JoVE Logo

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد اختبار ربط القرب تقنية مفيدة للغاية لتحديد وتحديد مثيلة الأرجينين لبروتين معين عندما تكون بقايا الأرجينين المعدلة غير معروفة و / أو إذا لم يكن هناك جسم مضاد محدد متاح.

Abstract

تظهر مثيلة الأرجينين كتعديل رئيسي بعد الترجمة يشارك في مجموعة كبيرة من العمليات البيولوجية. غالبا ما تكون دراستها في الأنسجة محدودة بسبب عدم وجود جسم مضاد محدد يتعرف على بقايا الأرجينين المستهدفة. تم تطوير مقايسة ربط القرب (PLA) في الأصل لدراسة تفاعلات البروتين / البروتين. هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكول PLA المخصص للكشف عن مثيلة الأرجينين التي طبقناها على مستقبلات الجلوكوكورتيكويد (GR). بعد أن أظهرنا سابقا أن PRMT5 ثنائي ميثيل GRs في الخلايا ، استخدمنا PLA مع جسم مضاد ثنائي ميثيل متماثل وجسم مضاد مضاد للGR لقياس مثيلة GR في أورام الثدي. نوضح أن PLA يقدم نهجا فريدا لقياس مثيلة الأرجينين للبروتين المستهدف ، حتى عندما لا يتم تحديد موقع الميثيل. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل تعديلات أخرى بعد الترجمة حيث تتوفر أجسام مضادة فعالة للعموم. ومن ثم ، فإننا نفصل تقنية PLA المستخدمة للكشف عن مثيلة الأرجينين في الأنسجة الثابتة باستخدام GR كمثال.

Introduction

مثيلة الأرجينين بواسطة بروتين ميثيل ترانسفيراز الأرجينين (PRMTs) هي تعديل وفير بعد الترجمة (PTM) يشارك في العديد من العمليات البيولوجية. تحفز PRMTs نقل مجموعات الميثيل من S-adenosyl methionine إلى بقايا الأرجينين. تتكون عائلة PRMT من تسعة أعضاء مصنفين وفقا لنوع المثيلة التي يؤدونها. يقوم جميع الأعضاء بإجراء أحادي الميثيل (MMA). النوع 1 (PRMT1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 8) تحفز PRMTs ثنائي الميثيل غير المتماثل (ADMA) ، في حين أن النوع 2 (PRMT5 و 9) يحفز ثنائي الميثيل المتماثل (SDMA) ، والنوع 3 (PRMT7) يولد MMA1 فقط. من خلال مثيلة العديد من الركائز ، تنظم PRMTs المختلفة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية المهمة مثل إصلاح الحمض النووي ، وتنظيم النسخ ، والاستجابة المناعية ، ومعالجة الحمض النووي الريبي ، ونقل الإشارة2،3. هذا ينطبق بشكل خاص على إشارات هرمون الستيرويد ، حيث تقوم PRMTs بتعديل نشاط مستقبلات الستيرويد عن طريق ميثيلة ليس فقط المستقبلات نفسها ولكن أيضا منظميها أو الهستونات2.

تمت دراسة مثيلة الأرجينين إلى حد كبير في السرطان ، حيث تبين أن غالبية PRMTs يتم التعبير عنها بشكل مفرط في السرطان مقارنة بالأنسجة الطبيعية ، وغالبا ما يرتبط تعبيرها بسوء التشخيص4،5. يعد الكشف عن مثيلة الأرجينين في الجسم الحي أمرا ضروريا لفهم الوظائف الخلوية المرتبطة بهذا التعديل. يتم تحقيق ذلك تقليديا عن طريق إجراء الكيمياء المناعية (IHC) مع جسم مضاد محدد يتعرف على بقايا الأرجينين الميثيلية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة للغاية لأنها تعتمد على تحديد بقايا الأرجينين المعدلة وتعتمد على فعالية الجسم المضاد المستخدم. تم تطوير مقايسة ربط القرب في الموقع (PLA) في البداية لدراسة تفاعلات البروتين / البروتين في الخلايا أو الأنسجة الثابتة6. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للكشف عن PTMs باستخدام جسم مضاد ضد تعديل الاهتمام ، بالإضافة إلى جسم مضاد يتعرف على البروتين المستهدف. قام فريقنا سابقا بتكييف هذه التقنية لدراسة مثيلة مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا (ERα) ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل ERα وجسم مضاد يتعرف على وجه التحديد على موقع المثيلة على الأرجينين 2607. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية يمكن أن تمتد إلى الأجسام المضادة التي تتعرف على نوع خاص من المثيلة حتى عندما تكون بقايا الميثيل غير معروفة. في الواقع ، توفر العديد من الشركات أجساما مضادة على وجه التحديد تعرف MMA أو ADMA أو SDMA والتي يمكن استخدامها بنجاح لدراسة مثيلة البروتين في الجسم الحي.

