يسمح اختبار ربط القرب بالكشف عن مثيلة البروتين الأرجينين وتوطينها وقياسها في الأنسجة الثابتة

Summary

يعد اختبار ربط القرب تقنية مفيدة للغاية لتحديد وتحديد مثيلة الأرجينين لبروتين معين عندما تكون بقايا الأرجينين المعدلة غير معروفة و / أو إذا لم يكن هناك جسم مضاد محدد متاح.

Abstract

تظهر مثيلة الأرجينين كتعديل رئيسي بعد الترجمة يشارك في مجموعة كبيرة من العمليات البيولوجية. غالبا ما تكون دراستها في الأنسجة محدودة بسبب عدم وجود جسم مضاد محدد يتعرف على بقايا الأرجينين المستهدفة. تم تطوير مقايسة ربط القرب (PLA) في الأصل لدراسة تفاعلات البروتين / البروتين. هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكول PLA المخصص للكشف عن مثيلة الأرجينين التي طبقناها على مستقبلات الجلوكوكورتيكويد (GR). بعد أن أظهرنا سابقا أن PRMT5 ثنائي ميثيل GRs في الخلايا ، استخدمنا PLA مع جسم مضاد ثنائي ميثيل متماثل وجسم مضاد مضاد للGR لقياس مثيلة GR في أورام الثدي. نوضح أن PLA يقدم نهجا فريدا لقياس مثيلة الأرجينين للبروتين المستهدف ، حتى عندما لا يتم تحديد موقع الميثيل. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل تعديلات أخرى بعد الترجمة حيث تتوفر أجسام مضادة فعالة للعموم. ومن ثم ، فإننا نفصل تقنية PLA المستخدمة للكشف عن مثيلة الأرجينين في الأنسجة الثابتة باستخدام GR كمثال.

Introduction

مثيلة الأرجينين بواسطة بروتين ميثيل ترانسفيراز الأرجينين (PRMTs) هي تعديل وفير بعد الترجمة (PTM) يشارك في العديد من العمليات البيولوجية. تحفز PRMTs نقل مجموعات الميثيل من S-adenosyl methionine إلى بقايا الأرجينين. تتكون عائلة PRMT من تسعة أعضاء مصنفين وفقا لنوع المثيلة التي يؤدونها. يقوم جميع الأعضاء بإجراء أحادي الميثيل (MMA). النوع 1 (PRMT1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 8) تحفز PRMTs ثنائي الميثيل غير المتماثل (ADMA) ، في حين أن النوع 2 (PRMT5 و 9) يحفز ثنائي الميثيل المتماثل (SDMA) ، والنوع 3 (PRMT7) يولد MMA¹ فقط. من خلال مثيلة العديد من الركائز ، تنظم PRMTs المختلفة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية المهمة مثل إصلاح الحمض النووي ، وتنظيم النسخ ، والاستجابة المناعية ، ومعالجة الحمض النووي الريبي ، ونقل الإشارة^2،3. هذا ينطبق بشكل خاص على إشارات هرمون الستيرويد ، حيث تقوم PRMTs بتعديل نشاط مستقبلات الستيرويد عن طريق ميثيلة ليس فقط المستقبلات نفسها ولكن أيضا منظميها أو الهستونات².

