Primer ve Kültürlü Hücrelerden Sitoplazmik ve Nükleer Uzun RNA'ların Hazırlanması

Özet

Mevcut protokol, RNA'yı kültürlenmiş hücreler kullanarak nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlardan izole etmek ve daha sonra qPCR kullanarak doğrulamak için etkili ve esnek bir yöntem sunmaktadır. Bu, etkili bir şekilde diğer RNA hazırlama kitlerinin yerine geçer.

Özet

Hücre içi bileşenlerin ayrılması, uzun yıllardır hücresel biyolojide önemli bir araç olmuştur ve konumlarının işlevlerini nasıl etkileyebileceğine dair yararlı bilgiler sağlayabilmiştir. Özellikle, nükleer ve sitoplazmik RNA'nın ayrılması, kanser hücreleri ve ilaçlar için yeni hedefler bulma arayışı bağlamında önemli hale gelmiştir. Nükleer-sitoplazmik RNA ekstraksiyonu için kitlerin satın alınması, gerekli malzemelerin çoğu tipik bir laboratuvar ortamında bulunabildiğinde maliyetli olabilir. Daha pahalı kitlerin veya diğer zaman alıcı işlemlerin yerini alabilen mevcut yöntemi kullanarak, nükleer ve sitoplazmik RNA'yı izole etmek için sadece ev yapımı bir lizis tamponu, bir tezgah üstü santrifüj ve RNA izolasyon saflaştırma sütunlarına ihtiyaç vardır. Lizis tamponu, nükleer zarfın bütünlüğünü etkilemeden hücrenin dış zarını nazikçe lize etmek için kullanılır ve hücre içi bileşenlerinin serbest bırakılmasına izin verir. Daha sonra, çekirdekler basit bir santrifüjleme adımıyla izole edilebilir, çünkü lizis çözeltisinden daha yüksek bir yoğunluğa sahiptirler. Santrifüjleme, çekirdekteki hücre altı elementleri sitoplazmadakilerden izole etmek için bu alanları yoğunluk farklılıklarına göre ayırmak için kullanılır. Santrifüjleme farklı bileşenleri izole ettikten sonra, RNA içeriğini saflaştırmak için bir RNA temizleme kiti kullanılır ve farklı fraksiyonlardaki nükleer ve sitoplazmik RNA miktarı ile ölçülen ayırma kalitesini doğrulamak için qPCR gerçekleştirilir. Protokolün etkinliğini gösteren istatistiksel olarak anlamlı ayrılma seviyelerine ulaşıldı. Ek olarak, bu sistem, sitoplazma-çekirdek etkileşimlerinin hedefli olarak incelenmesine izin veren ve çekirdek ve sitoplazmada bulunan RNA'nın işlevindeki farklılıkların anlaşılmasına yardımcı olan farklı RNA türlerinin (toplam, küçük RNA, vb.) İzolasyonu için uyarlanabilir.

Giriş

Hücre altı bileşenlere hücresel fraksiyonasyon, tanımlanmış biyokimyasal alanların izolasyonuna ve incelenmesine izin verir ve spesifik hücresel süreçlerin lokalizasyonunu ve bunun işlevlerini nasıl etkileyebileceğini belirlemeye yardımcı olur¹. RNA'nın farklı hücre içi konumlardan izole edilmesi, transkripsiyon seviyesi olaylarının ve çekirdek ile sitoplazma arasındaki diğer etkileşimlerin genetik ve biyokimyasal analizinin doğruluğunun iyileştirilmesine izin verebilir ve bu da mevcut protokolün birincil amacı olarak hizmet eder². Bu protokol, nükleer ihracattaki rollerini belirlemek ve nükleus ve sitoplazmadaki RNA'ların hücre altı lokalizasyonunun hücresel süreçlerdeki işlevlerini nasıl etkileyebileceğini anlamak için sitoplazmik ve nükleer RNA'ların izolasyonunu sağlamak için geliştirilmiştir. Tipik bir laboratuvar ortamındaki materyalleri kullanarak, sonuçların kalitesini tehlikeye atmadan nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyonu daha önce belirlenmiş protokollerden daha etkili ve daha ucuz bir şekilde elde etmek mümkün olmuştur³.