هنا ، كدليل على المفهوم ، نقدم تحليلا مفصلا لمثيلة GR باستخدام الجسم المضاد SDMA في أورام الثدي البشرية من التصميم التجريبي إلى تحليل البيانات.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية التابعة لمركز أبحاث السرطان في ليون.

1. اختيار الأجسام المضادة

  1. استخدم الأجسام المضادة الأولية التي تم التحقق من صحتها بواسطة IHC أو التألق المناعي (IF).
    ملاحظة: تعتبر الأجسام المضادة الأولية المختارة للدراسة ضرورية لنجاح PLA وبشكل أكثر تحديدا في الأنسجة الثابتة. سيؤدي استخدام جسم مضاد تم التحقق من صحته بواسطة IHC أو IF إلى زيادة معدل نجاح التجربة. مطلوب تحسين وخصوصية الأجسام المضادة قبل إجراء التجارب ، من الناحية المثالية عن طريق إجراء تجارب التحكم في الخلايا التي تم إبطالها للتعبير عن البروتين محل الاهتمام واستخدام مثبط خاص بالنشاط الأنزيمي لميثيل ترانسفيراز المعني. هنا تم تحسين الظروفسابقا 10.

2. تحضير بيليه خط الخلية المدمج في البارافين

ملاحظة: يتم تضمين العينات في مادة هلامية ثم وضعها في معالج أنسجة آلي لتجفيف العينة وتضمين البارافين.

  1. تحضير حبيبات الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل باستخدام تفكك التربسين.
    ملاحظة: لا تكشط لحصاد الخلايا.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  3. الطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) عند 200 × جم. استنشق المادة الطافية PBS.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الفورمالين 4٪ وتخزين الأنابيب في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات.
  5. اغسل الخلايا في محلول ملحي 1X Tris-buffered-saline (TBS).
    ملاحظة: لا تستخدم محلولا قائما على الفوسفات لأنه يزيل بلمرة الجل.
  6. أضف 1 مل من TBS وقم بتجانس لمدة 30 ثانية عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم وإزالة المادة الطافية.
  7. كرر الخطوات من 2.5 إلى 2.7 مرتين.
  8. قم بإجراء إدراج الأنسجة في معالج الأنسجة الآلي باتباع البرنامج المحدد:
    الفورمالين 1 ساعة 37 درجة مئوية
    الماء المقطر 2 دقيقة RT
    EtOH 70٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    EtOH 80٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    EtOH 95٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    EtOH 100٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    EtOH 100٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    EtOH 100٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    الزيلين 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    الزيلين 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    الزيلين 40 دقيقة 45 درجة مئوية
    البارافين 1 ساعة 60 درجة مئوية
    البارافين 1 ساعة 60 درجة مئوية
    البارافين 1 ساعة و 30 دقيقة 60 درجة مئوية

3. تثبيت الأنسجة وإعداد الشرائح

  1. ثبت الأنسجة في 4٪ فورمالين لمدة 24 ساعة قبل إدراجها.
  2. قطع أقسام تسلسلية بسمك 3 ميكرومتر من الكتل التي تحتوي على أنسجة باستخدام ميكروتوم.
  3. قم بإجراء إزالة البارافينات باستخدام الصبغة الذاتية عن طريق احتضان الشرائح بالتتابع في الزيلين (10 دقائق) مرتين ، 100٪ إيثانول (5 دقائق) ، 95٪ إيثانول (5 دقائق) ، وماء (5 دقائق).
  4. قم بإجراء استرجاع الحاتمة الناجمة عن الحرارة في مخزن مؤقت للسترات 10 ملي مولار باستخدام حمام مائي عند 98 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة عند درجة الحموضة المناسبة (عادة 6-9).
    ملاحظة: يجب أن يعمل الجسمان المضادان بنفس الرقم الهيدروجيني حتى تنجح الطريقة. تم إجراء العديد من الاختبارات قبل تحديد درجة الحموضة المثلى المستخدمة هنا. الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة هي الجسم المضاد SDMA والجسم المضاد GR.
  5. اتركي الشرائح تبرد لمدة 20 دقيقة ، ثم اغسليها في 1x PBS لمدة 20 دقيقة.

