Получение цитоплазматических и ядерных длинных РНК из первичных и культивируемых клеток

Резюме

Настоящий протокол предлагает эффективный и гибкий метод выделения РНК из ядерных и цитоплазматических фракций с использованием культивируемых клеток с последующей валидацией с помощью кПЦР. Это эффективно служит заменой другим наборам для подготовки РНК.

Аннотация

Разделение внутриклеточных компонентов было ключевым инструментом в клеточной биологии в течение многих лет и могло дать полезную информацию о том, как их расположение может повлиять на их функцию. В частности, разделение ядерной и цитоплазматической РНК стало важным в контексте раковых клеток и поиска новых мишеней для лекарств. Покупка наборов для экстракции ядерно-цитоплазматической РНК может быть дорогостоящей, когда многие из необходимых материалов можно найти в типичных лабораторных условиях. Используя настоящий метод, который может заменить более дорогие наборы или другие трудоемкие процессы, для выделения ядерной и цитоплазматической РНК необходимы только самодельный буфер лизиса, настольная центрифуга и колонки для очистки выделения РНК. Буфер для лизиса используется для мягкого лизиса внешней мембраны клетки, не влияя на целостность ядерной оболочки, что позволяет высвобождать ее внутриклеточные компоненты. Затем ядра могут быть выделены простой стадией центрифугирования, поскольку они обладают более высокой плотностью, чем лизирующий раствор. Центрифугирование используется для разделения этих областей на основе различий в их плотности, чтобы изолировать субклеточные элементы в ядре от элементов цитоплазмы. После того, как центрифугирование изолировало различные компоненты, набор для очистки РНК используется для очистки содержимого РНК, и проводится кПЦР для проверки качества разделения, количественно определяемого количеством ядерной и цитоплазматической РНК в различных фракциях. Были достигнуты статистически значимые уровни разделения, иллюстрирующие эффективность протокола. Кроме того, эта система может быть адаптирована для выделения различных типов РНК (общей, малой РНК и т. д.), что позволяет целенаправленно изучать взаимодействия цитоплазмы и ядра и помогает понять различия в функциях РНК, которые находятся в ядре и цитоплазме.

Введение

Клеточное фракционирование на субклеточные компоненты позволяет выделять и изучать определенные биохимические домены и помогает определить локализацию конкретных клеточных процессов и то, как это может повлиять на их функцию¹. Выделение РНК из различных внутриклеточных локаций может позволить повысить точность генетического и биохимического анализа событий на уровне транскрипции и других взаимодействий между ядром и цитоплазмой, что служит основной целью текущего протокола². Этот протокол был разработан для обеспечения выделения цитоплазматических и ядерных РНК для определения их соответствующих ролей в ядерном экспорте и понимания того, как субклеточная локализация РНК в ядре и цитоплазме может влиять на их функцию в клеточных процессах. Используя материалы из типичных лабораторных условий, удалось добиться ядерного и цитоплазматического фракционирования более эффективно и с меньшими затратами, чем ранее установленные протоколы, не ставя под угрозу качество результатов³.

Кроме того, обмен молекулами между цитоплазмой и ядром можно изучать непосредственно путем разделения этих областей. В частности, понимание транскриптома имеет важное значение для понимания развития и болезни. Однако РНК могут находиться на разных уровнях созревания в любой момент времени и могут усложнить последующий анализ. Этот протокол позволяет изолировать РНК из ядерных и цитоплазматических субклеточных фракций, что может помочь в исследованиях РНК и позволить лучше понять конкретную интересующую РНК, например, локализацию некодирующих РНК или анализ сплайс-соединений в ядре.

Этот протокол был оптимизирован для выделения цитоплазматических и ядерных длинных РНК, включая мРНК, рРНК и длинные некодирующие РНК (днРНК), из-за селективности по размеру используемой колонки очистки РНК, которая может быть модифицирована для выделения других интересующих РНК. Ранее функция длинных РНК, таких как мРНК и днРНК, сильно зависела от их соответствующей локализации в клетке ^4,5. Таким образом, изучение экспорта из ядра в субклеточные домены стало более направленным на понимание роли, которую экспорт РНК или других клеточных компонентов может играть в клетке. днРНК служат ярким примером этого, поскольку их трансляция и последующие эффекты в значительной степени зависят от близости и взаимодействия с другими формами РНК⁶. Кроме того, обмен клеточными элементами между ядерными и цитоплазматическими областями связан с механизмами резистентности к различным методам лечения рака⁷. Выделение внутриклеточных компартментов позволило разработать ингибиторы ядерного экспорта, что уменьшило эффекты механизмов резистентности к различным методам лечения⁸.

После разделения ядерной и цитоплазматической РНК выполняются этапы очистки интересующей РНК. Поскольку наборы для очистки РНК обычно встречаются в лабораториях и функционируют для очистки и выделения длинных РНК, они хорошо служат целям этого протокола. Для очистки РНК создание соотношения 260:280 более 1,8 имеет решающее значение для обеспечения качества образцов для секвенирования РНК или других подобных процедур, требующих высокого уровня чистоты и выделения. Нерегулярные значения 260:280 указывают на загрязнение фенолом, демонстрируя плохую изоляцию и давая неточные результаты⁹.