تمت دراسة مثيلة الأرجينين إلى حد كبير في السرطان ، حيث تبين أن غالبية PRMTs يتم التعبير عنها بشكل مفرط في السرطان مقارنة بالأنسجة الطبيعية ، وغالبا ما يرتبط تعبيرها بسوء التشخيص^4،5. يعد الكشف عن مثيلة الأرجينين في الجسم الحي أمرا ضروريا لفهم الوظائف الخلوية المرتبطة بهذا التعديل. يتم تحقيق ذلك تقليديا عن طريق إجراء الكيمياء المناعية (IHC) مع جسم مضاد محدد يتعرف على بقايا الأرجينين الميثيلية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة للغاية لأنها تعتمد على تحديد بقايا الأرجينين المعدلة وتعتمد على فعالية الجسم المضاد المستخدم. تم تطوير مقايسة ربط القرب في الموقع (PLA) في البداية لدراسة تفاعلات البروتين / البروتين في الخلايا أو الأنسجة الثابتة⁶. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للكشف عن PTMs باستخدام جسم مضاد ضد تعديل الاهتمام ، بالإضافة إلى جسم مضاد يتعرف على البروتين المستهدف. قام فريقنا سابقا بتكييف هذه التقنية لدراسة مثيلة مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا (ERα) ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل ERα وجسم مضاد يتعرف على وجه التحديد على موقع المثيلة على الأرجينين 260⁷. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية يمكن أن تمتد إلى الأجسام المضادة التي تتعرف على نوع خاص من المثيلة حتى عندما تكون بقايا الميثيل غير معروفة. في الواقع ، توفر العديد من الشركات أجساما مضادة على وجه التحديد تعرف MMA أو ADMA أو SDMA والتي يمكن استخدامها بنجاح لدراسة مثيلة البروتين في الجسم الحي.

هنا ، كدليل على المفهوم ، نقدم تحليلا مفصلا لمثيلة GR باستخدام الجسم المضاد SDMA في أورام الثدي البشرية من التصميم التجريبي إلى تحليل البيانات.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية التابعة لمركز أبحاث السرطان في ليون.

1. اختيار الأجسام المضادة

1. استخدم الأجسام المضادة الأولية التي تم التحقق من صحتها بواسطة IHC أو التألق المناعي (IF).
   ملاحظة: تعتبر الأجسام المضادة الأولية المختارة للدراسة ضرورية لنجاح PLA وبشكل أكثر تحديدا في الأنسجة الثابتة. سيؤدي استخدام جسم مضاد تم التحقق من صحته بواسطة IHC أو IF إلى زيادة معدل نجاح التجربة. مطلوب تحسين وخصوصية الأجسام المضادة قبل إجراء التجارب ، من الناحية المثالية عن طريق إجراء تجارب التحكم في الخلايا التي تم إبطالها للتعبير عن البروتين محل الاهتمام واستخدام مثبط خاص بالنشاط الأنزيمي لميثيل ترانسفيراز المعني. هنا تم تحسين الظروف^{سابقا 10}.

2. تحضير بيليه خط الخلية المدمج في البارافين

ملاحظة: يتم تضمين العينات في مادة هلامية ثم وضعها في معالج أنسجة آلي لتجفيف العينة وتضمين البارافين.

1. تحضير حبيبات الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل باستخدام تفكك التربسين.
   ملاحظة: لا تكشط لحصاد الخلايا.
2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. الطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) عند 200 × جم. استنشق المادة الطافية PBS.
4. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الفورمالين 4٪ وتخزين الأنابيب في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعات.
5. اغسل الخلايا في محلول ملحي 1X Tris-buffered-saline (TBS).
   ملاحظة: لا تستخدم محلولا قائما على الفوسفات لأنه يزيل بلمرة الجل.
6. أضف 1 مل من TBS وقم بتجانس لمدة 30 ثانية عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم وإزالة المادة الطافية.
7. كرر الخطوات من 2.5 إلى 2.7 مرتين.
8. قم بإجراء إدراج الأنسجة في معالج الأنسجة الآلي باتباع البرنامج المحدد:
   الفورمالين 1 ساعة 37 درجة مئوية
   الماء المقطر 2 دقيقة RT
   EtOH 70٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   EtOH 80٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   EtOH 95٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   EtOH 100٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   EtOH 100٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   EtOH 100٪ 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   الزيلين 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   الزيلين 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   الزيلين 40 دقيقة 45 درجة مئوية
   البارافين 1 ساعة 60 درجة مئوية
   البارافين 1 ساعة 60 درجة مئوية
   البارافين 1 ساعة و 30 دقيقة 60 درجة مئوية