Ek olarak, sitoplazma ve çekirdek arasındaki moleküllerin değişimi, bu bölgeleri ayırarak doğrudan incelenebilir. Daha spesifik olarak, transkriptomu anlamak, gelişimi ve hastalığı anlamak için gereklidir. Bununla birlikte, RNA'lar herhangi bir zamanda farklı olgunlaşma seviyelerinde olabilir ve aşağı akış analizini zorlaştırabilir. Bu protokol, RNA'yı nükleer ve sitoplazmik hücre altı fraksiyonlardan izole etme yeteneğine izin verir, bu da RNA çalışmalarına yardımcı olabilir ve kodlamayan RNA'ların lokalizasyonu veya çekirdek içindeki ekleme kavşaklarının analizi gibi belirli bir RNA'nın daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Bu protokol, kullanılan RNA saflaştırma kolonunun boyut seçiciliği nedeniyle, mRNA'lar, rRNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar) dahil olmak üzere sitoplazmik ve nükleer uzun RNA'ları izole etmek için optimize edilmiştir. Önceden, mRNA'lar ve lncRNA'lar gibi uzun RNA'ların işlevi, ^4,5 hücresi içindeki ilgili lokalizasyonlarına büyük ölçüde bağlıydı. Bu nedenle, çekirdekten hücre altı alanlara yapılan ihracatın incelenmesi, RNA'nın veya diğer hücresel bileşenlerin ihraç edilmesinin hücre üzerindeki rolünü anlamaya yönelik daha hedefli hale gelmiştir. lncRNA'lar bunun en iyi örneği olarak hizmet eder, çünkü çevirileri ve sonraki etkileri büyük ölçüde RNA^6'nın diğer formlarıyla yakınlık ve etkileşimlere dayanır. Ayrıca, nükleer ve sitoplazmik bölgeler arasındaki hücresel elementlerin değişimi, çeşitli kanser tedavilerine direnç mekanizmalarına bağlıdır⁷. Hücre içi bölmelerin izolasyonu, direnç mekanizmalarının farklı tedavilere etkilerini azaltan nükleer ihracat inhibitörlerinin geliştirilmesine izin vermiştir⁸.

Nükleer ve sitoplazmik RNA'yı ayırdıktan sonra, ilgilenilen RNA'yı saflaştırmak için adımlar atılır. RNA saflaştırma kitleri laboratuvarlarda yaygın olarak bulunduğundan ve uzun RNA'ları saflaştırmak ve izole etmek için işlev gördüğünden, bu protokolün amacına iyi hizmet ederler. RNA saflaştırması için, 1.8'den büyük 260:280 oranlarının üretilmesi, RNA dizilimi veya yüksek saflık ve izolasyon gerektiren diğer benzer prosedürler için numunelerin kalitesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Düzensiz 260:280 değerleri fenol kontaminasyonunu gösterir, zayıf izolasyon gösterir ve yanlış sonuçlar verir⁹.

RNA saflaştırması tamamlandıktan ve 260:280 değerlerinin kabul edilebilir bir aralığın üzerinde olduğu doğrulandıktan sonra, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların izolasyon sonuçlarını doğrulamak için qPCR kullanıldı. Bunu yaparken, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerini göstermek için ilgili bölgeye özgü primerler kullanılmıştır. Bu protokolde MALAT1 ve TUG1 nükleer ve sitoplazmik belirteçler olarak sırasıyla¹⁰ kullanıldı. Birlikte, MALAT1 ile yüksek düzeyde nükleer fraksiyonasyonun gösterilmesine izin verirken, sitoplazmik fraksiyonasyonun düşük olması beklenir. Tersine, TUG1 kullanıldığında, sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerinin nükleer fraksiyonasyon seviyelerinden daha yüksek olması beklenir.

Bu protokolü kullanarak, RNA'ları hücre içindeki etki konumlarına göre izole etmek mümkündü. Bu deney sırasında birçok malzemeye yaygın erişim ve sadece lizis tamponu ve yoğunluğa dayalı santrifüj tekniklerinin kullanılması nedeniyle, diğer RNA tiplerine ve diğer hücresel bileşenlere uygulanabilirlik yaygındır. Bu, aksi takdirde ayrılmadan ayırt edilemeyecek konuma özgü ifade olaylarına ışık tutarak önemli bilgiler sağlayabilir.

Protokol

Bu çalışmada K562 hücreleri kullanılmıştır. Bu protokol 1 x 10^6-5 x 10⁶ milyon hücre için çalışacak şekilde optimize edilmiştir. Bununla birlikte, prosedür, hacimleri uygun şekilde artırarak daha büyük hücre miktarları için ölçeklendirilebilir.

1. 0.25x lizis tamponunun hazırlanması

1. Tablo 1A'da verilen aşağıdaki bileşenleri karıştırarak 0,25x lizis tamponu hazırlayın.
   NOT: Numuneler yaklaşık 300 μL 0,25x lizis tamponu gerektirir. Önerilen hacim = numune sayısı x 300 μL.

2. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların ayrılması

1. 1,5 mL tüpler kullanarak hücreleri 2000 x g'de (oda sıcaklığında) 5 dakika boyunca santrifüjleme yoluyla toplayın. Süpernatantı aspire edici bir pipet kullanarak atın.
   NOT: Bu protokol sırasında K562 hücreleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, protokol çeşitli hücre hatlarına uyarlanabilir.
2. Peleti 300 μL buz gibi soğuk 0.25x lizis tamponunda yeniden askıya alın.
   NOT: 2 dakika boyunca buz üzerinde tutun ve hücrelerin uygun şekilde parçalanmasını sağlamak için tüpü her 45 saniyede bir döndürün.
3. Tüpleri 2 dakika boyunca 4 °C'de en yüksek hızda (12.000 x g) döndürün.
4. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin. Bu sitoplazmik fraksiyon olacaktır. Sitoplazmik fraksiyonun yaklaşık 300 μL'sine ulaşılacaktır.
5. Kalan pelet nükleer fraksiyon olacaktır. Pelet üzerine 500 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj yapın.
   NOT: Bu adım sırasında, fazla DNA çıkarılır.

3. Bir RNA saflaştırma kiti kullanarak RNA temizliği

NOT: Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Sitoplazmik RNA örneklerini ve nükleer sitoplazmik örnekleri ayırın (fraksiyonasyon adımları aralarında değiştiğinden).
   1. Sitoplazmik fraksiyonu ayırmak için, 1.050 μL 3.5x RLT lizis tamponu ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve kısaca vorteks. Ardından, 750 μL% 90 etanol ekleyin ve RNA temizleme kitinden kolona yükleyin.
      NOT: Çözelti, kolona yüklenmeden önce iyice karıştırılmalıdır.
   2. Nükleer fraksiyonu ayırmak için, 600 μL 3.5x lizis tamponu ve vorteks ekleyin. Ardından, 600 μL% 70 etanol ekleyin.
2. Hem sitoplazmik hem de nükleer fraksiyonları RNA sütunlarına yükleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
   NOT: Adım 3'ün geri kalanında, hem sitoplazmik hem de nükleer örnekler aynı prosedürü izler. Ancak, bu örneklerin birbirinden bağımsız kalmasını sağlayın.
   1. Hem sitoplazmik hem de nükleer fraksiyonları RNA kolonlarına yükleyin ve oda sıcaklığında 8.000 x g'de 30 s döndürün. Fazla akışı atın.
   2. Ticari olarak temin edilebilen bir arıtma kitinden 350 μL yıkama tamponu ekleyin (RW1 tamponu, Malzeme Tablosu'na bakın), tekrar döndürün ve akışı atın.
   3. DNAse çözeltisini (1U/uL) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ekleyin. Ardından, 350 μL yıkama tamponu ekleyin, tekrar döndürün ve akışı atın.
   4. 500 μL hafif yıkama tamponu ekleyin (RPE, Malzeme Tablosu'na bakın), tekrar döndürün ve akışı atın. 500 μL hafif yıkama tamponu ekleyin, tekrar döndürün, ancak sadece 2 dakika bekleyin.
   5. Kolonu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe taşıyın ve spin kolonuna 30 μL su ekleyin. Aşağı dönmeden önce sütunu 1 dakika bekletin.

4. Nükleer-sitoplazmik ayrımın doğrulanması

1. cDNA sentezi gerçekleştirin
   1. RNA'nın hücre altı bölmeleri ekstrakte edildikten ve saflaştırıldıktan sonra, qPCR kullanarak bölmelerin ayrıldığını onaylayın. Bunu yapmak için, önce, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak RNA'yı cDNA'ya dönüştürün (bkz.
   2. Ters transkriptaz mastermix'ini hazırlayın. Şablon RNA ekleyin. Bir termosiklustaki reaksiyonları inkübe edin.
      NOT: Rastgele hexamers için, kullanılan bisiklet parametreleri Tablo 2A'da verilmiştir. Ters transkriptaz reaksiyonunu hemen kullanın veya -20 °C'de saklayın (Tablo 1B).
2. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunu (qPCR) ve analizini gerçekleştirin.
   1. cDNA sentezini DEPC suyuyla seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu) 20 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona sahip olmak için.
   2. Bir PCR ana karışımı kullanarak, aşağıda listelenen manuel talimatları kullanarak her numune için reaksiyonu hazırlayın.
   3. Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonasyonu tespit etmek için gerekli ticari probları edinin. Nükleer belirteç olarak MALAT1 ve sitoplazmik belirteç olarak TUG1 kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).
      NOT: MALAT1 ve TUG1 dizileri Tablo 3'te verilmiştir.
   4. Her bir numune için teknik çoğaltmaların her biri için her bir bileşeni 3 ile çarparak her bileşenin hacmini hesaplayın.
   5. Her nükleer ve sitoplazmik numune için, her biri için aşağıdaki karışımları edinin: (a) MALAT1 ile nükleer fraksiyon, (b) MALAT1 ile Sitoplazmik fraksiyon, (c) TUG1 ile nükleer fraksiyon ve (d) TUG1 ile Sitoplazmik fraksiyon (Tablo 1C).
   6. Çözeltileri karıştırmak ve karışımın 20 μL'sini bir optik reaksiyon plakasının her bir kuyucuğuna aktarmak için kısaca vorteks yapın (bkz.
   7. Plakayı qPCR için kullanılan şeffaf bir yapışkan filmle örtün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hava kabarcıklarını gidermek için plakayı kısaca santrifüj edin ve ardından numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün.
   8. Tasarım ve analiz yazılımını kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu), döngü parametreleri için standart eğriyi seçin (Tablo 2B).
   9. qPCR yazılımını kullanarak Çalıştırmayı ayarla'yı seçin (Ek Şekil 1).
   10. Veri Dosyası Özellikleri sayfasında, Tablo 2B'den Yöntem ve giriş döngüsü parametreleri'ni seçin (Ek Şekil 2).
   11. Döngü parametrelerini girdikten sonra, Plaka sekmesini seçin ve çalıştırılacak örnekleri girin (Ek Şekil 3). Çalıştırmayı Başlat'ı seçin.
       NOT: Açıklanan adımlar, ticari olarak temin edilebilen bir ana karışım kullanılarak bir qPCR makinesinde gerçekleştirilmiştir (bkz.
3. Veri analizi gerçekleştirme
   1. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, örnek adı, hedef adı ve niceleme döngüsü (Cq) içeren bir veri elektronik tablosu oluşturun (Ek Tablo 1).
   2. Nükleer fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleri ile başlayın. MALAT1 sitoplazmik fraksiyonunu MALAT1 nükleer fraksiyonundan çıkarın (Tablo 4).
   3. Ardından, ΔCq (2^(-value)) (Tablo 5) değerini hesaplayın.
   4. Sitoplazmik fraksiyonu hesaplamak için MALAT1 örnekleriyle devam edin, MALAT1 nükleer fraksiyonunu MALAT1 sitoplazmik fraksiyonundan çıkarın ve ardından ΔCq'yu (2 ^ (-değer)) hesaplayın (Tablo 6).
      NOT: ΔCq'ya bakıldığında, nükleer MALAT1 fraksiyonunun (yeşil vurgu) sitoplazmadan (kırmızı vurgu) daha büyük bir MALAT1 belirtecine sahip olduğu gözlenmiştir, ancak şimdi sitoplazmik fraksiyonun ağırlıklı olarak sitoplazm olduğundan ve nükleer fraksiyonun sitoplazmik kontaminasyon içermediğinden emin olmak için doğrulama gereklidir.
   5. TUG1 numunelerinde, yukarıdakiyle aynı hesaplamayı yapın (adım 4.3.2-4.3.4) (Tablo 7).
      NOT: ΔCq'ya bakıldığında, sitoplazmik TUG1 fraksiyonunun (yeşil vurgu) nükleer fraksiyondan (kırmızı vurgu) daha büyük bir TUG1 belirtecine sahip olduğu, böylece sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların iyi bir şekilde ayrıldığını doğruladığı gözlenmiştir (Tablo 8, Şekil 1).

Sonuçlar

Nükleer ve sitoplazmik izolasyonun sağlandığından emin olmak için, sonuçları doğrulamak için bir qPCR yapıldı. Bunu yaparken, nükleer ve sitoplazmik fraksiyonasyon seviyelerini göstermek için ilgilenilen bölgeye özgü primerler kullanılmıştır. Bu çalışmada MALAT1 ve TUG1 sırasıyla nükleer ve sitoplazmik primer olarak kullanılmıştır. Birlikte, nükleer elementler için pozitif bir kontrol olarak MALAT1 ile yüksek seviyelerde nükleer fraksiyonasyonun gösterilmesine izin verirken, sitoplazm...

Tartışmalar

Protokol boyunca, ilgilenilen hücre hattı için en etkili olacak öğeleri optimize etmek için bazı adımlar atıldı. Protokol içindeki adımlar nispeten basit olsa da, protokolün kritik yönleri sırasında analiz ve küçük ayarlamalar gerekli olabilir. Protokoldeki en kritik adım, lizis tamponunun konsantrasyonunu, ilgilenilen hücre hattına ve hücresel hedefe bağlı olarak uygun bir konsantrasyona değiştirmektir. Lizis tamponunun kullanımı büyük ölçüde hücre zarlarının bozulmasına bağlı old...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.