После завершения очистки РНК и подтверждения того, что значения 260:280 превышают допустимый диапазон, для проверки результатов выделения ядерной и цитоплазматической фракций использовали кПЦР. При этом были использованы праймеры, специфичные для интересующей области, для демонстрации уровней ядерного и цитоплазматического фракционирования. В этом протоколе MALAT1 и TUG1 использовались в качестве ядерных и цитоплазматических маркеров соответственно¹⁰. Вместе они позволяют продемонстрировать высокие уровни ядерного фракционирования с MALAT1, в то время как цитоплазматическое фракционирование, как ожидается, будет низким. И наоборот, при использовании TUG1 ожидается, что уровни цитоплазматического фракционирования будут выше, чем уровни ядерного фракционирования.

Используя этот протокол, можно было выделить РНК на основе их положения действия в клетке. Из-за широкого доступа ко многим материалам и использования только лизисного буфера и методов центрифугирования на основе плотности во время этого эксперимента широко распространена применимость к другим типам РНК и другим клеточным компонентам. Это может предоставить важную информацию, проливая свет на события выражения, зависящие от местоположения, которые в противном случае были бы неразличимы без разделения.

протокол

Для настоящего исследования используются клетки K562. Этот протокол был оптимизирован для работы с 1 x 10^6-5 x 10⁶ миллионами ячеек. Тем не менее, процедура может быть расширена для больших количеств клеток путем соответствующего увеличения объемов.

1. Приготовление 0,25-кратного лизисного буфера

1. Приготовьте 0,25-кратный буфер лизиса, смешав следующие компоненты, указанные в таблице 1A.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов требуется приблизительно 300 мкл 0,25-кратного буфера для лизиса. Рекомендуемый объем = количество образцов x 300 мкл.

2. Разделение ядерной и цитоплазматической фракций

1. Гранулируйте ячейки с помощью пробирок объемом 1,5 мл с помощью центрифугирования в течение 5 мин при 2000 x g (комнатная температура). Откажитесь от надосадочной жидкости с помощью аспирационной пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого протокола использовались клетки K562. Однако протокол может быть адаптирован к различным клеточным линиям.
2. Ресуспендируют гранулы в 300 мкл ледяного 0,25-кратного лизисного буфера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите на льду в течение 2 минут и вращайте пробирку каждые 45 с, чтобы обеспечить надлежащий лизис клеток.
3. Вращайте пробирки на максимальной скорости (12 000 x g) при 4 ° C в течение 2 мин.
4. После центрифугирования осторожно извлеките надосадочную жидкость и поместите ее в новую пробирку объемом 1,5 мл. Это и будет цитоплазматическая фракция. Будет получено приблизительно 300 мкл цитоплазматической фракции.
5. Оставшаяся гранула будет ядерной фракцией. Добавьте 500 мкл ледяного PBS в гранулу и центрифугу при 2000 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляется лишняя ДНК.

3. Очистка РНК с помощью набора для очистки РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан с использованием коммерчески доступного набора для очистки РНК (см. Таблицу материалов).

1. Разделите образцы цитоплазматической РНК и ядерные цитоплазматические образцы (поскольку стадии фракционирования различаются между ними).
   1. Чтобы отделить цитоплазматическую фракцию, добавьте 1,050 мкл 3,5-кратного буфера лизиса RLT (см. Таблицу материалов) и кратковременно встряхните. Затем добавьте 750 мкл 90% этанола и загрузите его в колонку из набора для очистки РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен быть хорошо перемешан перед загрузкой на колонну.
   2. Чтобы отделить ядерную фракцию, добавьте 600 мкл 3,5-кратного буфера лизиса и вихря. Затем добавьте 600 мкл 70% этанола.
2. Загружайте как цитоплазматические, так и ядерные фракции в колонки РНК (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для остальной части шага 3 цитоплазматические и ядерные образцы следуют одной и той же процедуре. Однако убедитесь, что эти образцы остаются независимыми друг от друга.
   1. Загрузите как цитоплазматические, так и ядерные фракции на колонки РНК и вращайтесь в течение 30 с при 8000 x g при комнатной температуре. Откажитесь от лишнего потока.
   2. Добавьте 350 мкл промывочного буфера из имеющегося в продаже набора для очистки (буфер RW1, см. Таблицу материалов), снова открутите и откажитесь от потока.
   3. Добавьте раствор ДНКазы (1 ЕД / мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавьте 350 мкл промывочного буфера, снова отжмите и откажитесь от потока.
   4. Добавьте 500 мкл мягкого моющего буфера (RPE, см. Таблицу материалов), снова отжимайте и откажитесь от потока. Добавьте 500 мкл мягкого буфера для стирки, снова отжимайте, но только в течение 2 минут.
   5. Переместите колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 30 мкл воды в спиновую колонку. Дайте колонне постоять 1 минуту, прежде чем вращаться.

