتوبلازمية على نحو أكثر فعالية وأقل تكلفة من البروتوكولات الموضوعة سابقا دون المساس بجودة النتائج³.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دراسة تبادل الجزيئات بين السيتوبلازم والنواة مباشرة عن طريق فصل هذه المناطق. وبشكل أكثر تحديدا ، يعد فهم النسخ أمرا ضروريا لفهم التطور والمرض. ومع ذلك ، قد تكون الحمض النووي الريبي عند مستويات نضج مختلفة في أي وقت ويمكن أن تعقد تحليل المصب. يسمح هذا البروتوكول بالقدرة على عزل الحمض النووي الريبي من الكسور تحت الخلوية النووية والسيتوبلازمية ، والتي يمكن أن تساعد في دراسات الحمض النووي الريبي وتسمح بفهم أفضل لحمض نووي ريبوزي معين ذي أهمية ، مثل توطين الحمض النووي الريبي غير المشفر أو تحليل تقاطعات لصق داخل النواة.

تم تحسين هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي الطويل السيتوبلازمي والنووي ، بما في ذلك mRNAs و rRNAs و RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) ، نظرا لانتقائية حجم عمود تنقية الحمض النووي الريبي المستخدم ، والذي يمكن تعديله لعزل الحمض النووي الريبي الآخر ذي الأهمية. في السابق ، كانت وظيفة الحمض النووي الريبي الطويل ، مثل mRNAs و lncRNAs ، تعتمد بشكل كبير على توطين كل منها داخل الخلية ^4,5. لذلك ، أصبحت دراسة التصدير من النواة إلى المجالات دون الخلوية أكثر استهدافا لفهم الدور الذي يمكن أن يلعبه تصدير الحمض النووي الريبي أو المكونات الخلوية الأخرى على الخلية. تعمل lncRNAs كمثال رئيسي على ذلك ، حيث تعتمد ترجمتها وآثارها اللاحقة إلى حد كبير على القرب والتفاعلات مع أشكال أخرى من RNA⁶. علاوة على ذلك ، يرتبط تبادل العناصر الخلوية بين المناطق النووية والسيتوبلازمية بآليات المقاومة لمختلف علاجات السرطان⁷. سمح عزل المقصورات داخل الخلايا بتطوير مثبطات التصدير النووي ، مما قلل من آثار آليات المقاومة للعلاجات المختلفة⁸.

بعد فصل الحمض النووي الريبي النووي والسيتوبلازمي ، يتم تنفيذ خطوات لتنقية الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. نظرا لأن مجموعات تنقية الحمض النووي الريبي توجد بشكل شائع داخل المختبرات وتعمل على تنقية وعزل الحمض النووي الريبي الطويل ، فإنها تخدم الغرض من هذا البروتوكول جيدا. لتنقية الحمض النووي الريبي ، يعد توليد نسب 260: 280 أكبر من 1.8 أمرا بالغ الأهمية لضمان جودة العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي أو غيرها من الإجراءات المماثلة التي تتطلب مستويات عالية من النقاء والعزل. تشير القيم غير المنتظمة 260: 280 إلى تلوث الفينول ، مما يدل على ضعف العزل ويؤدي إلى نتائج غير دقيقة⁹.

بمجرد اكتمال تنقية الحمض النووي الريبي وتأكيد أن قيم 260: 280 أعلى من النطاق المقبول ، تم استخدام qPCR للتحقق من صحة نتائج عزل الكسور النووية والسيتوبلازمية. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذا البروتوكول ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كعلامات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي¹⁰. معا ، فإنها تسمح بإظهار مستويات عالية من التجزئة النووية مع MALAT1 ، في حين من المتوقع أن تكون التجزئة السيتوبلازمية منخفضة. على العكس من ذلك ، عند استخدام TUG1 ، من المتوقع أن تكون مستويات التجزئة السيتوبلازمية أعلى من مستويات التجزئة النووية.

باستخدام هذا البروتوكول ، كان من الممكن عزل الحمض النووي الريبي بناء على موقع عملها داخل الخلية. نظرا للوصول الواسع النطاق إلى العديد من المواد واستخدام المخزن المؤقت للتحلل فقط وتقنيات الطرد المركزي القائمة على الكثافة خلال هذه التجربة ، فإن قابلية التطبيق على أنواع الحمض النووي الريبي الأخرى والمكونات الخلوية الأخرى منتشرة على نطاق واسع. يمكن أن يوفر هذا معلومات مهمة من خلال تسليط الضوء على أحداث التعبير الخاصة بالموقع والتي لا يمكن تمييزها بدون فصل.

