Preparazione di RNA lunghi citoplasmatici e nucleari da cellule primarie e in coltura

Riepilogo

Il presente protocollo offre un metodo efficiente e flessibile per isolare l'RNA da frazioni nucleari e citoplasmatiche utilizzando cellule in coltura e quindi convalidare utilizzando qPCR. Questo serve efficacemente come sostituto per altri kit di preparazione dell'RNA.

Abstract

La separazione dei componenti intracellulari è stata uno strumento chiave nella biologia cellulare per molti anni ed è stata in grado di fornire informazioni utili su come la loro posizione può influire sulla loro funzione. In particolare, la separazione dell'RNA nucleare e citoplasmatico è diventata importante nel contesto delle cellule tumorali e nella ricerca di nuovi bersagli per i farmaci. L'acquisto di kit per l'estrazione dell'RNA nucleare-citoplasmatico può essere costoso quando molti dei materiali richiesti possono essere trovati all'interno di un tipico ambiente di laboratorio. Utilizzando il metodo attuale, che può sostituire kit più costosi o altri processi che richiedono tempo, sono necessari solo un tampone di lisi fatto in casa, una centrifuga da banco e colonne di purificazione dell'isolamento dell'RNA per isolare l'RNA nucleare e citoplasmatico. Il tampone di lisi viene utilizzato per lisare delicatamente la membrana esterna della cellula senza compromettere l'integrità dell'involucro nucleare, consentendo il rilascio dei suoi componenti intracellulari. Quindi, i nuclei possono essere isolati con una semplice fase di centrifugazione poiché possiedono una densità maggiore rispetto alla soluzione di lisi. La centrifugazione viene utilizzata per separare queste aree in base alle loro differenze di densità per isolare gli elementi subcellulari nel nucleo da quelli nel citoplasma. Una volta che la centrifugazione ha isolato i diversi componenti, viene utilizzato un kit di pulizia dell'RNA per purificare il contenuto di RNA e viene eseguita la qPCR per convalidare la qualità della separazione, quantificata dalla quantità di RNA nucleare e citoplasmatico nelle diverse frazioni. Sono stati raggiunti livelli di separazione statisticamente significativi, che illustrano l'efficacia del protocollo. Inoltre, questo sistema può essere adattato per l'isolamento di diversi tipi di RNA (RNA totale, piccolo, ecc.), Il che consente uno studio mirato delle interazioni citoplasma-nucleo e aiuta a comprendere le differenze nella funzione dell'RNA che risiedono nel nucleo e nel citoplasma.

Introduzione

Il frazionamento cellulare in componenti subcellulari consente l'isolamento e lo studio di domini biochimici definiti e aiuta a determinare la localizzazione di specifici processi cellulari e come questo può influire sulla loro funzione¹. L'isolamento dell'RNA da diverse posizioni intracellulari può consentire una migliore accuratezza dell'analisi genetica e biochimica degli eventi a livello di trascrizione e di altre interazioni tra il nucleo e il citoplasma, che funge da scopo primario dell'attuale protocollo². Questo protocollo è stato sviluppato per garantire l'isolamento degli RNA citoplasmatici e nucleari per determinare i loro rispettivi ruoli nell'esportazione nucleare e per capire come la localizzazione subcellulare degli RNA nel nucleo e nel citoplasma possa influire sulla loro funzione nei processi cellulari. Utilizzando materiali provenienti da un tipico ambiente di laboratorio, è stato possibile ottenere il frazionamento nucleare e citoplasmatico in modo più efficace e meno costoso rispetto ai protocolli precedentemente stabiliti senza compromettere la qualità dei risultati³.

Inoltre, lo scambio di molecole tra il citoplasma e il nucleo può essere studiato direttamente separando queste regioni. Più specificamente, la comprensione del trascrittoma è essenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia. Tuttavia, gli RNA possono essere a diversi livelli di maturazione in un dato momento e possono complicare l'analisi a valle. Questo protocollo consente la capacità di isolare l'RNA da frazioni subcellulari nucleari e citoplasmatiche, che possono aiutare negli studi dell'RNA e consentire una migliore comprensione di un particolare RNA di interesse, come la localizzazione di RNA non codificanti o l'analisi delle giunzioni di giunzione all'interno del nucleo.

Questo protocollo è stato ottimizzato per isolare RNA lunghi citoplasmatici e nucleari, inclusi mRNA, rRNA e RNA lunghi non codificanti (lncRNA), a causa della selettività dimensionale della colonna di purificazione dell'RNA utilizzata, che può essere modificata per isolare altri RNA di interesse. In precedenza, la funzione degli RNA lunghi, come mRNA e lncRNA, dipendeva fortemente dalla loro rispettiva localizzazione all'interno della cellula ^4,5. Pertanto, lo studio dell'esportazione dal nucleo ai domini subcellulari è diventato più mirato verso la comprensione del ruolo che l'esportazione di RNA o altri componenti cellulari può avere sulla cellula. Gli lncRNA servono come primo esempio di questo, poiché la loro traduzione e i successivi effetti si basano in gran parte sulla vicinanza e sulle interazioni con altre forme di RNA⁶. Inoltre, lo scambio di elementi cellulari tra regioni nucleari e citoplasmatiche è legato a meccanismi di resistenza a vari trattamenti antitumorali⁷. L'isolamento dei compartimenti intracellulari ha permesso lo sviluppo di inibitori nucleari dell'esportazione, che ha ridotto gli effetti dei meccanismi di resistenza a diverse terapie⁸.

Dopo aver separato l'RNA nucleare e citoplasmatico, vengono eseguiti passaggi per purificare l'RNA di interesse. Poiché i kit di purificazione dell'RNA si trovano comunemente all'interno dei laboratori e funzionano per purificare e isolare gli RNA lunghi, servono bene allo scopo di questo protocollo. Per la purificazione dell'RNA, generare rapporti 260:280 superiori a 1,8 è fondamentale per garantire la qualità dei campioni per il sequenziamento dell'RNA o altre procedure simili che richiedono alti livelli di purezza e isolamento. Valori irregolari di 260:280 indicano contaminazione da fenolo, dimostrando uno scarso isolamento e producendo risultati imprecisi⁹.

Una volta completata la purificazione dell'RNA e confermati valori 260:280 al di sopra di un intervallo accettabile, la qPCR è stata utilizzata per convalidare i risultati di isolamento delle frazioni nucleari e citoplasmatiche. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo protocollo, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati come marcatori nucleari e citoplasmatici, rispettivamente¹⁰. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1, mentre il frazionamento citoplasmatico dovrebbe essere basso. Al contrario, quando viene utilizzato TUG1, i livelli di frazionamento citoplasmatico dovrebbero essere superiori ai livelli di frazionamento nucleare.

Utilizzando questo protocollo, è stato possibile isolare gli RNA in base alla loro posizione di azione all'interno della cellula. A causa dell'ampio accesso a molti materiali e dell'utilizzo del solo tampone di lisi e delle tecniche di centrifugazione basate sulla densità durante questo esperimento, l'applicabilità ad altri tipi di RNA e ad altri componenti cellulari è diffusa. Questo può fornire informazioni importanti facendo luce su eventi di espressione specifici della posizione che altrimenti sarebbero indistinguibili senza separazione.

Protocollo

Le cellule K562 sono utilizzate per il presente studio. Questo protocollo è stato ottimizzato per funzionare per 1 x 10 6-5 x 10^{6 milioni} di celle. Tuttavia, la procedura può essere scalata per quantità di celle maggiori aumentando i volumi in modo appropriato.

1. Preparazione del tampone di lisi 0,25x

1. Preparare un tampone di lisi 0,25x miscelando i seguenti componenti forniti nella Tabella 1A.
   NOTA: I campioni richiedono circa 300 μL di tampone di lisi 0,25x. Volume consigliato = numero di campioni x 300 μL.

2. Separazione delle frazioni nucleari e citoplasmatiche

1. Pellettare le celle utilizzando tubi da 1,5 ml tramite centrifugazione per 5 minuti a 2000 x g (temperatura ambiente). Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta aspirante.
   NOTA: durante questo protocollo sono state utilizzate cellule K562. Tuttavia, il protocollo può essere adattato a varie linee cellulari.
2. Risospendere il pellet in 300 μL di tampone di lisi 0,25x ghiacciato.
   NOTA: Tenere in ghiaccio per 2 minuti e ruotare il tubo ogni 45 s per garantire una corretta lisi delle cellule.
3. Ruotare i tubi alla massima velocità (12.000 x g) a 4 °C per 2 minuti.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante e metterlo in un nuovo tubo da 1,5 ml. Questa sarà la frazione citoplasmatica. Saranno raggiunti circa 300 μL della frazione citoplasmatica.
5. Il pellet rimanente sarà la frazione nucleare. Aggiungere 500 μL di PBS ghiacciato al pellet e centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Durante questa fase, il DNA in eccesso viene rimosso.

3. Pulizia dell'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA

NOTA: Questo protocollo è stato realizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).

1. Separare i campioni di RNA citoplasmatico e i campioni citoplasmatici nucleari (poiché le fasi di frazionamento variano tra di loro).
   1. Per separare la frazione citoplasmatica, aggiungere 1.050 μL di tampone di lisi RLT 3,5x (vedere la tabella dei materiali) e vortice brevemente. Quindi, aggiungere 750 μL di etanolo al 90% e caricarlo sulla colonna dal kit di pulizia dell'RNA.
      NOTA: la soluzione deve essere ben miscelata prima di caricarla sulla colonna.
   2. Per separare la frazione nucleare, aggiungere 600 μL di tampone di lisi 3,5x e vortice. Quindi, aggiungere 600 μL di etanolo al 70%.
2. Caricare sia le frazioni citoplasmatiche che quelle nucleari su colonne di RNA (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Per il resto della fase 3, sia i campioni citoplasmatici che quelli nucleari seguono la stessa procedura. Tuttavia, assicurarsi che questi campioni rimangano indipendenti l'uno dall'altro.
   1. Caricare sia le frazioni citoplasmatiche che nucleari su colonne di RNA e ruotare per 30 s a 8.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il flusso in eccesso attraverso.
   2. Aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio da un kit di purificazione disponibile in commercio (tampone RW1, vedere la tabella dei materiali), centrifugare di nuovo ed eliminare il flusso attraverso.
   3. Aggiungere la soluzione di DNAse (1U/uL) per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio, girare di nuovo e scartare il flusso attraverso.
   4. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio delicato (RPE; vedere la tabella dei materiali), centrifugare di nuovo ed eliminare il flusso attraverso. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio delicato, centrifugare di nuovo, ma solo per 2 minuti.
   5. Spostare la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere 30 μL di acqua alla colonna di rotazione. Lasciare riposare la colonna per 1 minuto prima di girare.

4. Validazione della separazione nucleare-citoplasmatica

1. Eseguire la sintesi del cDNA
   1. Una volta estratti e purificati i compartimenti subcellulari di RNA, confermare la separazione dei compartimenti mediante qPCR. Per fare ciò, in primo luogo, convertire l'RNA in cDNA utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
   2. Preparare il mastermix di trascrittasi inversa. Aggiungi modello di RNA. Incubare le reazioni in un termociclatore.
      NOTA: per gli esameri casuali, i parametri ciclici utilizzati sono riportati nella tabella 2A. Usare immediatamente la reazione della trascrittasi inversa o conservare a -20 °C (Tabella 1B).
2. Eseguire la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e l'analisi.
   1. Diluire la sintesi del cDNA con acqua DEPC (vedere Tabella dei Materiali) per ottenere una concentrazione finale di 20 ng/mL.
   2. Utilizzando una miscela master PCR, preparare la reazione per ciascun campione utilizzando le istruzioni manuali elencate di seguito.
   3. Acquisire sonde commerciali necessarie per rilevare il frazionamento citoplasmatico e nucleare. Utilizzare MALAT1 come marcatore nucleare e TUG1 come marcatore citoplasmatico (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: le sequenze per MALAT1 e TUG1 sono fornite nella Tabella 3.
   4. Calcolare il volume di ciascun componente moltiplicando ciascun componente per 3 per ciascuna delle repliche tecniche per il singolo campione.
   5. Per ciascun campione nucleare e citoplasmatico, acquisire le seguenti miscele per ciascuno: (a) frazione nucleare con MALAT1, (b) frazione citoplasmatica con MALAT1, (c) frazione nucleare con TUG1 e (d) frazione citoplasmatica con TUG1 (tabella 1C).
   6. Vortice per miscelare brevemente le soluzioni e trasferire 20 μL della miscela in ciascun pozzetto di una piastra di reazione ottica (vedi tabella dei materiali).
   7. Coprire la piastra con una pellicola adesiva trasparente utilizzata per qPCR (vedere Tabella dei materiali) e centrifugare brevemente la piastra per eliminare le bolle d'aria, quindi ruotare il campione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   8. Utilizzando un software di progettazione e analisi (vedi Tabella dei materiali), selezionare la curva standard per i parametri ciclici (Tabella 2B).
   9. Utilizzando il software qPCR, selezionare Imposta esecuzione (Figura supplementare 1).
   10. Nella pagina Proprietà file di dati selezionare Metodo e parametri del ciclo di input dalla tabella 2B (figura supplementare 2).
   11. Dopo aver inserito i parametri del ciclo, selezionare la scheda Piastra e immettere i campioni da eseguire (Figura 3 supplementare). Seleziona Avvia esecuzione.
       NOTA: I passaggi descritti sono stati eseguiti in una macchina qPCR utilizzando un master mix disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
3. Eseguire l'analisi dei dati
   1. Al termine dell'esecuzione, creare un foglio di calcolo dei dati con il nome dell'esempio, il nome della destinazione e il ciclo di quantificazione (Cq) (tabella supplementare 1).
   2. Inizia con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione nucleare. Sottrarre la frazione citoplasmatica MALAT1 dalla frazione nucleare MALAT1 (Tabella 4).
   3. Quindi, calcolare il ΔCq (2^(-valore)) (Tabella 5).
   4. Continuare con i campioni MALAT1 per calcolare la frazione citoplasmatica, sottrarre la frazione nucleare MALAT1 dalla frazione citoplasmatica MALAT1 e quindi calcolare il ΔCq (2^(-valore)) (Tabella 6).
      NOTA: Osservando il ΔCq, si osserva che la frazione nucleare MALAT1 (evidenziazione verde) ha un marcatore MALAT1 maggiore rispetto al citoplasma (evidenziazione rossa), ma ora è necessaria la conferma per garantire che la frazione citoplasmatica sia prevalentemente citoplasma e che la frazione nucleare non contenga contaminazione citoplasmatica.
   5. Con i campioni TUG1, eseguire lo stesso calcolo di cui sopra (passaggi 4.3.2-4.3.4) (Tabella 7).
      NOTA: Osservando il ΔCq, si osserva che la frazione citoplasmatica TUG1 (evidenziazione verde) ha un marcatore TUG1 maggiore rispetto alla frazione nucleare (evidenziazione rossa), confermando così una buona separazione delle frazioni citoplasmatiche e nucleari (Tabella 8, Figura 1).

Risultati

Per garantire che l'isolamento nucleare e citoplasmatico fosse stato raggiunto, è stata eseguita una qPCR per convalidare i risultati. In tal modo, sono stati utilizzati primer specifici per la regione di interesse per dimostrare i livelli di frazionamento nucleare e citoplasmatico. In questo studio, MALAT1 e TUG1 sono stati utilizzati rispettivamente come primer nucleari e citoplasmatici. Insieme, consentono la dimostrazione di alti livelli di frazionamento nucleare con MALAT1 come controllo positivo per gli elementi n...

Discussione

Durante tutto il protocollo, sono stati presi alcuni passaggi per ottimizzare gli elementi per essere più efficaci per la linea cellulare di interesse. Mentre i passaggi all'interno del protocollo sono relativamente semplici, possono essere necessarie analisi e piccoli aggiustamenti durante gli aspetti critici del protocollo. Il passo più critico nel protocollo è modificare la concentrazione del tampone di lisi in una concentrazione appropriata basata sulla linea cellulare di interesse e sul bersaglio cellulare. Poich...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.