4. تجربة IHC

ملاحظة: يتم إجراء تجارب IHC باستخدام أداة البحث Discovery XT (جدول المواد) للأتمتة وقابلية التكاثر.

  1. لتجنب تبريد البيروكسيداز ، استخدم المثبط المتضمن في مجموعة ديامينوبينزيدين (DAB).
  2. احتضان الشرائح بالجسمين المضادين الأساسيين المخففين في مخفف الجسم المضاد لمدة 60 دقيقة.
  3. احتضان الشرائح بالجسم المضاد الثانوي لبيروكسيداز فجل الحصان (HRP) المضاد للأرانب لمدة 16 دقيقة أو الجسم المضاد للفأر لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يوصى باستخدام مجموعة ديامينوبنزيدين التجارية (DAB) (جدول المواد) للكشف عن IHC.
  4. ضع الهيماتوكسيلين (100 ميكرولتر / شريحة لمدة 8 دقائق) والأزرق (100 ميكرولتر / شريحة لمدة 4 دقائق) على العينات لتلطيخ النوى.
  5. اغسل الشرائح بالماء الدافئ والصابون ، ثم جففها باستخدام أداة صبغة تلقائية وقم بتثبيتها على شبشب غطاء آلي باستخدام وسيط تثبيت.

5. تفاعلات فحص ربط القرب

ملاحظة: يتم تضمين جميع الكواشف المستخدمة في مجموعات PLA (جدول المواد). يوصى باستخدام 40 ميكرولتر من الكاشف ل 1 سم2 من الأنسجة. يجب إجراء جميع الحضانات في بيئة رطبة لمنع التبخر المفرط. لا تدع العينة تجف ، فقد يؤدي ذلك إلى ضوضاء في الخلفية. يوصى باستخدام 1x buffer A (مخزن مؤقت للغسيل في الموقع ، جدول المواد) للغسيل في البرطمانات. يجب أن يكون هناك حجم لا يقل عن 70 مل في البرطمانات عند احتضان العينات تحت التحريض. يجب حفظ العينات في RT قبل الاستخدام.

  1. تبريد البيروكسيداز
    1. حدد منطقة التفاعل باستخدام قلم كاره للماء لمنع التبخر المفرط للمحلول أثناء التجربة. أضف قطرة واحدة من محلول بيروكسيد الهيدروجين لكل 1 سم2 من كل عينة. احتضن لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يوصى بتحسين وقت الحضانة وفقا للعينات / الأجسام المضادة المستخدمة.
  2. حظر
    1. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة تحت التحريك لمدة 5 دقائق في RT.
    2. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وأضف قطرة واحدة لكل 1 سم2 من محلول الحظر (المضمن في مجموعة PLA). احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. تمييع الجسمين المضادين الأساسيين بتركيزات مناسبة في مخفف الجسم المضاد.
    2. قم بإزالة محلول الحظر من الشرائح وأضف على الفور محلول الجسم المضاد الأساسي (المضمن في مجموعة PLA). احتضن لمدة 1 ساعة في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية.
  4. حضانة مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى
    1. قم بتخفيف مسبار PLA PLUS (1: 5) باستخدام مسبار PLA ناقص (1: 5) في مخفف الجسم المضاد.
      ملاحظة: يوصى باستخدام 8 ميكرولتر من مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى مطروحا منه المخزون (5x) ، و 8 ميكرولتر من مسبار PLA بالإضافة إلى المخزون (5x) ، و 24 ميكرولتر من مخفف الجسم المضاد لتفاعل 40 ميكرولتر.
    2. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
    3. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول مسبار PLA (المضمن في مجموعة PLA) على العينات. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
  5. الربط
    1. قم بإذابة المخزن المؤقت للربط (المضمن في مجموعة PLA) قبل الخطوات التالية.
    2. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
    3. قم بتخفيف المخزن المؤقت للربط 5x (1: 5) (المضمن في مجموعة PLA) في ماء عالي النقاء. أضف ligase (1:40) (المضمن في مجموعة PLA) مباشرة قبل إضافته إلى العينة.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 5x إلى 31 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر. ثم أضف 1 ميكرولتر من الليغاز.
    4. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول ligase على العينات. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. التضخيم
    1. قم بإذابة المخزن المؤقت للتضخيم قبل الخطوات التالية.
    2. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
    3. قم بتخفيف المخزن المؤقت للتضخيم 5x (1: 5) (المضمن في مجموعة PLA) في مياه عالية النقاء. أضف البوليميراز (1:80) (المضمن في مجموعة PLA) مباشرة قبل تقطيره برفق على العينة.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 5x إلى 31.5 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر. ثم أضف 0.5 ميكرولتر من الليغاز.
    4. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول التضخيم على العينات. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
  7. الكشف
    1. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
    2. قم بتخفيف المخزن المؤقت للمجال الساطع للكشف 5x (1:5) (المضمن في مجموعة PLA) في المياه عالية النقاء.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكشف 5x إلى 32 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر.
    3. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق حل الكشف على العينات. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
  8. تطوير الركيزة
    1. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
    2. قم بتخفيف محلول الركيزة عن طريق تخفيف كواشف الركيزة A (1:70) و B (1:100) و C (1:100) و D (1:50) (المضمنة في مجموعة PLA) في مياه عالية النقاء.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 0.6 ميكرولتر من الركيزة A ، و 0.4 ميكرولتر من الركيزة B ، و 0.4 ميكرولتر من الركيزة C ، و 0.8 ميكرولتر من الركيزة D في 37.8 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر.
    3. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول التضخيم على العينات. احتضن لمدة 10 دقائق في RT.
  9. تلطيخ نووي
    1. قم بتقطير الماء المقطر برفق على العينات واغسله بالماء المقطر عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
    2. اضغط على الماء المقطر المتبقي. أضف قطرة واحدة من البقعة النووية (المضمنة في مجموعة PLA) إلى كل عينة 1 سم2 واحتضانها لمدة دقيقتين في RT.
    3. اشطف الشرائح تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق للسماح للبقعة بالنضوج والحصول على لون أزرق. لا تستخدم ماء الصنبور الراكد.
  10. تجفاف
    1. احتضان الشرائح في محلول يحتوي على 96٪ إيثانول مرتين لمدة دقيقتين. ثم احتضان الشرائح في محلول يحتوي على 99.7٪ إيثانول مرتين لمدة دقيقتين.
    2. احتضن الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق. ثم انقل الشرائح إلى الزيلين الطازج.
  11. تركيب الشرائح
    1. استخدم حجما أدنى من وسط التركيب غير المائي وقم بتطبيق غطاء أعلى العينة ، مما يضمن عدم وقوع فقاعات هواء تحت الغطاء.
    2. اترك الشرائح تجف قبل التحليل على مجهر المجال الساطع.

6. التصوير للتوطين

  1. احصل على الصور باستخدام مجهر عمودي.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء تصوير الشرائح تحت مجهر ميدان ساطع منتصب (جدول المواد). تم الحصول على الصور في ظل ظروف متطابقة بتكبير 40 ضعفا لما لا يقل عن 10 مجالات رؤية تم اختيارها عشوائيا بطريقة آلية. يوصى بتحليل ما لا يقل عن 500 خلية لكل حالة.

7. تحليل القياس الكمي

ملاحظة: تم إجراء القياس الكمي للعينات باستخدام برنامج ImageJ8. تم استخدام FIJI ، وهو توزيع ImageJ بما في ذلك ImageJ والمكونات الإضافية الأخرى المثبتة مسبقا ، للتحليلات اللاحقة9،10.

  1. لتحديد عدد النقاط:
    1. افتح الصورة.
    2. أداء تفكيك الألوان. لهذا ، انقر فوق Image > Colors > Color Deconvolution.
    3. حدد الصورة: - (color_1) في اسم الملف.
    4. استخدم الأمر Find Maxima لتحديد عدد النقاط (Process > Find Maxima).
  2. لتحديد عدد الخلايا:
    1. افتح الصورة.
    2. أداء تفكيك الألوان. لهذا ، انقر فوق Image > Colors > Color Deconvolution.
    3. حدد الصورة: - (color_1) في اسم الملف.
    4. أوجد عتبة توضح الحد الأقصى لعدد النوى. لهذا ، انقر فوق عتبة > سطوع الصورة / التباين >.
    5. املأ الثقوب بالنقر فوق عملية > الثقوب الثنائية > التعبئة.
    6. استخدم الأمر مستجمعات المياه لتقسيم المكونات المتصلة إلى مكونات منفصلة. انقر فوق عملية > مستجمعات المياه > الثنائية.
    7. قم بتحليل الجسيمات لتحديد عدد النوى بالنقر فوق تحليل الجسيمات > تحليلها.

النتائج

باستخدام الإجراء الموضح أعلاه ، من الممكن اكتشاف مثيلة البروتين ذي الأهمية وتحديدها. هنا ، نعرض مثال مثيلة الموارد الوراثية بواسطة PRMT5. تم تطبيق الأجسام المضادة والظروف التجريبية ل PLA سابقا على الخلايا10. باختصار ، يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية التي...

Discussion

تساهم مثيلة الأرجينين ، مثل PTMs الأخرى ، في التنظيم الدقيق لوظائف البروتين. ومع ذلك، فإن تأثيره أقل من قيمته بسبب صعوبة تقييم هذه التعديلات، ويرجع ذلك أساسا إلى الافتقار إلى الأدوات. هذا صحيح بشكل خاص عند دراسة المثيلة في الجسم الحي ، حيث تتمثل الطريقة الوحيدة لقياس ?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح

Acknowledgements

نود أن نشكر B. Manship على تدقيق المخطوطة. نعرب عن تقديرنا للورا فرانكولز ، كليمنتين لو نيفي ، منصة أبحاث علم الأمراض (CRCL) للمساعدة الفنية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Servier Medical Art. تم دعم هذه الدراسة من قبل Ligue Inter-régionale contre le Cancer والجمعية: "Le Cancer du sein، parlons-en".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesion slides TOMO 90°, x100VWR631-1239
anti-GR antibody (mouse)Santa Cruzsc393232
anti-GR antibody (mouse)santa cruzsc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)Merck07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)CST13222
Automate d'inclusionLeicaASP 6025Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XLLeicaST5010Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500VWR720-2233
CC1Roche5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mLMMFF/T0050
Dako antibody diluentDako AgilentS202230-2antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kitRoche760-159Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery WashRoche7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minusSigma-AldrichDUO92004PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfieldSigma-AldrichDUO92012PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plusSigma-AldrichDUO92002PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfieldSigma-AldrichDUO82047PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 LVWR83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 LVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol, ready to use, 5 LMMFF/40877-36Formalin
Fully automated glass coverslipperLeicaCV5030automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40Dutscher100037
HematoxylinVentana760-2021
IHC instrumentRocheDISCOVERY XTAutomation of IHC
LCSRoche5264839001
MicrotomeThermo ScientificMicrom HM340ECutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium PertexHistolab00801-FR
PAP Pen for immunostainingSigma-AldrichZ672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kgSakura4511
Pasteur Disposable PipettesFisher Scientific12583237
PBS Buffer 10x, 100 mLMMFF/T0020
Reaction Buffer 10xRoche5353955001
Ribo Wash 10xRoche5266262001
RiboCC1Roche5266297001
Secondary antibody anti-mouseAbcamab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRPRoche760-4311
Tissue Embedding centerMMFEC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 LVWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscopeupright bright-field microscope

References

  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  4. Poulard, C., Corbo, L., Le Romancer, M. Protein arginine methylation/demethylation and cancer. Oncotarget. 7 (41), 67532-67550 (2016).
  5. Hwang, J. W., et al. Protein arginine methyltransferases: promising targets for cancer therapy. Experimental & Molecular Medicine. 53 (5), 788-808 (2021).
  6. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  7. Poulard, C., et al. Activation of rapid oestrogen signalling in aggressive human breast cancers. EMBO Molecular Medicine. 4 (11), 1200-1213 (2012).
  8. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Pham, T. H., Le Romancer, M. Using proximity ligation assay to detect protein arginine methylation. Methods. 175, 66-71 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PRMT5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved