Herstellung von zytoplasmatischen und nukleären langen RNAs aus primären und kultivierten Zellen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll bietet eine effiziente und flexible Methode, um RNA aus nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen unter Verwendung kultivierter Zellen zu isolieren und dann mittels qPCR zu validieren. Dies dient effektiv als Ersatz für andere RNA-Präparationskits.

Zusammenfassung

Die Trennung intrazellulärer Komponenten ist seit vielen Jahren ein Schlüsselwerkzeug in der Zellbiologie und konnte nützliche Erkenntnisse darüber liefern, wie sich ihre Lage auf ihre Funktion auswirken kann. Insbesondere die Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA ist im Zusammenhang mit Krebszellen und der Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente wichtig geworden. Der Kauf von Kits für die nukleär-zytoplasmatische RNA-Extraktion kann kostspielig sein, wenn viele der benötigten Materialien in einer typischen Laborumgebung gefunden werden können. Mit dem vorliegenden Verfahren, das teurere Kits oder andere zeitaufwändige Prozesse ersetzen kann, werden nur ein hausgemachter Lysepuffer, eine Tischzentrifuge und RNA-Isolationsreinigungssäulen benötigt, um nukleare und zytoplasmatische RNA zu isolieren. Lysepuffer wird verwendet, um die äußere Membran der Zelle sanft zu lysieren, ohne die Integrität der Kernhülle zu beeinträchtigen, wodurch ihre intrazellulären Komponenten freigesetzt werden können. Dann können die Kerne durch einen einfachen Zentrifugationsschritt isoliert werden, da sie eine höhere Dichte als die Lyselösung besitzen. Zentrifugation wird verwendet, um diese Bereiche basierend auf ihren Dichteunterschieden zu trennen, um subzelluläre Elemente im Zellkern von denen im Zytoplasma zu isolieren. Sobald die Zentrifugation die verschiedenen Komponenten isoliert hat, wird ein RNA-Clean-up-Kit verwendet, um den RNA-Gehalt zu reinigen, und es wird eine qPCR durchgeführt, um die Trennqualität zu validieren, die durch die Menge an nukleärer und zytoplasmatischer RNA in den verschiedenen Fraktionen quantifiziert wird. Es wurden statistisch signifikante Trennungsgrade erreicht, was die Wirksamkeit des Protokolls verdeutlicht. Darüber hinaus kann dieses System für die Isolierung verschiedener RNA-Typen (Gesamt-, Klein-RNA usw.) angepasst werden, was eine gezielte Untersuchung von Zytoplasma-Kern-Wechselwirkungen ermöglicht und zum Verständnis der Unterschiede in der Funktion von RNA beiträgt, die sich im Zellkern und im Zytoplasma befindet.

Einleitung

Die zelluläre Fraktionierung in subzelluläre Komponenten ermöglicht die Isolierung und Untersuchung definierter biochemischer Domänen und hilft bei der Bestimmung der Lokalisierung spezifischer zellulärer Prozesse und wie sich dies auf ihre Funktion auswirken kann¹. Die Isolierung von RNA an verschiedenen intrazellulären Stellen kann eine verbesserte Genauigkeit der genetischen und biochemischen Analyse von Ereignissen auf Transkriptionsebene und anderen Wechselwirkungen zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma ermöglichen, was als Hauptzweck des aktuellen Protokolls² dient. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Isolierung von zytoplasmatischen und nukleären RNAs sicherzustellen, um ihre jeweilige Rolle beim Kernexport zu bestimmen und zu verstehen, wie die subzelluläre Lokalisation von RNAs im Zellkern und im Zytoplasma ihre Funktion in zellulären Prozessen beeinflussen kann. Durch die Verwendung von Materialien aus einer typischen Laborumgebung war es möglich, eine nukleare und zytoplasmatische Fraktionierung effektiver und kostengünstiger als bisher etablierte Protokolle zu erreichen, ohne die Qualität der Ergebnisse zu gefährden³.

Darüber hinaus kann der Austausch von Molekülen zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern direkt untersucht werden, indem diese Regionen getrennt werden. Genauer gesagt ist das Verständnis des Transkriptoms für das Verständnis von Entwicklung und Krankheit unerlässlich. RNAs können sich jedoch zu einem bestimmten Zeitpunkt in unterschiedlichen Reifegraden befinden und die nachgelagerte Analyse erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von RNA aus nukleären und zytoplasmatischen subzellulären Fraktionen, was bei RNA-Studien hilfreich sein und ein besseres Verständnis einer bestimmten RNA von Interesse ermöglichen kann, wie z. B. die Lokalisierung nicht-kodierender RNAs oder die Analyse von Spleißverbindungen innerhalb des Zellkerns.

