Preparación de ARN largos citoplasmáticos y nucleares a partir de células primarias y cultivadas

Resumen

El presente protocolo ofrece un método eficiente y flexible para aislar ARN de fracciones nucleares y citoplasmáticas utilizando células cultivadas, y luego validar mediante qPCR. Esto sirve efectivamente como un reemplazo para otros kits de preparación de ARN.

Resumen

La separación de componentes intracelulares ha sido una herramienta clave en biología celular durante muchos años y ha sido capaz de proporcionar información útil sobre cómo su ubicación puede afectar su función. En particular, la separación del ARN nuclear y citoplasmático se ha vuelto importante en el contexto de las células cancerosas y la búsqueda de nuevos objetivos para los medicamentos. La compra de kits para la extracción de ARN citoplasmático nuclear puede ser costosa cuando muchos de los materiales requeridos se pueden encontrar dentro de un entorno de laboratorio típico. Usando el método actual, que puede reemplazar kits más costosos u otros procesos que consumen mucho tiempo, solo se necesita un amortiguador de lisis casero, una centrífuga de sobremesa y columnas de purificación de aislamiento de ARN para aislar el ARN nuclear y citoplasmático. El tampón de lisis se utiliza para lisar suavemente la membrana externa de la célula sin afectar la integridad de la envoltura nuclear, lo que permite liberar sus componentes intracelulares. Luego, los núcleos pueden aislarse mediante un simple paso de centrifugación, ya que poseen una densidad mayor que la solución de lisis. La centrifugación se utiliza para separar estas áreas en función de sus diferencias de densidad para aislar los elementos subcelulares en el núcleo de los del citoplasma. Una vez que la centrifugación ha aislado los diferentes componentes, se utiliza un kit de limpieza de ARN para purificar el contenido de ARN, y se realiza qPCR para validar la calidad de separación, cuantificada por la cantidad de ARN nuclear y citoplasmático en las diferentes fracciones. Se alcanzaron niveles estadísticamente significativos de separación, lo que ilustra la efectividad del protocolo. Además, este sistema se puede adaptar para el aislamiento de diferentes tipos de ARN (total, ARN pequeño, etc.), lo que permite el estudio específico de las interacciones citoplasma-núcleo y ayuda a comprender las diferencias en la función del ARN que residen en el núcleo y el citoplasma.

Introducción

El fraccionamiento celular en componentes subcelulares permite el aislamiento y estudio de dominios bioquímicos definidos y ayuda a determinar la localización de procesos celulares específicos y cómo esto puede afectar su función¹. El aislamiento de ARN de diferentes ubicaciones intracelulares puede permitir una mayor precisión del análisis genético y bioquímico de los eventos a nivel de transcripción y otras interacciones entre el núcleo y el citoplasma, que sirve como el propósito principal del protocolo actual². Este protocolo fue desarrollado para asegurar el aislamiento de ARN citoplasmáticos y nucleares para determinar sus respectivos roles en la exportación nuclear y para comprender cómo la localización subcelular de ARN en el núcleo y el citoplasma puede afectar su función en los procesos celulares. Utilizando materiales de un entorno típico de laboratorio, fue posible lograr el fraccionamiento nuclear y citoplasmático de manera más efectiva y menos costosa que los protocolos previamente establecidos sin poner en peligro la calidad de los resultados³.

Además, el intercambio de moléculas entre el citoplasma y el núcleo se puede estudiar directamente separando estas regiones. Más específicamente, comprender el transcriptoma es esencial para comprender el desarrollo y la enfermedad. Sin embargo, los ARN pueden estar en diferentes niveles de maduración en un momento dado y pueden complicar el análisis posterior. Este protocolo permite la capacidad de aislar ARN de fracciones subcelulares nucleares y citoplasmáticas, lo que puede ayudar en los estudios de ARN y permitir una mejor comprensión de un ARN particular de interés, como la localización de ARN no codificantes o el análisis de uniones de empalme dentro del núcleo.

