Préparation d’ARN longs cytoplasmiques et nucléaires à partir de cellules primaires et en culture

Résumé

Le protocole actuel offre une méthode efficace et flexible pour isoler l’ARN des fractions nucléaires et cytoplasmiques à l’aide de cellules en culture, puis valider à l’aide de la qPCR. Cela sert efficacement de remplacement pour d’autres kits de préparation d’ARN.

Résumé

La séparation des composants intracellulaires est un outil clé en biologie cellulaire depuis de nombreuses années et a permis de fournir des informations utiles sur la façon dont leur emplacement peut avoir un impact sur leur fonction. En particulier, la séparation de l’ARN nucléaire et cytoplasmique est devenue importante dans le contexte des cellules cancéreuses et de la recherche de nouvelles cibles pour les médicaments. L’achat de trousses pour l’extraction d’ARN cytoplasmique nucléaire peut être coûteux lorsque de nombreux matériaux requis peuvent être trouvés dans un laboratoire typique. En utilisant la méthode actuelle, qui peut remplacer des kits plus coûteux ou d’autres processus fastidieux, seuls un tampon de lyse maison, une centrifugeuse de paillasse et des colonnes de purification d’isolement d’ARN sont nécessaires pour isoler l’ARN nucléaire et cytoplasmique. Le tampon de lyse est utilisé pour lyser doucement la membrane externe de la cellule sans affecter l’intégrité de l’enveloppe nucléaire, ce qui permet de libérer ses composants intracellulaires. Ensuite, les noyaux peuvent être isolés par une simple étape de centrifugation puisqu’ils possèdent une densité plus élevée que la solution de lyse. La centrifugation est utilisée pour séparer ces zones en fonction de leurs différences de densité afin d’isoler les éléments subcellulaires du noyau de ceux du cytoplasme. Une fois que la centrifugation a isolé les différents composants, un kit de nettoyage de l’ARN est utilisé pour purifier la teneur en ARN, et la qPCR est réalisée pour valider la qualité de la séparation, quantifiée par la quantité d’ARN nucléaire et cytoplasmique dans les différentes fractions. Des niveaux statistiquement significatifs de séparation ont été atteints, illustrant l’efficacité du protocole. En outre, ce système peut être adapté pour l’isolement de différents types d’ARN (total, petit ARN, etc.), ce qui permet une étude ciblée des interactions cytoplasme-noyau et aide à comprendre les différences dans la fonction de l’ARN qui résident dans le noyau et le cytoplasme.

Introduction

Le fractionnement cellulaire en composants subcellulaires permet d’isoler et d’étudier des domaines biochimiques définis et aide à déterminer la localisation de processus cellulaires spécifiques et comment cela peut affecter leur fonction¹. L’isolement de l’ARN à partir de différents emplacements intracellulaires peut permettre d’améliorer la précision de l’analyse génétique et biochimique des événements au niveau de la transcription et d’autres interactions entre le noyau et le cytoplasme, ce qui constitue l’objectif principal du protocole actuel². Ce protocole a été développé pour assurer l’isolement des ARN cytoplasmiques et nucléaires afin de déterminer leurs rôles respectifs dans l’exportation nucléaire et de comprendre comment la localisation subcellulaire des ARN dans le noyau et le cytoplasme peut avoir un impact sur leur fonction dans les processus cellulaires. En utilisant des matériaux provenant d’un laboratoire typique, il a été possible de réaliser un fractionnement nucléaire et cytoplasmique plus efficace et moins coûteux que les protocoles précédemment établis sans compromettre la qualité des résultats³.

De plus, l’échange de molécules entre le cytoplasme et le noyau peut être étudié directement en séparant ces régions. Plus précisément, la compréhension du transcriptome est essentielle pour comprendre le développement et la maladie. Cependant, les ARN peuvent être à des niveaux de maturation différents à un moment donné et peuvent compliquer l’analyse en aval. Ce protocole permet d’isoler l’ARN des fractions subcellulaires nucléaires et cytoplasmiques, ce qui peut aider à l’étude de l’ARN et permettre une meilleure compréhension d’un ARN d’intérêt particulier, comme la localisation d’ARN non codants ou l’analyse des jonctions d’épissage dans le noyau.

