初代細胞および培養細胞からの細胞質および核長鎖RNAの調製

要約

本プロトコルは、培養細胞を用いて核および細胞質画分からRNAを単離し、qPCRを用いて検証するための効率的で柔軟な方法を提供します。これは、他のRNA調製キットの代替品として効果的に機能します。

要約

細胞内成分の分離は、長年にわたって細胞生物学の重要なツールであり、それらの位置がそれらの機能にどのように影響するかについての有用な洞察を提供することができました。特に、核RNAと細胞質RNAの分離は、癌細胞の文脈や薬物の新しい標的の探求において重要になっています。核細胞質RNA抽出用のキットの購入は、必要な材料の多くが一般的なラボ環境で見つかる場合、コストがかかる可能性があります。より高価なキットやその他の時間のかかるプロセスを置き換えることができる現在の方法を使用する場合、核および細胞質RNAを単離するために必要なのは、自家製の溶解バッファー、ベンチトップ遠心分離機、およびRNA単離精製カラムのみです。溶解バッファーは、核膜の完全性に影響を与えることなく細胞の外膜を穏やかに溶解するために使用され、細胞内成分を放出することができます。次いで、核は溶解溶液よりも高い密度を有するので、単純な遠心分離工程によって単離することができる。遠心分離を利用して、密度の違いに基づいてこれらの領域を分離し、核内の細胞内要素を細胞質内の細胞内要素から分離します。遠心分離でさまざまな成分が単離されたら、RNAクリーンアップキットを使用してRNA含有量を精製し、qPCRを実行して分離品質を検証し、さまざまな画分中の核および細胞質RNAの量で定量します。統計的に有意なレベルの分離が達成され、プロトコルの有効性が示されました。さらに、このシステムは、さまざまな種類のRNA(総RNA、低分子RNAなど)の単離に適応できるため、細胞質と核の相互作用を標的に研究することができ、核と細胞質に存在するRNAの機能の違いを理解するのに役立ちます。

概要

細胞内成分への細胞分画は、定義された生化学的ドメインの単離と研究を可能にし、特定の細胞プロセスの局在とこれがそれらの機能にどのように影響するかを決定するのに役立ちます¹。異なる細胞内位置からのRNAの単離は、転写レベルイベントおよび核と細胞質間の他の相互作用の遺伝的および生化学的分析の精度を向上させることができ、これは現在のプロトコル²の主な目的として機能します。このプロトコルは、細胞質RNAと核RNAを確実に分離して、核輸送におけるそれぞれの役割を決定し、核および細胞質内のRNAの細胞内局在が細胞プロセスにおけるそれらの機能にどのように影響するかを理解するために開発されました。典型的な実験室環境からの材料を使用して、結果の質を損なうことなく、以前に確立されたプロトコルよりも効果的かつ安価に核および細胞質分画を達成することができました³。

さらに、細胞質と核との間の分子の交換は、これらの領域を分離することによって直接研究することができる。具体的には、トランスクリプトームの理解は、発生や疾患を理解するために不可欠です。ただし、RNAはいつでも異なる成熟レベルにある可能性があり、ダウンストリーム分析を複雑にする可能性があります。このプロトコルにより、核および細胞質細胞内画分からRNAを単離することができ、RNAの研究に役立ち、ノンコーディングRNAの局在化や核内のスプライス接合部の分析など、関心のある特定のRNAをよりよく理解することができます。

このプロトコルは、mRNA、rRNA、および長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)を含む細胞質および核長鎖RNAの単離に最適化されており、利用されるRNA精製カラムのサイズ選択性により、目的の他のRNAを単離するために変更することができます。以前は、mRNAやlncRNAなどの長鎖RNAの機能は、細胞内でのそれぞれの局在に大きく依存していました^4,5。したがって、核から細胞内ドメインへの輸出の研究は、RNAまたは他の細胞成分の輸出が細胞に与えることができる役割を理解することに向けられています。lncRNAは、その翻訳とその後の効果が他の形態の^RNA6との近接性と相互作用に大きく依存するため、この代表的な例として機能します。さらに、核領域と細胞質領域間の細胞要素の交換は、さまざまな癌治療に対する耐性メカニズムに関連しています⁷。細胞内コンパートメントの単離により、核輸送阻害剤の開発が可能になり、さまざまな治療法に対する耐性メカニズムの影響が減少しました⁸。

核RNAおよび細胞質RNAを分離した後、目的のRNAを精製するステップが実行される。RNA精製キットは実験室で一般的に見られ、長いRNAを精製および分離するために機能するため、このプロトコルの目的を十分に果たします。RNA精製では、1.8を超える260:280の比率を生成することが、RNAシーケンシングまたは高レベルの純度と単離を必要とするその他の同様の手順のサンプルの品質を確保するために重要です。不規則な260:280の値はフェノール汚染を示し、分離性が不十分で不正確な結果をもたらします⁹。