Este protocolo ha sido optimizado para aislar ARN largos citoplasmáticos y nucleares, incluidos ARNm, ARNr y ARN largos no codificantes (lncRNAs), debido a la selectividad de tamaño de la columna de purificación de ARN utilizada, que puede modificarse para aislar otros ARN de interés. Anteriormente, la función de los ARN largos, como los ARNm y los ARNlnc, dependía en gran medida de su respectiva localización dentro de la célula ^4,5. Por lo tanto, el estudio de la exportación del núcleo a los dominios subcelulares se ha dirigido más hacia la comprensión del papel que la exportación de ARN u otros componentes celulares puede tener en la célula. Los lncRNAs sirven como un excelente ejemplo de esto, ya que su traducción y efectos posteriores dependen en gran medida de la proximidad y las interacciones con otras formas de ARN⁶. Además, el intercambio de elementos celulares entre las regiones nuclear y citoplasmática está relacionado a mecanismos de resistencia a diversos tratamientos contra el cáncer⁷. El aislamiento de compartimentos intracelulares ha permitido el desarrollo de inhibidores de la exportación nuclear, lo que ha disminuido los efectos de los mecanismos de resistencia a diferentes terapias⁸.

Después de separar el ARN nuclear y citoplasmático, se realizan pasos para purificar el ARN de interés. Dado que los kits de purificación de ARN se encuentran comúnmente dentro de los laboratorios y funcionan para purificar y aislar ARN largos, sirven bien al propósito de este protocolo. Para la purificación de ARN, la generación de proporciones 260:280 superiores a 1,8 es fundamental para garantizar la calidad de las muestras para la secuenciación de ARN u otros procedimientos similares que requieren altos niveles de pureza y aislamiento. Los valores irregulares de 260:280 indican contaminación por fenol, lo que demuestra un aislamiento deficiente y produce resultados inexactos⁹.

Una vez que se completa la purificación del ARN y se confirma que los valores de 260:280 están por encima de un rango aceptable, se utilizó qPCR para validar los resultados de aislamiento de las fracciones nucleares y citoplasmáticas. Al hacerlo, se utilizaron cebadores específicos para la región de interés para demostrar los niveles de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. En este protocolo, MALAT1 y TUG1 fueron utilizados como marcadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente¹⁰. Juntos, permiten la demostración de altos niveles de fraccionamiento nuclear con MALAT1, mientras que se espera que el fraccionamiento citoplasmático sea bajo. Por el contrario, cuando se utiliza TUG1, se espera que los niveles de fraccionamiento citoplasmático sean más altos que los niveles de fraccionamiento nuclear.

Utilizando este protocolo, fue posible aislar ARN en función de su posición de acción dentro de la célula. Debido al acceso generalizado a muchos materiales y la utilización de solo tampón de lisis y técnicas de centrifugación basadas en la densidad durante este experimento, la aplicabilidad a otros tipos de ARN y otros componentes celulares está muy extendida. Esto puede proporcionar información importante al arrojar luz sobre eventos de expresión específicos de la ubicación que de otro modo serían indistinguibles sin separación.

Protocolo

Las células K562 se utilizan para el presente estudio. Este protocolo ha sido optimizado para funcionar para 1 x 10 6-5 x 10⁶ millones de células. Sin embargo, el procedimiento se puede ampliar para cantidades de celdas más grandes aumentando los volúmenes adecuadamente.

1. Preparación del tampón de lisis 0.25x

1. Prepare el tampón de lisis 0.25x mezclando los siguientes componentes proporcionados en la Tabla 1A.
   NOTA: Las muestras requieren aproximadamente 300 μL de tampón de lisis 0.25x. Volumen recomendado = número de muestras x 300 μL.

2. Separación de fracciones nucleares y citoplasmáticas

1. Granular las células utilizando tubos de 1,5 ml mediante centrifugación durante 5 min a 2000 x g (temperatura ambiente). Deseche el sobrenadante con una pipeta aspiradora.
   NOTA: Las células K562 se utilizaron durante este protocolo. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar a varias líneas celulares.
2. Resuspender el pellet en 300 μL de tampón de lisis 0,25x helado.
   NOTA: Mantener en hielo durante 2 minutos y girar el tubo cada 45 s para asegurar la lisis adecuada de las células.
3. Girar los tubos a la velocidad más alta (12.000 x g) a 4 °C durante 2 min.
4. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo de 1,5 ml. Esta será la fracción citoplasmática. Se alcanzarán aproximadamente 300 μL de la fracción citoplasmática.
5. El pellet restante será la fracción nuclear. Añadir 500 μL de PBS helado al pellet y centrifugar a 2.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Durante este paso, se elimina el exceso de ADN.

3. Limpieza de ARN mediante un kit de purificación de ARN

NOTA: Este protocolo se logró utilizando un kit de purificación de ARN disponible comercialmente (ver Tabla de materiales).

1. Separe las muestras de ARN citoplasmático y las muestras citoplasmáticas nucleares (ya que los pasos de fraccionamiento varían entre ellas).
   1. Para separar la fracción citoplasmática, agregue 1,050 μL de tampón de lisis RLT 3.5x (consulte la Tabla de materiales) y vórtice brevemente. Luego, agregue 750 μL de etanol al 90% y cárguelo en la columna del kit de limpieza de ARN.
      NOTA: La solución debe estar bien mezclada antes de cargarla en la columna.
   2. Para separar la fracción nuclear, agregue 600 μL de tampón de lisis 3.5x y vórtice. Luego, agregue 600 μL de etanol al 70%.
2. Cargue las fracciones citoplasmáticas y nucleares en columnas de ARN (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Para el resto del paso 3, tanto las muestras citoplasmáticas como las nucleares siguen el mismo procedimiento. Sin embargo, asegúrese de que estas muestras permanezcan independientes entre sí.
   1. Cargue las fracciones citoplasmáticas y nucleares en columnas de ARN y gire durante 30 s a 8.000 x g a temperatura ambiente. Deseche el exceso de flujo a través.
   2. Agregue 350 μL de tampón de lavado de un kit de purificación disponible comercialmente (tampón RW1, consulte la Tabla de materiales), gire nuevamente y deseche el flujo.
   3. Agregue la solución de DNAsa (1U/uL) durante 15 min a temperatura ambiente. Luego, agregue 350 μL de tampón de lavado, gire nuevamente y deseche el flujo.
   4. Agregue 500 μL de tampón de lavado suave (RPE, consulte la Tabla de materiales), gire nuevamente y deseche el flujo. Agregue 500 μL de tampón de lavado suave, gire nuevamente, pero solo durante 2 minutos.
   5. Mueva la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agregue 30 μL de agua a la columna de centrifugado. Deje reposar la columna durante 1 minuto antes de girar.

4. Validación de la separación nuclear-citoplasmática

1. Realizar la síntesis de ADNc
   1. Una vez extraídos y purificados los compartimentos subcelulares de ARN, confirmar la separación de los compartimentos mediante qPCR. Para hacer esto, primero, convierta el ARN en ADNc utilizando un kit disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   2. Preparar mastermix de transcriptasa inversa. Agregar ARN de plantilla. Incubar reacciones en un termociclador.
      NOTA: Para hexámeros aleatorios, los parámetros de ciclo utilizados se proporcionan en la Tabla 2A. Utilizar inmediatamente la reacción de transcriptasa inversa o conservar a -20 °C (Tabla 1B).
2. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y el análisis.
   1. Diluir la síntesis de ADNc con agua DEPC (ver Tabla de materiales) para tener una concentración final de 20 ng/mL.
   2. Usando una mezcla maestra de PCR, prepare la reacción para cada muestra usando las instrucciones manuales que se enumeran a continuación.
   3. Adquirir sondas comerciales necesarias para detectar fraccionamiento citoplasmático y nuclear. Utilice MALAT1 como marcador nuclear y TUG1 como marcador citoplasmático (ver Tabla de materiales).
      NOTA: Las secuencias para MALAT1 y TUG1 se proporcionan en la Tabla 3.
   4. Calcule el volumen de cada componente multiplicando cada componente por 3 para cada una de las réplicas técnicas para la muestra individual.
   5. Para cada muestra nuclear y citoplasmática, adquiera las siguientes mezclas para cada una: (a) Fracción nuclear con MALAT1, (b) Fracción citoplasmática con MALAT1, (c) Fracción nuclear con TUG1, y (d) Fracción citoplasmática con TUG1 (Tabla 1C).
   6. Vórtice brevemente para mezclar soluciones y transferir 20 μL de la mezcla a cada pocillo de una placa de reacción óptica (ver Tabla de materiales).
   7. Cubra la placa con una película adhesiva transparente utilizada para qPCR (consulte la Tabla de materiales) y centrifugue la placa brevemente para eliminar las burbujas de aire, y luego gire la muestra a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   8. Utilizando software de diseño y análisis (consulte Tabla de materiales), seleccione la curva estándar para los parámetros de ciclo (Tabla 2B).
   9. Utilizando el software qPCR, seleccione Configurar ejecución (Figura complementaria 1).
   10. En la página Propiedades del archivo de datos, seleccione Método y parámetros del ciclo de entrada en la Tabla 2B (Figura complementaria 2).
   11. Después de introducir los parámetros del ciclo, seleccione la ficha Placa e introduzca las muestras que se van a ejecutar (Figura complementaria 3). Seleccione Iniciar ejecución.
       NOTA: Los pasos descritos se realizaron en una máquina de qPCR utilizando una mezcla maestra disponible comercialmente (ver Tabla de materiales).
3. Realizar análisis de datos
   1. Una vez completada la ejecución, cree una hoja de cálculo de datos con el nombre de la muestra, el nombre del objetivo y el ciclo de cuantificación (Cq) (Tabla complementaria 1).
   2. Comience con las muestras MALAT1 para calcular la fracción nuclear. Reste la fracción citoplasmática MALAT1 de la fracción nuclear MALAT1 (Tabla 4).
   3. Luego, calcule el ΔCq (2^(-value)) (Tabla 5).
   4. Continúe con las muestras MALAT1 para calcular la fracción citoplasmática, reste la fracción nuclear MALAT1 de la fracción citoplasmática MALAT1 y luego calcule el ΔCq (2^(-value)) (Tabla 6).
      NOTA: Al observar el ΔCq, se observa que la fracción nuclear MALAT1 (resaltado verde) tiene un marcador MALAT1 mayor que el citoplasma (resaltado rojo), pero ahora se requiere confirmación para asegurar que la fracción citoplasmática es predominantemente citoplasma y que la fracción nuclear no contiene contaminación citoplasmática.
   5. Con las muestras TUG1, realice el mismo cálculo que el anterior (pasos 4.3.2-4.3.4) (Tabla 7).
      NOTA: Al observar el ΔCq, se observa que la fracción citoplasmática TUG1 (resaltado verde) tiene un marcador TUG1 mayor que la fracción nuclear (resaltado rojo), confirmando así una buena separación de las fracciones citoplasmática y nuclear (Tabla 8, Figura 1).

Resultados

Para asegurar el aislamiento nuclear y citoplasmático, se realizó una qPCR para validar los resultados. Al hacerlo, se utilizaron cebadores específicos de la región de interés para demostrar los niveles de fraccionamiento nuclear y citoplasmático. En este estudio, MALAT1 y TUG1 se utilizaron como cebadores nucleares y citoplasmáticos, respectivamente. Juntos, permiten la demostración de altos niveles de fraccionamiento nuclear con MALAT1 como un control positivo para elementos nucleares, mientras que se espera qu...

Discusión

A lo largo del protocolo, se tomaron algunas medidas para optimizar los elementos para que sean más efectivos para la línea celular de interés. Si bien los pasos dentro del protocolo son relativamente sencillos, puede ser necesario un análisis y ajustes menores durante los aspectos críticos del protocolo. El paso más crítico en el protocolo es modificar la concentración del tampón de lisis a una concentración adecuada basada en la línea celular de interés y el objetivo celular. Dado que la utilización del ta...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.