Ce protocole a été optimisé pour isoler les ARN longs cytoplasmiques et nucléaires, y compris les ARNm, les ARNr et les ARN longs non codants (ARNnc), en raison de la sélectivité de la taille de la colonne de purification de l’ARN utilisée, qui peut être modifiée pour isoler d’autres ARN d’intérêt. Auparavant, la fonction des ARN longs, tels que les ARNm et les ARNnc, dépendait fortement de leur localisation respective dans la cellule ^4,5. Par conséquent, l’étude de l’exportation du noyau vers les domaines subcellulaires est devenue plus ciblée sur la compréhension du rôle que l’exportation d’ARN ou d’autres composants cellulaires peut avoir sur la cellule. Les ARNnc en sont un excellent exemple, car leur traduction et leurs effets ultérieurs reposent en grande partie sur la proximité et les interactions avec d’autres formes d’ARN⁶. De plus, l’échange d’éléments cellulaires entre les régions nucléaires et cytoplasmiques est lié à des mécanismes de résistance à divers traitements contre le cancer⁷. L’isolement des compartiments intracellulaires a permis le développement d’inhibiteurs d’exportation nucléaire, ce qui a atténué les effets des mécanismes de résistance à différentes thérapies⁸.

Après la séparation de l’ARN nucléaire et cytoplasmique, des étapes sont effectuées pour purifier l’ARN d’intérêt. Étant donné que les kits de purification de l’ARN se trouvent couramment dans les laboratoires et fonctionnent pour purifier et isoler les ARN longs, ils servent bien l’objectif de ce protocole. Pour la purification de l’ARN, la génération de rapports 260:280 supérieurs à 1,8 est essentielle pour assurer la qualité des échantillons pour le séquençage de l’ARN ou d’autres procédures similaires nécessitant des niveaux élevés de pureté et d’isolement. Des valeurs irrégulières de 260:280 indiquent une contamination par le phénol, démontrant un mauvais isolement et donnant des résultats inexacts⁹.

Une fois que la purification de l’ARN est terminée et que les valeurs 260:280 sont confirmées comme étant supérieures à une plage acceptable, la qPCR a été utilisée pour valider les résultats d’isolement des fractions nucléaires et cytoplasmiques. Ce faisant, des amorces spécifiques à la région d’intérêt ont été utilisées pour démontrer les niveaux de fractionnement nucléaire et cytoplasmique. Dans ce protocole, MALAT1 et TUG1 ont été utilisés comme marqueurs nucléaires et cytoplasmiques, respectivement¹⁰. Ensemble, ils permettent de démontrer des niveaux élevés de fractionnement nucléaire avec MALAT1, tandis que le fractionnement cytoplasmique devrait être faible. Inversement, lorsque TUG1 est utilisé, les niveaux de fractionnement cytoplasmique devraient être plus élevés que les niveaux de fractionnement nucléaire.

En utilisant ce protocole, il a été possible d’isoler les ARN en fonction de leur position d’action dans la cellule. En raison de l’accès généralisé à de nombreux matériaux et de l’utilisation de tampons de lyse et de techniques de centrifugation basées sur la densité au cours de cette expérience, l’applicabilité à d’autres types d’ARN et à d’autres composants cellulaires est répandue. Cela peut fournir des informations importantes en mettant en lumière des événements d’expression spécifiques à un lieu qui seraient autrement impossibles à distinguer sans séparation.

Protocole

Des cellules K562 sont utilisées pour la présente étude. Ce protocole a été optimisé pour fonctionner pour 1 x 10 6-5 x 10⁶ millions de cellules. Cependant, la procédure peut être mise à l’échelle pour de plus grandes quantités de cellules en augmentant les volumes de manière appropriée.

1. Préparation du tampon de lyse 0,25x

1. Préparez un tampon de lyse 0,25x en mélangeant les composants suivants fournis dans le tableau 1A.
   REMARQUE : Les échantillons nécessitent environ 300 μL de tampon de lyse 0,25x. Volume recommandé = nombre d’échantillons x 300 μL.

2. Séparation des fractions nucléaire et cytoplasmique

1. Ensemencer les cellules à l’aide de tubes de 1,5 mL par centrifugation pendant 5 min à 2000 x g (température ambiante). Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette d’aspiration.
   REMARQUE: Les cellules K562 ont été utilisées pendant ce protocole. Cependant, le protocole peut être adapté à différentes lignées cellulaires.
2. Remettez la pastille en suspension dans 300 μL de tampon de lyse 0,25x glacé.
   REMARQUE: Garder sur la glace pendant 2 minutes et tourner le tube toutes les 45 s pour assurer une bonne lyse des cellules.
3. Faire tourner les tubes à la vitesse maximale (12 000 x g) à 4 °C pendant 2 min.
4. Après la centrifugation, retirez délicatement le surnageant et placez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ce sera la fraction cytoplasmique. Environ 300 μL de la fraction cytoplasmique seront atteints.
5. La pastille restante sera la fraction nucléaire. Ajouter 500 μL de PBS glacé à la pastille et centrifuger à 2 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: Au cours de cette étape, l’excès d’ADN est retiré.

3. Nettoyage de l’ARN à l’aide d’un kit de purification de l’ARN

REMARQUE : Ce protocole a été réalisé à l’aide d’une trousse de purification de l’ARN disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).

1. Séparez les échantillons d’ARN cytoplasmique et les échantillons cytoplasmiques nucléaires (car les étapes de fractionnement varient d’un individu à l’autre).
   1. Pour séparer la fraction cytoplasmique, ajouter brièvement 1 050 μL de tampon de lyse RLT 3,5x (voir le tableau des matériaux) et le vortex. Ensuite, ajoutez 750 μL d’éthanol à 90% et chargez-le sur la colonne à partir du kit de nettoyage de l’ARN.
      REMARQUE: La solution doit être bien mélangée avant d’être chargée sur la colonne.
   2. Pour séparer la fraction nucléaire, ajoutez 600 μL de tampon de lyse 3,5x et de vortex. Ensuite, ajoutez 600 μL d’éthanol à 70%.
2. Charger les fractions cytoplasmiques et nucléaires sur les colonnes d’ARN (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Pour le reste de l’étape 3, les échantillons cytoplasmiques et nucléaires suivent la même procédure. Cependant, assurez-vous que ces échantillons restent indépendants les uns des autres.
   1. Charger les fractions cytoplasmiques et nucléaires sur les colonnes d’ARN et faire tourner pendant 30 s à 8 000 x g à température ambiante. Jetez l’excès de débit.
   2. Ajouter 350 μL de tampon de lavage à partir d’un kit de purification disponible dans le commerce (tampon RW1, voir le tableau des matériaux), essorer à nouveau et éliminer le flux.
   3. Ajouter la solution de DNAse (1U/uL) pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez 350 μL de tampon de lavage, essorez à nouveau et jetez le flux à travers.
   4. Ajouter 500 μL de tampon de lavage doux (RPE, voir le tableau des matériaux), tourner à nouveau et éliminer l’écoulement. Ajouter 500 μL de tampon de lavage doux, tourner à nouveau, mais seulement pendant 2 min.
   5. Déplacez la colonne vers un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL et ajoutez 30 μL d’eau à la colonne de rotation. Laissez la colonne reposer pendant 1 min avant de tourner.