Protocol

تستخدم خلايا K562 في الدراسة الحالية. تم تحسين هذا البروتوكول للعمل مع 1 × 10 6-5 × 10⁶ مليون خلية. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق الإجراء لكميات أكبر من الخلايا عن طريق زيادة الأحجام بشكل مناسب.

1. إعداد المخزن المؤقت 0.25x تحلل

1. قم بإعداد محلول تحلل 0.25x عن طريق خلط المكونات التالية الواردة في الجدول 1 أ.
   ملاحظة: تتطلب العينات حوالي 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 0.25x. الحجم الموصى به = عدد العينات × 300 ميكرولتر.

2. فصل الكسور النووية والسيتوبلازمية

1. قم بتكوير الخلايا باستخدام أنابيب سعة 1.5 مل عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 × جم (درجة حرارة الغرفة). تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة شفط.
   ملاحظة: تم استخدام خلايا K562 خلال هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول مع خطوط الخلايا المختلفة.
2. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من محلول تحلل الثلج البارد 0.25x.
   ملاحظة: الحفاظ على الجليد لمدة 2 دقيقة وتدوير الأنبوب كل 45 ثانية لضمان تحلل الخلايا بشكل صحيح.
3. قم بتدوير الأنابيب بأعلى سرعة (12000 × جم) عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة.
4. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ووضعها في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. سيكون هذا هو الجزء السيتوبلازمي. سيتم تحقيق ما يقرب من 300 ميكرولتر من الجزء السيتوبلازمي.
5. الحبيبات المتبقية ستكون الجزء النووي. أضف 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد إلى الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، تتم إزالة الحمض النووي الزائد.

3. تنظيف الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي

ملاحظة: تم تحقيق هذا البروتوكول باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).

1. فصل عينات الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي وعينات السيتوبلازم النووي (حيث تختلف خطوات التجزئة بينهما).
   1. لفصل الكسر السيتوبلازمي ، أضف 1050 ميكرولتر من محلول تحلل RLT 3.5x (انظر جدول المواد) والدوامة لفترة وجيزة. ثم أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 90٪ وقم بتحميله على العمود من مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يجب خلط المحلول جيدا قبل التحميل على العمود.
   2. لفصل الجزء النووي ، أضف 600 ميكرولتر من 3.5x محلول التحلل والدوامة. ثم أضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
2. قم بتحميل كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية على أعمدة الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: بالنسبة لبقية الخطوة 3 ، تتبع كل من العينات السيتوبلازمية والنووية نفس الإجراء. ومع ذلك ، تأكد من أن هذه العينات تظل مستقلة عن بعضها البعض.
   1. قم بتحميل كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية على أعمدة الحمض النووي الريبي وقم بتدويرها لمدة 30 ثانية عند 8000 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من التدفق الزائد من خلاله.
   2. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل من مجموعة تنقية متاحة تجاريا (مخزن مؤقت RW1 ، انظر جدول المواد) ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله.
   3. أضف محلول DNAse (1U / uL) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله.
   4. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المعتدل (RPE ، انظر جدول المواد) ، وقم بتدويره مرة أخرى ، وتجاهل التدفق من خلاله. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المعتدل ، وقم بتدويره مرة أخرى ، ولكن لمدة 2 دقيقة فقط.
   5. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 1.5 مل وأضف 30 ميكرولتر من الماء إلى عمود الدوران. دع العمود يجلس لمدة 1 دقيقة قبل الدوران.