4. Валидация ядерно-цитоплазматического разделения

1. Выполнение синтеза кДНК
   1. После того, как субклеточные компартменты РНК были извлечены и очищены, подтвердите разделение компартментов с помощью кПЦР. Для этого сначала преобразуйте РНК в кДНК с помощью коммерчески доступного набора, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
   2. Приготовьте мастермикс с обратной транскриптазой. Добавьте матричную РНК. Инкубируйте реакции в термоциклере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для случайных гексамеров используемые параметры цикличности приведены в таблице 2А. Используйте реакцию обратной транскриптазы немедленно или храните при -20 ° C (таблица 1B).
2. Проведите количественную полимеразную цепную реакцию (кПЦР) и анализ.
   1. Разбавьте синтез кДНК водой DEPC (см. Таблицу материалов), чтобы получить конечную концентрацию 20 нг / мл.
   2. Используя мастер-смесь для ПЦР, подготовьте реакцию для каждого образца, используя ручные инструкции, перечисленные ниже.
   3. Приобретите коммерческие зонды, необходимые для обнаружения цитоплазматического и ядерного фракционирования. Используйте MALAT1 в качестве ядерного маркера и TUG1 в качестве цитоплазматического маркера (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для MALAT1 и TUG1 приведены в таблице 3.
   4. Рассчитайте объем каждого компонента, умножив каждый компонент на 3 для каждой из технических реплик для отдельного образца.
   5. Для каждого ядерного и цитоплазматического образца приобретите следующие смеси для каждого: (а) ядерная фракция с MALAT1, (б) цитоплазматическая фракция с MALAT1, (в) ядерная фракция с TUG1 и (г) цитоплазматическая фракция с TUG1 (таблица 1C).
   6. Кратковременно перемешайте растворы и перенесите 20 мкл смеси в каждую лунку оптической реакционной пластины (см. Таблицу материалов).
   7. Накройте пластину прозрачной клейкой пленкой, используемой для кПЦР (см. Таблицу материалов), и ненадолго центрифугируйте пластину, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем открутите образец при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
   8. Используя программное обеспечение для проектирования и анализа (см. Таблицу материалов), выберите стандартную кривую для параметров цикла (таблица 2B).
   9. Используя программное обеспечение qPCR, выберите Set up run (Дополнительный рисунок 1).
   10. На странице Data File Properties (Свойства файла данных) выберите Method and input cycle parameters ( Метод и параметры входного цикла) из таблицы 2B (дополнительный рисунок 2).
   11. После ввода параметров цикла выберите вкладку «Пластина » и введите образцы для запуска (дополнительный рисунок 3). Выберите Начать запуск.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные шаги были выполнены на машине qPCR с использованием коммерчески доступной мастер-смеси (см. Таблицу материалов).
3. Выполнение анализа данных
   1. После завершения выполнения создайте электронную таблицу данных с именем образца, целевым именем и циклом количественной оценки (Cq) (дополнительная таблица 1).
   2. Начните с образцов MALAT1, чтобы рассчитать ядерную фракцию. Вычтите цитоплазматическую фракцию MALAT1 из ядерной фракции MALAT1 (таблица 4).
   3. Затем вычислите ΔCq (2^(-значение)) (таблица 5).
   4. Продолжите работу с образцами MALAT1, чтобы рассчитать цитоплазматическую фракцию, вычтите ядерную фракцию MALAT1 из цитоплазматической фракции MALAT1, а затем рассчитайте ΔCq (2^(-значение)) (таблица 6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глядя на ΔCq, видно, что ядерная фракция MALAT1 (зеленый свет) имеет больший маркер MALAT1, чем цитоплазма (красный свет), но теперь требуется подтверждение, чтобы убедиться, что цитоплазматическая фракция является преимущественно цитоплазмой и что ядерная фракция не содержит цитоплазматического загрязнения.
   5. С образцами TUG1 выполните тот же расчет, что и выше (этапы 4.3.2-4.3.4) (таблица 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глядя на ΔCq, можно заметить, что цитоплазматическая фракция TUG1 (зеленый свет) имеет больший маркер TUG1, чем ядерная фракция (красный свет), что подтверждает хорошее разделение цитоплазматической и ядерной фракций (таблица 8, рис. 1).

Результаты

Чтобы убедиться, что ядерная и цитоплазматическая изоляция была достигнута, была проведена кПЦР для проверки результатов. При этом были использованы праймеры, специфичные для интересующей области, для демонстрации уровней ядерного и цитоплазматического фракционирования. В этом иссл?...

Обсуждение

На протяжении всего протокола были предприняты некоторые шаги для оптимизации элементов, чтобы они были наиболее эффективными для интересующей клеточной линии. Хотя шаги в рамках протокола относительно просты, может потребоваться анализ и незначительные корректировки в критических ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.