Preparação de RNAs Longos Citoplasmáticos e Nucleares a partir de Células Primárias e Cultivadas

Resumo

O presente protocolo oferece um método eficiente e flexível para isolar o RNA das frações nucleares e citoplasmáticas usando células cultivadas e, em seguida, validar usando qPCR. Isso efetivamente serve como um substituto para outros kits de preparação de RNA.

Resumo

A separação de componentes intracelulares tem sido uma ferramenta fundamental na biologia celular há muitos anos e tem sido capaz de fornecer informações úteis sobre como sua localização pode afetar sua função. Em particular, a separação do RNA nuclear e citoplasmático tornou-se importante no contexto das células cancerosas e na busca para encontrar novos alvos para drogas. A compra de kits para extração de RNA nuclear-citoplasmático pode ser dispendiosa quando muitos dos materiais necessários podem ser encontrados em um ambiente de laboratório típico. Usando o método atual, que pode substituir kits mais caros ou outros processos demorados, apenas um tampão de lise caseiro, uma centrífuga de bancada e colunas de purificação de isolamento de RNA são necessárias para isolar o RNA nuclear e citoplasmático. O tampão de lise é usado para lisar suavemente a membrana externa da célula sem afetar a integridade do envelope nuclear, permitindo a liberação de seus componentes intracelulares. Em seguida, os núcleos podem ser isolados por uma simples etapa de centrifugação, uma vez que possuem uma densidade maior do que a solução de lise. A centrifugação é utilizada para separar essas áreas com base em suas diferenças de densidade para isolar elementos subcelulares no núcleo daqueles no citoplasma. Uma vez que a centrifugação tenha isolado os diferentes componentes, um kit de limpeza de RNA é utilizado para purificar o conteúdo de RNA, e qPCR é realizada para validar a qualidade da separação, quantificada pela quantidade de RNA nuclear e citoplasmático nas diferentes frações. Níveis estatisticamente significativos de separação foram alcançados, ilustrando a eficácia do protocolo. Além disso, este sistema pode ser adaptado para o isolamento de diferentes tipos de RNA (RNA total, pequeno, etc.), o que permite o estudo direcionado das interações citoplasma-núcleo e auxilia na compreensão das diferenças na função do RNA que residem no núcleo e no citoplasma.

Introdução

O fracionamento celular em componentes subcelulares permite o isolamento e o estudo de domínios bioquímicos definidos e auxilia na determinação da localização de processos celulares específicos e como isso pode afetar sua função¹. O isolamento do RNA de diferentes localizações intracelulares pode permitir uma melhor precisão da análise genética e bioquímica dos eventos do nível de transcrição e outras interações entre o núcleo e o citoplasma, que serve como o objetivo principal do protocolo atual². Este protocolo foi desenvolvido para garantir o isolamento de RNAs citoplasmáticos e nucleares para determinar seus respectivos papéis na exportação nuclear e para entender como a localização subcelular de RNAs no núcleo e citoplasma pode afetar sua função nos processos celulares. Utilizando materiais de um ambiente laboratorial típico, foi possível alcançar o fracionamento nuclear e citoplasmático de forma mais eficaz e menos dispendiosa do que os protocolos previamente estabelecidos, sem comprometer a qualidade dos resultados³.

Além disso, a troca de moléculas entre o citoplasma e o núcleo pode ser estudada diretamente separando essas regiões. Mais especificamente, a compreensão do transcriptoma é essencial para a compreensão do desenvolvimento e da doença. No entanto, os RNAs podem estar em diferentes níveis de maturação a qualquer momento e podem complicar a análise a jusante. Este protocolo permite a capacidade de isolar o RNA das frações subcelulares nucleares e citoplasmáticas, o que pode auxiliar nos estudos de RNA e permitir uma melhor compreensão de um RNA particular de interesse, como a localização de RNAs não codificantes ou a análise de junções de emenda dentro do núcleo.

Este protocolo foi otimizado para isolar RNAs longos citoplasmáticos e nucleares, incluindo mRNAs, rRNAs e RNAs longos não codificantes (lncRNAs), devido à seletividade de tamanho da coluna de purificação de RNA utilizada, que pode ser modificada para isolar outros RNAs de interesse. Anteriormente, a função de RNAs longos, como mRNAs e lncRNAs, dependia muito de sua respectiva localização dentro da célula ^4,5. Portanto, o estudo da exportação do núcleo para os domínios subcelulares tornou-se mais direcionado para a compreensão do papel que a exportação de RNA ou outros componentes celulares pode ter na célula. Os lncRNAs servem como um excelente exemplo disso, pois sua tradução e efeitos subsequentes dependem em grande parte da proximidade e interações com outras formas de RNA⁶. Além disso, a troca de elementos celulares entre regiões nucleares e citoplasmáticas está ligada a mecanismos de resistência a diversos tratamentos contra o câncer⁷. O isolamento dos compartimentos intracelulares tem permitido o desenvolvimento de inibidores nucleares de exportação, o que tem diminuído os efeitos dos mecanismos de resistência a diferentes terapias⁸.

Após a separação do RNA nuclear e citoplasmático, são realizadas etapas para purificar o RNA de interesse. Como os kits de purificação de RNA são comumente encontrados em laboratórios e funcionam para purificar e isolar RNAs longos, eles servem bem ao propósito deste protocolo. Para a purificação de RNA, gerar proporções de 260:280 maiores que 1,8 é fundamental para garantir a qualidade das amostras para sequenciamento de RNA ou outros procedimentos similares que exijam altos níveis de pureza e isolamento. Valores irregulares de 260:280 indicam contaminação por fenol, demonstrando mau isolamento e resultados imprecisos⁹.

Uma vez que a purificação do RNA esteja completa e os valores de 260:280 estejam confirmados acima de uma faixa aceitável, a qPCR foi utilizada para validar os resultados de isolamento das frações nuclear e citoplasmática. Para tanto, foram utilizados primers específicos para a região de interesse para demonstrar os níveis de fracionamento nuclear e citoplasmático. Nesse protocolo, MALAT1 e TUG1 foram utilizados como marcadores nucleares e citoplasmáticos, respectivamente¹⁰. Juntos, eles permitem a demonstração de altos níveis de fracionamento nuclear com MALAT1, enquanto o fracionamento citoplasmático deve ser baixo. Por outro lado, quando o TUG1 é usado, espera-se que os níveis de fracionamento citoplasmático sejam maiores do que os níveis de fracionamento nuclear.

Utilizando este protocolo, foi possível isolar RNAs com base em sua posição de ação dentro da célula. Devido ao amplo acesso a muitos materiais e à utilização de apenas tampão de lise e técnicas de centrifugação baseadas em densidade durante este experimento, a aplicabilidade a outros tipos de RNA e outros componentes celulares é generalizada. Isso pode fornecer informações importantes, lançando luz sobre eventos de expressão específicos do local que, de outra forma, seriam indistinguíveis sem separação.

Protocolo

As células K562 são utilizadas para o presente estudo. Este protocolo foi otimizado para funcionar para 1 x 10 6-5 x 10⁶ milhões de células. No entanto, o procedimento pode ser ampliado para quantidades maiores de células, aumentando os volumes adequadamente.

1. Preparação do tampão de lise 0.25x

1. Preparar tampão de lise 0,25x misturando os seguintes componentes fornecidos na Tabela 1A.
   NOTA: As amostras requerem aproximadamente 300 μL de tampão de lise 0,25x. Volume recomendado = número de amostras x 300 μL.

2. Separação das frações nuclear e citoplasmática

1. Pellet as células usando tubos de 1,5 mL via centrifugação por 5 min a 2000 x g (temperatura ambiente). Rejeitar o sobrenadante utilizando uma pipeta aspirante.
   NOTA: As células K562 foram utilizadas durante este protocolo. No entanto, o protocolo pode ser adaptado a várias linhagens celulares.
2. Ressuscite o pellet em 300 μL de tampão de lise gelado 0,25x.
   NOTA: Mantenha no gelo por 2 min e gire o tubo a cada 45 s para garantir a lise adequada das células.
3. Gire os tubos à velocidade mais alta (12.000 x g) a 4 °C durante 2 minutos.
4. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante e coloque-o em um novo tubo de 1,5 mL. Esta será a fração citoplasmática. Aproximadamente 300 μL da fração citoplasmática serão atingidos.
5. O pellet restante será a fração nuclear. Adicionar 500 μL de PBS gelado ao pellet e centrifugar a 2.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
   Observação : durante esta etapa, o excesso de DNA é removido.

3. Limpeza de RNA usando um kit de purificação de RNA

NOTA: Este protocolo foi alcançado utilizando um kit de purificação de RNA comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).

1. Separe as amostras de RNA citoplasmático e as amostras citoplasmáticas nucleares (pois as etapas de fracionamento variam entre elas).
   1. Para separar a fração citoplasmática, adicione 1.050 μL de tampão de lise RLT de 3,5x (ver Tabela de Materiais) e vórtice brevemente. Em seguida, adicione 750 μL de etanol a 90% e carregue-o na coluna do kit de limpeza de RNA.
      NOTA: A solução deve ser bem misturada antes de ser carregada na coluna.
   2. Para separar a fração nuclear, adicione 600 μL de tampão de lise 3,5x e vórtice. Em seguida, adicione 600 μL de etanol a 70%.
2. Carregue frações citoplasmáticas e nucleares em colunas de RNA (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para o restante da etapa 3, as amostras citoplasmáticas e nucleares seguem o mesmo procedimento. No entanto, certifique-se de que essas amostras permaneçam independentes umas das outras.
   1. Carregue frações citoplasmáticas e nucleares em colunas de RNA e gire por 30 s a 8.000 x g à temperatura ambiente. Descarte o excesso de fluxo.
   2. Adicione 350 μL de tampão de lavagem de um kit de purificação comercialmente disponível (tampão RW1, consulte Tabela de Materiais), gire novamente e descarte o fluxo.
   3. Adicionar solução de DNAse (1U/uL) durante 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 350 μL de tampão de lavagem, gire novamente e descarte o fluxo.
   4. Adicione 500 μL de tampão de lavagem suave (PSE, consulte Tabela de materiais), gire novamente e descarte o fluxo. Adicione 500 μL de tampão de lavagem suave, gire novamente, mas apenas por 2 min.
   5. Mova a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 30 μL de água à coluna de spin. Deixe a coluna descansar por 1 minuto antes de girar.

4. Validação da separação nuclear-citoplasmática

1. Realizar a síntese de cDNA
   1. Uma vez que os compartimentos subcelulares do RNA tenham sido extraídos e purificados, confirme a separação dos compartimentos usando qPCR. Para fazer isso, primeiro, converta o RNA em cDNA usando um kit comercialmente disponível seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais).
   2. Prepare o mastermix da transcriptase reversa. Adicione o modelo de RNA. Incubar reações em um termociclador.
      NOTA: Para hexâmeros aleatórios, os parâmetros de ciclagem utilizados são fornecidos no Quadro 2A. Utilizar imediatamente a reação da transcriptase reversa ou conservar a -20 °C (Tabela 1B).
2. Realizar a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e análise.
   1. Diluir a síntese de cDNA com água DEPC (ver Tabela de Materiais) para ter uma concentração final de 20 ng/mL.
   2. Usando uma mistura mestra de PCR, prepare a reação para cada amostra usando instruções manuais, conforme listado abaixo.
   3. Adquirir sondas comerciais necessárias para detectar o fracionamento citoplasmático e nuclear. Use MALAT1 como marcador nuclear e TUG1 como marcador citoplasmático (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: As sequências para MALAT1 e TUG1 são fornecidas na Tabela 3.
   4. Calcular o volume de cada componente multiplicando cada componente por 3 para cada uma das repetições técnicas para a amostra individual.
   5. Para cada amostra nuclear e citoplasmática, adquirir as seguintes misturas para cada uma: (a) Fração nuclear com MALAT1, (b) Fração citoplasmática com MALAT1, (c) Fração nuclear com TUG1 e (d) Fração citoplasmática com TUG1 (Tabela 1C).
   6. Vórtice brevemente para misturar soluções e transferir 20 μL da mistura para cada poço de uma placa de reação óptica (ver Tabela de Materiais).
   7. Cubra a placa com uma película adesiva transparente utilizada para qPCR (ver Tabela de Materiais) e centrifugar a placa brevemente para eliminar as bolhas de ar e, em seguida, girar a amostra para baixo a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   8. Usando um software de projeto e análise (consulte Tabela de Materiais), selecione a curva padrão para os parâmetros de ciclagem (Tabela 2B).
   9. Usando o software qPCR, selecione Configurar execução (Figura 1 Suplementar).
   10. Na página Propriedades do Arquivo de Dados, selecione Método e parâmetros do ciclo de entrada na Tabela 2B (Figura 2 Suplementar).
   11. Depois de inserir os parâmetros do ciclo, selecione a guia Placa e insira as amostras a serem executadas (Figura 3 Suplementar). Selecione Iniciar Execução.
       NOTA: As etapas descritas foram executadas em uma máquina qPCR usando um master mix comercialmente disponível (consulte Tabela de Materiais).
3. Realizar análise de dados
   1. Após a conclusão da execução, crie uma planilha de dados com o nome da amostra, o nome do destino e o ciclo de quantificação (Cq) (Tabela Suplementar 1).
   2. Comece com as amostras MALAT1 para calcular a fração nuclear. Subtraia a fração citoplasmática MALAT1 da fração nuclear MALAT1 (Tabela 4).
   3. Em seguida, calcule o ΔCq (2^(-value)) (Tabela 5).
   4. Continue com as amostras de MALAT1 para calcular a fração citoplasmática, subtraia a fração nuclear MALAT1 da fração citoplasmática MALAT1 e, em seguida, calcule o ΔCq (2^(-value)) (Tabela 6).
      NOTA: Olhando para o ΔCq, observa-se que a fração MALAT1 nuclear (destaque verde) tem um marcador MALAT1 maior do que o citoplasma (realce vermelho), mas agora a confirmação é necessária para garantir que a fração citoplasmática é predominantemente citoplasmática e que a fração nuclear não contém contaminação citoplasmática.
   5. Com amostras de TUG1, execute o mesmo cálculo acima (etapas 4.3.2-4.3.4) (Tabela 7).
      NOTA: Olhando para o ΔCq, observa-se que a fração citoplasmática TUG1 (destaque verde) possui um marcador TUG1 maior que a fração nuclear (realce vermelho), confirmando assim uma boa separação das frações citoplasmática e nuclear (Tabela 8, Figura 1).

Resultados

Para garantir que o isolamento nuclear e citoplasmático tivesse sido alcançado, uma qPCR foi realizada para validar os resultados. Para tanto, foram utilizados primers específicos da região de interesse para demonstrar os níveis de fracionamento nuclear e citoplasmático. Neste estudo, MALAT1 e TUG1 foram utilizados como primers nucleares e citoplasmáticos, respectivamente. Juntos, eles permitem a demonstração de altos níveis de fracionamento nuclear com MALAT1 como um controle positivo para elementos nucleares,...

Discussão

Ao longo do protocolo, algumas medidas foram tomadas para otimizar os elementos para serem mais eficazes para a linhagem celular de interesse. Embora as etapas dentro do protocolo sejam relativamente simples, análises e pequenos ajustes durante aspectos críticos do protocolo podem ser necessários. A etapa mais crítica do protocolo é modificar a concentração do tampão de lise para uma concentração adequada com base na linhagem celular de interesse e no alvo celular. Como a utilização do tampão de lise depende...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.