RNA精製が完了し、260:280の値が許容範囲を超えていることが確認されたら、qPCRを利用して核画分と細胞質画分の単離結果を検証しました。その際、関心領域に特異的なプライマーを使用して、核および細胞質分画レベルを実証しました。このプロトコルでは、MALAT1およびTUG1がそれぞれ核マーカーおよび細胞質マーカーとして使用された¹⁰。これらを組み合わせることで、MALAT1による高レベルの核分画の実証が可能になりますが、細胞質分画は低いと予想されます。逆に、TUG1を使用した場合、細胞質分画レベルは核分画レベルよりも高くなると予想されます。

このプロトコルを利用することで、細胞内での作用位置に基づいてRNAを単離することが可能であった。この実験では、多くの材料への広範なアクセスと溶解バッファーおよび密度ベースの遠心分離技術のみの利用により、他のRNAタイプおよび他の細胞成分への適用性が広まっています。これは、分離しなければ区別できない場所固有の発現イベントに光を当てることによって重要な情報を提供することができます。

プロトコル

K562細胞は本研究に使用されます。このプロトコルは、1 x 10^6-5 x 10⁶⁰⁰ 万セルで動作するように最適化されています。ただし、この手順は、容量を適切に増やすことで、より大きなセル量に合わせてスケールアップできます。

1. 0.25倍溶解バッファーの調製

1. 表1Aに示す以下の成分を混合することにより、0.25倍の溶解バッファーを調製した。
   注:サンプルには約300 μLの0.25倍溶解バッファーが必要です。推奨容量 = サンプル数 x 300 μL。

2.核画分と細胞質画分の分離

1. 1.5 mLチューブを使用して、2000 x g(室温)で5分間遠心分離して細胞をペレット化します。吸引ピペットを使用して上清を廃棄する。
   注:K562細胞は、このプロトコル中に利用されました。しかしながら、このプロトコルは様々な細胞株に適合させることができる。
2. ペレットを300 μLの氷冷0.25倍溶解バッファーに再懸濁します。
   注意: 氷上で2分間保ち、45秒ごとにチューブを回転させて、細胞が適切に溶解するようにします。
3. チューブを最高速度(12,000 x g)で4°Cで2分間回転させます。
4. 遠心分離後、上清を注意深く取り出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。これが細胞質画分になります。約300μLの細胞質画分が得られます。
5. 残りのペレットは核画分になります。500 μLの氷冷PBSをペレットに加え、室温で2,000 x g で5分間遠心分離します。
   注:このステップでは、余分なDNAが除去されます。

3. RNA精製キットを用いたRNAクリーンアップ

注:このプロトコルは、市販のRNA精製キットを使用して達成されました( 材料の表を参照)。

1. 細胞質RNAサンプルと核細胞質サンプルを分離します(分画ステップはそれらの間で異なるため)。
   1. 細胞質画分を分離するには、1,050 μLの3.5x RLT溶解バッファー( 材料表を参照)を加え、短時間ボルテックスします。次に、750 μLの90%エタノールを加え、RNAクリーンアップキットからカラムにロードします。
      注:カラムにロードする前に、溶液を十分に混合する必要があります。
   2. 核画分を分離するには、600 μLの3.5倍溶解バッファーとボルテックスを加えます。次に、600μLの70%エタノールを加える。
2. 細胞質画分と核画分の両方をRNAカラムにロードします(材料表を参照)。
   注:ステップ3の残りの部分では、細胞質サンプルと核サンプルの両方が同じ手順に従います。ただし、これらのサンプルが互いに独立していることを確認してください。
   1. 細胞質画分と核画分の両方をRNAカラムにロードし、室温で8,000 x g で30秒間スピンします。余分な流れを捨てます。
   2. 市販の精製キットから350 μLの洗浄バッファー(RW1バッファー、 材料表を参照)を加え、再度スピンさせて、フロースルーを破棄します。
   3. DNAse溶液(1U/uL)を室温で15分間加えます。次に、350 μLの洗浄バッファーを追加し、再度回転させて、フロースルーを破棄します。
   4. 500 μLのマイルドな洗浄バッファー(RPE、 材料表を参照)を加え、再度回転させて、フロースルーを破棄します。500 μLのマイルドな洗浄バッファーを加え、再度スピンさせますが、2分間のみです。
   5. カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移動し、30 μLの水をスピンカラムに加えます。スピンダウンする前に、カラムを1分間放置します。

4. 核-細胞質分離の検証

1. cDNA合成を行う
   1. RNAの細胞内コンパートメントが抽出および精製されたら、qPCRを使用してコンパートメントの分離を確認します。これを行うには、まず、製造元の指示に従って市販のキットを使用してRNAをcDNAに変換します( 材料表を参照)。
   2. 逆転写酵素マスターミックスを調製します。テンプレートRNAを追加します。サーモサイクラーで反応をインキュベートします。
      注:ランダムヘキサマーの場合、使用されるサイクリングパラメータを 表2Aに示します。逆転写酵素反応を直ちに使用するか、-20°Cで保存してください(表1B)。
2. 定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)および分析を行う。
   1. cDNA合成をDEPC水( 材料の表を参照)で希釈して、最終濃度を20 ng/mLにします。
   2. PCRマスターミックスを使用して、以下にリストされている手動の指示を使用して各サンプルの反応を準備します。
   3. 細胞質および核分画の検出に必要な市販のプローブを入手します。核マーカーとしてMALAT1を使用し、細胞質マーカーとしてTUG1を使用します( 材料の表を参照)。
      注: MALAT1 および TUG1 の配列を 表 3 に示します。
   4. 個々のサンプルのテクニカル反復ごとに各成分に3を掛けて、各成分の体積を計算します。
   5. 核および細胞質サンプルごとに、それぞれについて次のミックスを取得します:(a)MALAT1を含む核画分、(b)MALAT1を含む細胞質画分、(c)TUG1を含む核画分、および(d)TUG1を含む細胞質画分(表1C)。
   6. 溶液を短時間ボルテックスして混合し、20 μLの混合物を光学反応プレートの各ウェルに移します( 材料の表を参照)。
   7. qPCRに使用される透明な接着フィルム( 材料の表を参照)でプレートを覆い、プレートを短時間遠心分離して気泡を除去してから、サンプルを300 x g で室温で5分間回転させます。
   8. 設計および解析ソフトウェア(材料表を参照 )を使用して、サイクルパラメータの検量線を選択します(表2B)。
   9. qPCRソフトウェアを使用して、 実行のセットアップ を選択します(補足図1)。
   10. [データ ファイルのプロパティ] ページで、表 2B から [メソッドと入力サイクルのパラメーター] を選択します (補足図 2)。
   11. サイクルパラメータを入力したら、 プレート タブを選択し、実行するサンプルを入力します(補足図3)。[ 実行の開始] を選択します。
       注:記載されている手順は、市販のマスターミックスを使用してqPCRマシンで実行されました(材料の表を参照)。
3. データ分析の実行
   1. 実行が完了したら、サンプル名、ターゲット名、定量化サイクル(Cq)を含むデータスプレッドシートを作成します(補足表1)。
   2. MALAT1サンプルから始めて、核分率を計算します。MALAT1核画分からMALAT1細胞質画分を差し引く(表4)。
   3. 次に、ΔCq(2^(-値))を計算します(表5)。
   4. MALAT1サンプルを続けて細胞質画分を計算し、MALAT1細胞質画分からMALAT1核画分を差し引いてから、ΔCq(2^(-値))を計算します(表6)。
      注:ΔCqを見ると、核MALAT1画分(緑色ハイライト)は細胞質(赤色ハイライト)よりもMALAT1マーカーが大きいことが観察されていますが、細胞質画分が主に細胞質であり、核画分に細胞質汚染が含まれていないことを確認するために確認が必要です。
   5. TUG1サンプルを使用して、上記と同じ計算を実行します(ステップ4.3.2〜4.3.4)(表7)。
      注:ΔCqを見ると、細胞質TUG1画分(緑色ハイライト)は核画分(赤色ハイライト)よりもTUG1マーカーが大きく、細胞質画分と核画分の良好な分離が確認されています(表8、 図1)。

結果

核および細胞質の単離が達成されたことを確認するために、qPCRを実施して結果を検証しました。その際、関心領域に特異的なプライマーを利用して、核および細胞質分画レベルを実証しました。本研究では、MALAT1およびTUG1をそれぞれ核および細胞質プライマーとして使用した。これらを組み合わせることで、核元素のポジティブコントロールとしてMALAT1を用いた高レベルの核分画の実証が?...

ディスカッション

プロトコル全体を通して、目的の細胞株に最も効果的になるように要素を最適化するためにいくつかのステップが取られました。プロトコル内の手順は比較的簡単ですが、プロトコルの重要な側面で分析と微調整が必要になる場合があります。このプロトコルの最も重要なステップは、目的の細胞株と細胞標的に基づいて、溶解バッファーの濃度を適切な濃度に変更することです。溶解バッ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.