4. Validation de la séparation nucléo-cytoplasmique

1. Effectuer la synthèse de l’ADNc
   1. Une fois que les compartiments subcellulaires de l’ARN ont été extraits et purifiés, confirmer la séparation des compartiments à l’aide de la qPCR. Pour ce faire, il faut d’abord convertir l’ARN en ADNc à l’aide d’un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   2. Préparer le mastermix de transcriptase inverse. Ajouter un ARN modèle. Incuber les réactions dans un thermocycleur.
      REMARQUE : Pour les hexamères aléatoires, les paramètres de cyclage utilisés sont fournis dans le tableau 2A. Utiliser immédiatement la réaction de transcriptase inverse ou conserver à -20 °C (tableau 1B).
2. Effectuer la réaction en chaîne quantitative de la polymérase (qPCR) et l’analyse.
   1. Diluer la synthèse de l’ADNc avec de l’eau DEPC (voir le tableau des matériaux) pour obtenir une concentration finale de 20 ng/mL.
   2. À l’aide d’un mélange maître PCR, préparer la réaction pour chaque échantillon en suivant les instructions manuelles énumérées ci-dessous.
   3. Acquérir les sondes commerciales nécessaires pour détecter le fractionnement cytoplasmique et nucléaire. Utiliser MALAT1 comme marqueur nucléaire et TUG1 comme marqueur cytoplasmique (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les séquences pour MALAT1 et TUG1 sont fournies dans le tableau 3.
   4. Calculez le volume de chaque composant en multipliant chaque composant par 3 pour chacune des répliques techniques pour l’échantillon individuel.
   5. Pour chaque échantillon nucléaire et cytoplasmique, obtenir les mélanges suivants pour chacun : (a) Fraction nucléaire avec MALAT1, (b) Fraction cytoplasmique avec MALAT1, (c) Fraction nucléaire avec TUG1, et (d) Fraction cytoplasmique avec TUG1 (Tableau 1C).
   6. Vortex brièvement pour mélanger les solutions et transférer 20 μL du mélange dans chaque puits d’une plaque de réaction optique (voir le tableau des matériaux).
   7. Couvrir la plaque avec un film adhésif transparent utilisé pour la qPCR (voir le tableau des matériaux) et centrifuger brièvement la plaque pour éliminer les bulles d’air, puis faire tourner l’échantillon à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
   8. À l’aide d’un logiciel de conception et d’analyse (voir le tableau des matériaux), sélectionnez la courbe standard pour les paramètres de cyclage (tableau 2B).
   9. À l’aide du logiciel qPCR, sélectionnez Configurer l’exécution (Figure supplémentaire 1).
   10. Dans la page Propriétés du fichier de données, sélectionnez Paramètres de méthode et de cycle d’entrée dans le tableau 2B (Figure supplémentaire 2).
   11. Après avoir entré les paramètres du cycle, sélectionnez l’onglet Plaque et entrez les échantillons à exécuter (Figure supplémentaire 3). Sélectionnez Démarrer l’exécution.
       REMARQUE : Les étapes décrites ont été effectuées dans une machine qPCR à l’aide d’un mélange maître disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
3. Effectuer une analyse des données
   1. Une fois l’exécution terminée, créez une feuille de calcul de données avec le nom de l’échantillon, le nom de la cible et le cycle de quantification (Cq) (tableau supplémentaire 1).
   2. Commencez par les échantillons MALAT1 pour calculer la fraction nucléaire. Soustraire la fraction cytoplasmique MALAT1 de la fraction nucléaire MALAT1 (tableau 4).
   3. Ensuite, calculez le ΔCq (2^(-value)) (Tableau 5).
   4. Continuez avec les échantillons MALAT1 pour calculer la fraction cytoplasmique, soustrayez la fraction nucléaire MALAT1 de la fraction cytoplasmique MALAT1, puis calculez la ΔCq (2^(-value)) (Tableau 6).
      NOTE: En regardant le ΔCq, on observe que la fraction nucléaire MALAT1 (surbrillance verte) a un marqueur MALAT1 plus grand que le cytoplasme (surbrillance rouge), mais maintenant une confirmation est nécessaire pour s’assurer que la fraction cytoplasmique est principalement du cytoplasme et que la fraction nucléaire ne contient pas de contamination cytoplasmique.
   5. Avec les échantillons TUG1, effectuez le même calcul que ci-dessus (étapes 4.3.2-4.3.4) (tableau 7).
      NOTE: En regardant le ΔCq, on observe que la fraction cytoplasmique TUG1 (surbrillance verte) a un marqueur TUG1 plus grand que la fraction nucléaire (surbrillance rouge), confirmant ainsi une bonne séparation des fractions cytoplasmiques et nucléaires (Tableau 8, Figure 1).

Résultats

Pour s’assurer que l’isolement nucléaire et cytoplasmique avait été réalisé, une qPCR a été effectuée pour valider les résultats. Ce faisant, des amorces spécifiques à la région d’intérêt ont été utilisées pour démontrer les niveaux de fractionnement nucléaire et cytoplasmique. Dans cette étude, MALAT1 et TUG1 ont été utilisés comme amorces nucléaires et cytoplasmiques, respectivement. Ensemble, ils permettent de démontrer des niveaux élevés de fractionnement nucléaire avec MALAT1 comme ...

Discussion

Tout au long du protocole, certaines mesures ont été prises pour optimiser les éléments afin qu’ils soient les plus efficaces pour la lignée cellulaire d’intérêt. Bien que les étapes du protocole soient relativement simples, une analyse et des ajustements mineurs au cours des aspects critiques du protocole peuvent être nécessaires. L’étape la plus critique du protocole consiste à modifier la concentration du tampon de lyse à une concentration appropriée basée sur la lignée cellulaire d’intérêt e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.