3. تثبيت الأنسجة وإعداد الشرائح

1. ثبت الأنسجة في 4٪ فورمالين لمدة 24 ساعة قبل إدراجها.
2. قطع أقسام تسلسلية بسمك 3 ميكرومتر من الكتل التي تحتوي على أنسجة باستخدام ميكروتوم.
3. قم بإجراء إزالة البارافينات باستخدام الصبغة الذاتية عن طريق احتضان الشرائح بالتتابع في الزيلين (10 دقائق) مرتين ، 100٪ إيثانول (5 دقائق) ، 95٪ إيثانول (5 دقائق) ، وماء (5 دقائق).
4. قم بإجراء استرجاع الحاتمة الناجمة عن الحرارة في مخزن مؤقت للسترات 10 ملي مولار باستخدام حمام مائي عند 98 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة عند درجة الحموضة المناسبة (عادة 6-9).
   ملاحظة: يجب أن يعمل الجسمان المضادان بنفس الرقم الهيدروجيني حتى تنجح الطريقة. تم إجراء العديد من الاختبارات قبل تحديد درجة الحموضة المثلى المستخدمة هنا. الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة هي الجسم المضاد SDMA والجسم المضاد GR.
5. اتركي الشرائح تبرد لمدة 20 دقيقة ، ثم اغسليها في 1x PBS لمدة 20 دقيقة.

4. تجربة IHC

ملاحظة: يتم إجراء تجارب IHC باستخدام أداة البحث Discovery XT (جدول المواد) للأتمتة وقابلية التكاثر.

1. لتجنب تبريد البيروكسيداز ، استخدم المثبط المتضمن في مجموعة ديامينوبينزيدين (DAB).
2. احتضان الشرائح بالجسمين المضادين الأساسيين المخففين في مخفف الجسم المضاد لمدة 60 دقيقة.
3. احتضان الشرائح بالجسم المضاد الثانوي لبيروكسيداز فجل الحصان (HRP) المضاد للأرانب لمدة 16 دقيقة أو الجسم المضاد للفأر لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: يوصى باستخدام مجموعة ديامينوبنزيدين التجارية (DAB) (جدول المواد) للكشف عن IHC.
4. ضع الهيماتوكسيلين (100 ميكرولتر / شريحة لمدة 8 دقائق) والأزرق (100 ميكرولتر / شريحة لمدة 4 دقائق) على العينات لتلطيخ النوى.
5. اغسل الشرائح بالماء الدافئ والصابون ، ثم جففها باستخدام أداة صبغة تلقائية وقم بتثبيتها على شبشب غطاء آلي باستخدام وسيط تثبيت.

5. تفاعلات فحص ربط القرب

ملاحظة: يتم تضمين جميع الكواشف المستخدمة في مجموعات PLA (جدول المواد). يوصى باستخدام 40 ميكرولتر من الكاشف ل 1 سم² من الأنسجة. يجب إجراء جميع الحضانات في بيئة رطبة لمنع التبخر المفرط. لا تدع العينة تجف ، فقد يؤدي ذلك إلى ضوضاء في الخلفية. يوصى باستخدام 1x buffer A (مخزن مؤقت للغسيل في الموقع ، جدول المواد) للغسيل في البرطمانات. يجب أن يكون هناك حجم لا يقل عن 70 مل في البرطمانات عند احتضان العينات تحت التحريض. يجب حفظ العينات في RT قبل الاستخدام.