Dieses Protokoll wurde für die Isolierung zytoplasmatischer und nukleärer langer RNAs, einschließlich mRNAs, rRNAs und langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs), aufgrund der Größenselektivität der verwendeten RNA-Aufreinigungssäule optimiert, die modifiziert werden kann, um andere RNAs von Interesse zu isolieren. Bisher hing die Funktion langer RNAs, wie mRNAs und lncRNAs, stark von ihrer jeweiligen Lokalisation innerhalb der Zelle^{ab 4,5}. Daher ist die Untersuchung des Exports vom Zellkern in subzelluläre Domänen gezielter geworden, um die Rolle zu verstehen, die der Export von RNA oder anderen zellulären Komponenten auf die Zelle haben kann. lncRNAs dienen als Paradebeispiel dafür, da ihre Translation und ihre nachfolgenden Effekte weitgehend von der Nähe und den Wechselwirkungen mit anderen Formen von RNA⁶ abhängen. Darüber hinaus ist der Austausch zellulärer Elemente zwischen nukleären und zytoplasmatischen Regionen mit Resistenzmechanismen gegen verschiedene Krebsbehandlungen verbunden⁷. Die Isolierung intrazellulärer Kompartimente hat die Entwicklung von Kernexportinhibitoren ermöglicht, was die Auswirkungen von Resistenzmechanismen gegen verschiedene Therapien verringert hat⁸.

Nach der Trennung von nukleärer und zytoplasmatischer RNA werden Schritte durchgeführt, um die interessierende RNA zu reinigen. Da RNA-Aufreinigungskits häufig in Laboratorien zu finden sind und lange RNAs reinigen und isolieren, erfüllen sie den Zweck dieses Protokolls gut. Für die RNA-Aufreinigung ist die Erzeugung eines Verhältnisses von 260:280 von mehr als 1,8 entscheidend, um die Qualität der Proben für die RNA-Sequenzierung oder andere ähnliche Verfahren zu gewährleisten, die ein hohes Maß an Reinheit und Isolierung erfordern. Unregelmäßige Werte von 260:280 deuten auf eine Phenolkontamination hin, was auf eine schlechte Isolierung hinweist und zu ungenauen Ergebnissen führt⁹.

Sobald die RNA-Aufreinigung abgeschlossen ist und bestätigt wurde, dass die 260:280-Werte über einem akzeptablen Bereich liegen, wurde die qPCR verwendet, um die Isolationsergebnisse von Kern- und zytoplasmatischen Fraktionen zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In diesem Protokoll wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Marker verwendet¹⁰. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis einer hohen Kernfraktionierung mit MALAT1, während eine zytoplasmatische Fraktionierung voraussichtlich gering ist. Umgekehrt wird bei Verwendung von TUG1 erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus.

Mit Hilfe dieses Protokolls war es möglich, RNAs basierend auf ihrer Wirkungsposition innerhalb der Zelle zu isolieren. Aufgrund des weit verbreiteten Zugangs zu vielen Materialien und der Verwendung von nur Lysepuffer- und dichtebasierten Zentrifugationstechniken während dieses Experiments ist die Anwendbarkeit auf andere RNA-Typen und andere zelluläre Komponenten weit verbreitet. Dies kann wichtige Informationen liefern, indem standortspezifische Ausdrucksereignisse beleuchtet werden, die sonst ohne Trennung nicht zu unterscheiden wären.

Protokoll

Für die vorliegende Studie werden K562-Zellen verwendet. Dieses Protokoll wurde für 1 x 10,^6-5 x 10,⁶ Millionen Zellen optimiert. Das Verfahren kann jedoch für größere Zellmengen skaliert werden, indem die Volumina entsprechend erhöht werden.

1. Herstellung des 0,25-fachen Lysepuffers

1. Bereiten Sie 0,25-fachen Lysepuffer vor, indem Sie die folgenden Komponenten in Tabelle 1A mischen.
   HINWEIS: Für die Proben werden ca. 300 μl 0,25-facher Lysepuffer benötigt. Empfohlenes Volumen = Anzahl der Proben x 300 μl.

2. Trennung von Kern- und Zytoplasmafraktionen

1. Pelletieren Sie die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen durch Zentrifugation für 5 min bei 2000 x g (Raumtemperatur). Entsorgen Sie den Überstand mit einer Aspirationspipette.
   HINWEIS: Während dieses Protokolls wurden K562-Zellen verwendet. Das Protokoll kann jedoch an verschiedene Zelllinien angepasst werden.
2. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl eiskaltem 0,25-fachem Lysepuffer.
   HINWEIS: Halten Sie es 2 Minuten lang auf Eis und drehen Sie das Röhrchen alle 45 s, um eine ordnungsgemäße Lyse der Zellen zu gewährleisten.
3. Schleudern Sie die Röhrchen mit der höchsten Drehzahl (12.000 x g) bei 4 °C für 2 min.
4. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand und geben Sie ihn in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Dies wird die zytoplasmatische Fraktion sein. Ungefähr 300 μl der zytoplasmatischen Fraktion werden erreicht.
5. Das verbleibende Pellet ist die Kernfraktion. 500 μl eiskaltes PBS in das Pellet geben und bei 2.000 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
   HINWEIS: Während dieses Schritts wird überschüssige DNA entfernt.

3. RNA-Aufreinigung mit einem RNA-Aufreinigungskit

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RNA-Aufreinigungskits erreicht (siehe Materialtabelle).

1. Trennen Sie die zytoplasmatischen RNA-Proben und die zytoplasmatischen Kernproben (da die Fraktionierungsschritte zwischen ihnen variieren).
   1. Um die zytoplasmatische Fraktion zu trennen, geben Sie 1.050 μl 3,5-fachen RLT-Lysepuffer (siehe Materialtabelle) und Wirbel kurz zu. Fügen Sie dann 750 μl 90% Ethanol hinzu und laden Sie es aus dem RNA-Reinigungskit auf die Säule.
      HINWEIS: Die Lösung muss vor dem Laden auf die Säule gut gemischt werden.
   2. Um die Kernfraktion zu trennen, fügen Sie 600 μl 3,5-fachen Lysepuffer und Wirbel hinzu. Fügen Sie dann 600 μl 70% Ethanol hinzu.
2. Laden Sie sowohl zytoplasmatische als auch nukleare Fraktionen auf RNA-Säulen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Für den Rest von Schritt 3 folgen sowohl die zytoplasmatischen als auch die nuklearen Proben dem gleichen Verfahren. Stellen Sie jedoch sicher, dass diese Proben unabhängig voneinander bleiben.
   1. Laden Sie sowohl zytoplasmatische als auch nukleare Fraktionen auf RNA-Säulen und schleudern Sie 30 s lang bei 8.000 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den überschüssigen Durchfluss.
   2. Fügen Sie 350 μl Waschpuffer aus einem handelsüblichen Reinigungskit (RW1-Puffer, siehe Materialtabelle) hinzu, schleudern Sie erneut und entsorgen Sie den Durchfluss.
   3. DNAse-Lösung (1U/ul) für 15 min bei Raumtemperatur zugeben. Fügen Sie dann 350 μl Waschpuffer hinzu, schleudern Sie erneut und verwerfen Sie den Durchfluss.
   4. Fügen Sie 500 μl milden Waschpuffer (RPE, siehe Materialtabelle) hinzu, schleudern Sie erneut und verwerfen Sie den Durchfluss. 500 μl milden Waschpuffer zugeben, erneut schleudern, aber nur für 2 min.
   5. Bewegen Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 30 μl Wasser in die Spin-Säule. Lassen Sie die Säule 1 Minute ruhen, bevor Sie sie herunterschleudern.

4. Validierung der nuklear-zytoplasmatischen Trennung

1. cDNA-Synthese durchführen
   1. Sobald die subzellulären Kompartimente der RNA extrahiert und gereinigt wurden, bestätigen Sie die Trennung der Kompartimente mittels qPCR. Dazu wandeln Sie zunächst die RNA mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA um (siehe Materialtabelle).
   2. Bereiten Sie den Reverse-Transkriptase-Mastermix vor. Fügen Sie Template-RNA hinzu. Inkubationsreaktionen in einem Thermocycler.
      ANMERKUNG: Für zufällige Hexamere sind die verwendeten Zyklusparameter in Tabelle 2A angegeben. Verwenden Sie die Reverse-Transkriptase-Reaktion sofort oder lagern Sie sie bei -20 °C (Tabelle 1B).
2. Führen Sie die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Analyse durch.
   1. Verdünnen Sie die cDNA-Synthese mit DEPC-Wasser (siehe Materialtabelle), um eine Endkonzentration von 20 ng/ml zu erreichen.
   2. Bereiten Sie mit einem PCR-Mastermix die Reaktion für jede Probe vor, indem Sie die unten aufgeführten manuellen Anweisungen verwenden.
   3. Erwerben Sie kommerzielle Sonden, die zum Nachweis der zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionierung erforderlich sind. Verwenden Sie MALAT1 als Kernmarker und TUG1 als zytoplasmatischen Marker (siehe Materialtabelle).
      ANMERKUNG: Die Sequenzen für MALAT1 und TUG1 sind in Tabelle 3 aufgeführt.
   4. Berechnen Sie das Volumen jeder Komponente, indem Sie jede Komponente für jedes der technischen Replikate für die einzelne Probe mit 3 multiplizieren.
   5. Erfassen Sie für jede Kern- und Zytoplasmaprobe die folgenden Mischungen: (a) Kernfraktion mit MALAT1, (b) Zytoplasmatische Fraktion mit MALAT1, (c) Kernfraktion mit TUG1 und (d) Zytoplasmatische Fraktion mit TUG1 (Tabelle 1C).
   6. Vortex, um Lösungen kurz zu mischen und 20 μl der Mischung in jede Vertiefung einer optischen Reaktionsplatte zu überführen (siehe Materialtabelle).
   7. Decken Sie die Platte mit einem durchsichtigen Klebefilm ab, der für die qPCR verwendet wird (siehe Materialtabelle), zentrifugieren Sie die Platte kurz, um Luftblasen zu entfernen, und schleudern Sie die Probe dann bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur herunter.
   8. Wählen Sie mit Hilfe der Konstruktions- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle) die Standardkurve für die Zyklusparameter aus (Tabelle 2B).
   9. Wählen Sie mit der qPCR-Software die Option Lauf einrichten aus (Ergänzende Abbildung 1).
   10. Wählen Sie auf der Seite Eigenschaften der Datendatei die Option Methode und Eingabezyklusparameter aus Tabelle 2B aus (ergänzende Abbildung 2).
   11. Wählen Sie nach der Eingabe der Zyklusparameter die Registerkarte Platte und geben Sie die auszuführenden Proben ein (ergänzende Abbildung 3). Wählen Sie Start Run aus.
       HINWEIS: Die beschriebenen Schritte wurden in einer qPCR-Maschine unter Verwendung eines handelsüblichen Mastermixes durchgeführt (siehe Materialtabelle).
3. Führen Sie eine Datenanalyse durch
   1. Erstellen Sie nach Abschluss des Laufs eine Datentabelle mit dem Probennamen, dem Zielnamen und dem Quantifizierungszyklus (Cq) (Ergänzende Tabelle 1).
   2. Beginnen Sie mit den MALAT1-Proben, um den Kernanteil zu berechnen. Subtrahieren Sie die zytoplasmatische MALAT1-Fraktion von der MALAT1-Kernfraktion (Tabelle 4).
   3. Berechnen Sie dann den ΔCq (2^(-Wert)) (Tabelle 5).
   4. Fahren Sie mit den MALAT1-Proben fort, um den zytoplasmatischen Anteil zu berechnen, subtrahieren Sie den MALAT1-Kernanteil von der zytoplasmatischen MALAT1-Fraktion und berechnen Sie dann den ΔCq (2^(-Wert)) (Tabelle 6).
      HINWEIS: Betrachtet man die ΔCq, so wird beobachtet, dass die Kern-MALAT1-Fraktion (grüne Hervorhebung) einen größeren MALAT1-Marker aufweist als das Zytoplasma (rote Hervorhebung), aber jetzt ist eine Bestätigung erforderlich, um sicherzustellen, dass die zytoplasmatische Fraktion überwiegend Zytoplasma ist und dass die Kernfraktion keine zytoplasmatische Kontamination enthält.
   5. Führen Sie bei TUG1-Stichproben die gleiche Berechnung wie oben durch (Schritte 4.3.2-4.3.4) (Tabelle 7).
      HINWEIS: Betrachtet man den ΔCq, so wird beobachtet, dass die zytoplasmatische TUG1-Fraktion (grüne Hervorhebung) einen größeren TUG1-Marker aufweist als die Kernfraktion (rote Hervorhebung), was eine gute Trennung von zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen bestätigt (Tabelle 8, Abbildung 1).

Ergebnisse

Um sicherzustellen, dass eine nukleare und zytoplasmatische Isolierung erreicht wurde, wurde eine qPCR durchgeführt, um die Ergebnisse zu validieren. Dabei wurden Primer verwendet, die für die interessierende Region spezifisch sind, um die nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus zu demonstrieren. In dieser Studie wurden MALAT1 und TUG1 als nukleäre bzw. zytoplasmatische Primer verwendet. Zusammen ermöglichen sie den Nachweis eines hohen Niveaus der Kernfraktionierung mit MALAT1 als Positivkontrolle fü...

Diskussion

Während des gesamten Protokolls wurden einige Schritte unternommen, um die Elemente so zu optimieren, dass sie für die interessierende Zelllinie am effektivsten sind. Während die Schritte innerhalb des Protokolls relativ einfach sind, können Analysen und kleinere Anpassungen bei kritischen Aspekten des Protokolls erforderlich sein. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern, die auf der interessierenden Zelllinie und dem zelluläre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.