4. التحقق من صحة الفصل النووي السيتوبلازمي

1. أداء تخليق cDNA
   1. بمجرد استخراج وتنقية الأجزاء تحت الخلوية من الحمض النووي الريبي ، تأكد من فصل المقصورات باستخدام qPCR. للقيام بذلك ، أولا ، قم بتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   2. تحضير ماستر النسخ العكسي. إضافة قالب الحمض النووي الريبي. احتضان ردود الفعل في دورة حرارية.
      ملاحظة: بالنسبة للسداسيات العشوائية ، يتم توفير معلمات الدورة المستخدمة في الجدول 2A. استخدم تفاعل النسخ العكسي على الفور أو خزنه عند -20 درجة مئوية (الجدول 1 ب).
2. إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) والتحليل.
   1. قم بتخفيف تخليق cDNA بماء DEPC (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز نهائي قدره 20 نانوغرام / مل.
   2. باستخدام مزيج رئيسي من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد التفاعل لكل عينة باستخدام التعليمات اليدوية كما هو موضح أدناه.
   3. الحصول على المجسات التجارية اللازمة للكشف عن التجزئة السيتوبلازمية والنووية. استخدم MALAT1 كعلامة نووية و TUG1 كعلامة السيتوبلازمية (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: ترد في الجدول 3 تسلسلات MALAT1 و TUG1.
   4. احسب حجم كل مكون بضرب كل مكون في 3 لكل من النسخ المتماثلة التقنية للعينة الفردية.
   5. لكل عينة نووية وسيتوبلازمية ، احصل على الخلطات التالية لكل منها: (أ) جزء نووي مع MALAT1 ، (ب) جزء سيتوبلازمي مع MALAT1 ، (ج) جزء نووي مع TUG1 ، و (د) جزء سيتوبلازمي مع TUG1 (الجدول 1C).
   6. دوامة لفترة وجيزة لخلط المحاليل ونقل 20 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من لوحة التفاعل البصري (انظر جدول المواد).
   7. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف يستخدم في qPCR (انظر جدول المواد) وطرد مركزي للوحة لفترة وجيزة للتخلص من فقاعات الهواء ، ثم قم بتدوير العينة لأسفل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   8. باستخدام برنامج التصميم والتحليل (انظر جدول المواد) ، حدد المنحنى القياسي لمعلمات ركوب الدراجات (الجدول 2B).
   9. باستخدام برنامج qPCR ، حدد إعداد التشغيل (الشكل التكميلي 1).
   10. في صفحة خصائص ملف البيانات ، حدد معلمات الطريقة ودورة الإدخال من الجدول 2B (الشكل التكميلي 2).
   11. بعد إدخال معلمات الدورة ، حدد علامة التبويب Plate ، وأدخل العينات المراد تشغيلها (الشكل التكميلي 3). حدد بدء التشغيل.
       ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات الموضحة في جهاز qPCR باستخدام مزيج رئيسي متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
3. إجراء تحليل البيانات
   1. بعد اكتمال التشغيل، قم بإنشاء جدول بيانات باسم العينة واسم الهدف ودورة القياس الكمي (Cq) (الجدول التكميلي 1).
   2. ابدأ بعينات MALAT1 لحساب الكسر النووي. اطرح الجزء السيتوبلازمي MALAT1 من الجزء النووي MALAT1 (الجدول 4).
   3. ثم احسب ΔCq (2 ^ (-value)) (الجدول 5).
   4. استمر في عينات MALAT1 لحساب الكسر السيتوبلازمي ، واطرح الجزء النووي MALAT1 من الكسر السيتوبلازمي MALAT1 ، ثم احسب ΔCq (2 ^ (-value)) (الجدول 6).
      ملاحظة: بالنظر إلى ΔCq ، لوحظ أن جزء MALAT1 النووي (تسليط الضوء الأخضر) له علامة MALAT1 أكبر من السيتوبلازم (تسليط الضوء الأحمر) ، ولكن الآن مطلوب تأكيد للتأكد من أن الجزء السيتوبلازمي هو في الغالب السيتوبلازم وأن الجزء النووي لا يحتوي على تلوث السيتوبلازم.
   5. باستخدام عينات TUG1، قم بإجراء نفس العملية الحسابية المذكورة أعلاه (الخطوات 4.3.2-4.3.4) (الجدول 7).
      ملاحظة: بالنظر إلى ΔCq ، لوحظ أن جزء TUG1 السيتوبلازمي (تسليط الضوء الأخضر) له علامة TUG1 أكبر من الجزء النووي (تسليط الضوء الأحمر) ، مما يؤكد الفصل الجيد للكسور السيتوبلازمية والنووية (الجدول 8 ، الشكل 1).

النتائج

لضمان تحقيق العزل النووي والسيتوبلازمي ، تم إجراء qPCR للتحقق من صحة النتائج. عند القيام بذلك ، تم استخدام الاشعال الخاصة بالمنطقة ذات الاهتمام لإثبات مستويات التجزئة النووية والسيتوبلازمية. في هذه الدراسة ، تم استخدام MALAT1 و TUG1 كبادئات نووية وسيتوبلازمية ، على التوالي. معا ، فإنها تسمح بإظ?...

Discussion

في جميع أنحاء البروتوكول ، تم اتخاذ بعض الخطوات لتحسين العناصر لتكون أكثر فعالية لخط اهتمام الخلية. في حين أن الخطوات داخل البروتوكول واضحة نسبيا ، فقد يكون من الضروري إجراء تحليل وتعديلات طفيفة خلال الجوانب الحرجة للبروتوكول. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تعديل تركيز المخزن المؤ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.