1. تبريد البيروكسيداز
   1. حدد منطقة التفاعل باستخدام قلم كاره للماء لمنع التبخر المفرط للمحلول أثناء التجربة. أضف قطرة واحدة من محلول بيروكسيد الهيدروجين لكل 1 سم² من كل عينة. احتضن لمدة 5 دقائق في RT.
      ملاحظة: يوصى بتحسين وقت الحضانة وفقا للعينات / الأجسام المضادة المستخدمة.
2. حظر
   1. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة تحت التحريك لمدة 5 دقائق في RT.
   2. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وأضف قطرة واحدة لكل 1 سم² من محلول الحظر (المضمن في مجموعة PLA). احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. حضانة الأجسام المضادة الأولية
   1. تمييع الجسمين المضادين الأساسيين بتركيزات مناسبة في مخفف الجسم المضاد.
   2. قم بإزالة محلول الحظر من الشرائح وأضف على الفور محلول الجسم المضاد الأساسي (المضمن في مجموعة PLA). احتضن لمدة 1 ساعة في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية.
4. حضانة مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى
   1. قم بتخفيف مسبار PLA PLUS (1: 5) باستخدام مسبار PLA ناقص (1: 5) في مخفف الجسم المضاد.
      ملاحظة: يوصى باستخدام 8 ميكرولتر من مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى مطروحا منه المخزون (5x) ، و 8 ميكرولتر من مسبار PLA بالإضافة إلى المخزون (5x) ، و 24 ميكرولتر من مخفف الجسم المضاد لتفاعل 40 ميكرولتر.
   2. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
   3. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول مسبار PLA (المضمن في مجموعة PLA) على العينات. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
5. الربط
   1. قم بإذابة المخزن المؤقت للربط (المضمن في مجموعة PLA) قبل الخطوات التالية.
   2. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في RT.
   3. قم بتخفيف المخزن المؤقت للربط 5x (1: 5) (المضمن في مجموعة PLA) في ماء عالي النقاء. أضف ligase (1:40) (المضمن في مجموعة PLA) مباشرة قبل إضافته إلى العينة.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 5x إلى 31 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر. ثم أضف 1 ميكرولتر من الليغاز.
   4. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول ligase على العينات. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
6. التضخيم
   1. قم بإذابة المخزن المؤقت للتضخيم قبل الخطوات التالية.
   2. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
   3. قم بتخفيف المخزن المؤقت للتضخيم 5x (1: 5) (المضمن في مجموعة PLA) في مياه عالية النقاء. أضف البوليميراز (1:80) (المضمن في مجموعة PLA) مباشرة قبل تقطيره برفق على العينة.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 5x إلى 31.5 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر. ثم أضف 0.5 ميكرولتر من الليغاز.
   4. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول التضخيم على العينات. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
7. الكشف
   1. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
   2. قم بتخفيف المخزن المؤقت للمجال الساطع للكشف 5x (1:5) (المضمن في مجموعة PLA) في المياه عالية النقاء.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 8 ميكرولتر من المخزن المؤقت للكشف 5x إلى 32 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر.
   3. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق حل الكشف على العينات. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
8. تطوير الركيزة
   1. قم بالتنقيط برفق المخزن المؤقت A على العينات واغسله في المخزن المؤقت A عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
   2. قم بتخفيف محلول الركيزة عن طريق تخفيف كواشف الركيزة A (1:70) و B (1:100) و C (1:100) و D (1:50) (المضمنة في مجموعة PLA) في مياه عالية النقاء.
      ملاحظة: يوصى بإضافة 0.6 ميكرولتر من الركيزة A ، و 0.4 ميكرولتر من الركيزة B ، و 0.4 ميكرولتر من الركيزة C ، و 0.8 ميكرولتر من الركيزة D في 37.8 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لتفاعل 40 ميكرولتر.
   3. اضغط على المخزن المؤقت المتبقي A وقم بتطبيق محلول التضخيم على العينات. احتضن لمدة 10 دقائق في RT.
9. تلطيخ نووي
   1. قم بتقطير الماء المقطر برفق على العينات واغسله بالماء المقطر عند 50 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في RT.
   2. اضغط على الماء المقطر المتبقي. أضف قطرة واحدة من البقعة النووية (المضمنة في مجموعة PLA) إلى كل عينة 1 سم² واحتضانها لمدة دقيقتين في RT.
   3. اشطف الشرائح تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق للسماح للبقعة بالنضوج والحصول على لون أزرق. لا تستخدم ماء الصنبور الراكد.
10. تجفاف
    1. احتضان الشرائح في محلول يحتوي على 96٪ إيثانول مرتين لمدة دقيقتين. ثم احتضان الشرائح في محلول يحتوي على 99.7٪ إيثانول مرتين لمدة دقيقتين.
    2. احتضن الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق. ثم انقل الشرائح إلى الزيلين الطازج.
11. تركيب الشرائح
    1. استخدم حجما أدنى من وسط التركيب غير المائي وقم بتطبيق غطاء أعلى العينة ، مما يضمن عدم وقوع فقاعات هواء تحت الغطاء.
    2. اترك الشرائح تجف قبل التحليل على مجهر المجال الساطع.

6. التصوير للتوطين

1. احصل على الصور باستخدام مجهر عمودي.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم إجراء تصوير الشرائح تحت مجهر ميدان ساطع منتصب (جدول المواد). تم الحصول على الصور في ظل ظروف متطابقة بتكبير 40 ضعفا لما لا يقل عن 10 مجالات رؤية تم اختيارها عشوائيا بطريقة آلية. يوصى بتحليل ما لا يقل عن 500 خلية لكل حالة.

7. تحليل القياس الكمي

ملاحظة: تم إجراء القياس الكمي للعينات باستخدام برنامج ImageJ⁸. تم استخدام FIJI ، وهو توزيع ImageJ بما في ذلك ImageJ والمكونات الإضافية الأخرى المثبتة مسبقا ، للتحليلات اللاحقة^9،10.

1. لتحديد عدد النقاط:
   1. افتح الصورة.
   2. أداء تفكيك الألوان. لهذا ، انقر فوق Image > Colors > Color Deconvolution.
   3. حدد الصورة: - (color_1) في اسم الملف.
   4. استخدم الأمر Find Maxima لتحديد عدد النقاط (Process > Find Maxima).
2. لتحديد عدد الخلايا:
   1. افتح الصورة.
   2. أداء تفكيك الألوان. لهذا ، انقر فوق Image > Colors > Color Deconvolution.
   3. حدد الصورة: - (color_1) في اسم الملف.
   4. أوجد عتبة توضح الحد الأقصى لعدد النوى. لهذا ، انقر فوق عتبة > سطوع الصورة / التباين >.
   5. املأ الثقوب بالنقر فوق عملية > الثقوب الثنائية > التعبئة.
   6. استخدم الأمر مستجمعات المياه لتقسيم المكونات المتصلة إلى مكونات منفصلة. انقر فوق عملية > مستجمعات المياه > الثنائية.
   7. قم بتحليل الجسيمات لتحديد عدد النوى بالنقر فوق تحليل الجسيمات > تحليلها.

النتائج

باستخدام الإجراء الموضح أعلاه ، من الممكن اكتشاف مثيلة البروتين ذي الأهمية وتحديدها. هنا ، نعرض مثال مثيلة الموارد الوراثية بواسطة PRMT5. تم تطبيق الأجسام المضادة والظروف التجريبية ل PLA سابقا على الخلايا¹⁰. باختصار ، يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية التي...

Discussion

تساهم مثيلة الأرجينين ، مثل PTMs الأخرى ، في التنظيم الدقيق لوظائف البروتين. ومع ذلك، فإن تأثيره أقل من قيمته بسبب صعوبة تقييم هذه التعديلات، ويرجع ذلك أساسا إلى الافتقار إلى الأدوات. هذا صحيح بشكل خاص عند دراسة المثيلة في الجسم الحي ، حيث تتمثل الطريقة الوحيدة لقياس ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope