A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
يعد اختبار ربط القرب تقنية مفيدة للغاية لتحديد وتحديد مثيلة الأرجينين لبروتين معين عندما تكون بقايا الأرجينين المعدلة غير معروفة و / أو إذا لم يكن هناك جسم مضاد محدد متاح.
تظهر مثيلة الأرجينين كتعديل رئيسي بعد الترجمة يشارك في مجموعة كبيرة من العمليات البيولوجية. غالبا ما تكون دراستها في الأنسجة محدودة بسبب عدم وجود جسم مضاد محدد يتعرف على بقايا الأرجينين المستهدفة. تم تطوير مقايسة ربط القرب (PLA) في الأصل لدراسة تفاعلات البروتين / البروتين. هنا ، نصف بالتفصيل بروتوكول PLA المخصص للكشف عن مثيلة الأرجينين التي طبقناها على مستقبلات الجلوكوكورتيكويد (GR). بعد أن أظهرنا سابقا أن PRMT5 ثنائي ميثيل GRs في الخلايا ، استخدمنا PLA مع جسم مضاد ثنائي ميثيل متماثل وجسم مضاد مضاد للGR لقياس مثيلة GR في أورام الثدي. نوضح أن PLA يقدم نهجا فريدا لقياس مثيلة الأرجينين للبروتين المستهدف ، حتى عندما لا يتم تحديد موقع الميثيل. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل تعديلات أخرى بعد الترجمة حيث تتوفر أجسام مضادة فعالة للعموم. ومن ثم ، فإننا نفصل تقنية PLA المستخدمة للكشف عن مثيلة الأرجينين في الأنسجة الثابتة باستخدام GR كمثال.
مثيلة الأرجينين بواسطة بروتين ميثيل ترانسفيراز الأرجينين (PRMTs) هي تعديل وفير بعد الترجمة (PTM) يشارك في العديد من العمليات البيولوجية. تحفز PRMTs نقل مجموعات الميثيل من S-adenosyl methionine إلى بقايا الأرجينين. تتكون عائلة PRMT من تسعة أعضاء مصنفين وفقا لنوع المثيلة التي يؤدونها. يقوم جميع الأعضاء بإجراء أحادي الميثيل (MMA). النوع 1 (PRMT1 و 2 و 3 و 4 و 6 و 8) تحفز PRMTs ثنائي الميثيل غير المتماثل (ADMA) ، في حين أن النوع 2 (PRMT5 و 9) يحفز ثنائي الميثيل المتماثل (SDMA) ، والنوع 3 (PRMT7) يولد MMA1 فقط. من خلال مثيلة العديد من الركائز ، تنظم PRMTs المختلفة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية المهمة مثل إصلاح الحمض النووي ، وتنظيم النسخ ، والاستجابة المناعية ، ومعالجة الحمض النووي الريبي ، ونقل الإشارة2،3. هذا ينطبق بشكل خاص على إشارات هرمون الستيرويد ، حيث تقوم PRMTs بتعديل نشاط مستقبلات الستيرويد عن طريق ميثيلة ليس فقط المستقبلات نفسها ولكن أيضا منظميها أو الهستونات2.
تمت دراسة مثيلة الأرجينين إلى حد كبير في السرطان ، حيث تبين أن غالبية PRMTs يتم التعبير عنها بشكل مفرط في السرطان مقارنة بالأنسجة الطبيعية ، وغالبا ما يرتبط تعبيرها بسوء التشخيص4،5. يعد الكشف عن مثيلة الأرجينين في الجسم الحي أمرا ضروريا لفهم الوظائف الخلوية المرتبطة بهذا التعديل. يتم تحقيق ذلك تقليديا عن طريق إجراء الكيمياء المناعية (IHC) مع جسم مضاد محدد يتعرف على بقايا الأرجينين الميثيلية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة للغاية لأنها تعتمد على تحديد بقايا الأرجينين المعدلة وتعتمد على فعالية الجسم المضاد المستخدم. تم تطوير مقايسة ربط القرب في الموقع (PLA) في البداية لدراسة تفاعلات البروتين / البروتين في الخلايا أو الأنسجة الثابتة6. ومن المثير للاهتمام ، أنه يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للكشف عن PTMs باستخدام جسم مضاد ضد تعديل الاهتمام ، بالإضافة إلى جسم مضاد يتعرف على البروتين المستهدف. قام فريقنا سابقا بتكييف هذه التقنية لدراسة مثيلة مستقبلات هرمون الاستروجين ألفا (ERα) ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل ERα وجسم مضاد يتعرف على وجه التحديد على موقع المثيلة على الأرجينين 2607. وتجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية يمكن أن تمتد إلى الأجسام المضادة التي تتعرف على نوع خاص من المثيلة حتى عندما تكون بقايا الميثيل غير معروفة. في الواقع ، توفر العديد من الشركات أجساما مضادة على وجه التحديد تعرف MMA أو ADMA أو SDMA والتي يمكن استخدامها بنجاح لدراسة مثيلة البروتين في الجسم الحي.
هنا ، كدليل على المفهوم ، نقدم تحليلا مفصلا لمثيلة GR باستخدام الجسم المضاد SDMA في أورام الثدي البشرية من التصميم التجريبي إلى تحليل البيانات.
تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية التابعة لمركز أبحاث السرطان في ليون.
1. اختيار الأجسام المضادة
2. تحضير بيليه خط الخلية المدمج في البارافين
ملاحظة: يتم تضمين العينات في مادة هلامية ثم وضعها في معالج أنسجة آلي لتجفيف العينة وتضمين البارافين.
3. تثبيت الأنسجة وإعداد الشرائح
4. تجربة IHC
ملاحظة: يتم إجراء تجارب IHC باستخدام أداة البحث Discovery XT (جدول المواد) للأتمتة وقابلية التكاثر.
5. تفاعلات فحص ربط القرب
ملاحظة: يتم تضمين جميع الكواشف المستخدمة في مجموعات PLA (جدول المواد). يوصى باستخدام 40 ميكرولتر من الكاشف ل 1 سم2 من الأنسجة. يجب إجراء جميع الحضانات في بيئة رطبة لمنع التبخر المفرط. لا تدع العينة تجف ، فقد يؤدي ذلك إلى ضوضاء في الخلفية. يوصى باستخدام 1x buffer A (مخزن مؤقت للغسيل في الموقع ، جدول المواد) للغسيل في البرطمانات. يجب أن يكون هناك حجم لا يقل عن 70 مل في البرطمانات عند احتضان العينات تحت التحريض. يجب حفظ العينات في RT قبل الاستخدام.
6. التصوير للتوطين
7. تحليل القياس الكمي
ملاحظة: تم إجراء القياس الكمي للعينات باستخدام برنامج ImageJ8. تم استخدام FIJI ، وهو توزيع ImageJ بما في ذلك ImageJ والمكونات الإضافية الأخرى المثبتة مسبقا ، للتحليلات اللاحقة9،10.
باستخدام الإجراء الموضح أعلاه ، من الممكن اكتشاف مثيلة البروتين ذي الأهمية وتحديدها. هنا ، نعرض مثال مثيلة الموارد الوراثية بواسطة PRMT5. تم تطبيق الأجسام المضادة والظروف التجريبية ل PLA سابقا على الخلايا10. باختصار ، يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية التي...
تساهم مثيلة الأرجينين ، مثل PTMs الأخرى ، في التنظيم الدقيق لوظائف البروتين. ومع ذلك، فإن تأثيره أقل من قيمته بسبب صعوبة تقييم هذه التعديلات، ويرجع ذلك أساسا إلى الافتقار إلى الأدوات. هذا صحيح بشكل خاص عند دراسة المثيلة في الجسم الحي ، حيث تتمثل الطريقة الوحيدة لقياس ?...
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح
نود أن نشكر B. Manship على تدقيق المخطوطة. نعرب عن تقديرنا للورا فرانكولز ، كليمنتين لو نيفي ، منصة أبحاث علم الأمراض (CRCL) للمساعدة الفنية. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Servier Medical Art. تم دعم هذه الدراسة من قبل Ligue Inter-régionale contre le Cancer والجمعية: "Le Cancer du sein، parlons-en".
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesion slides TOMO 90°, x100 | VWR | 631-1239 | |
anti-GR antibody (mouse) | Santa Cruz | sc393232 | |
anti-GR antibody (mouse) | santa cruz | sc393232 | |
anti-PRMT5 antibody (rabbit) | Merck | 07-405 | |
anti-SDMA antibody (rabbit) | CST | 13222 | |
Automate d'inclusion | Leica | ASP 6025 | Paraffin infiltration and block preparation |
Autostainer XL | Leica | ST5010 | Autostainer |
Cassettes Q path macrostar III x1500 | VWR | 720-2233 | |
CC1 | Roche | 5279801001 | |
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL | MMF | F/T0050 | |
Dako antibody diluent | Dako Agilent | S202230-2 | antibody diluent |
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit | Roche | 760-159 | Diaminobenzidine (DAB) kit |
Discovery Wash | Roche | 7311079001 | |
Duolink insitu PLA probe anti-mouse minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | PLA kit (probe anti-rabbit minus) |
Duolink insitu detection reagents brightfield | Sigma-Aldrich | DUO92012 | PLA kit (in situ detection reagents) |
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus | Sigma-Aldrich | DUO92002 | PLA kit (probe anti-rabbit plus) |
Duolink insitu wash buffer brightfield | Sigma-Aldrich | DUO82047 | PLA kit (in situ wash buffer) |
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L | VWR | 83804.360 | |
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 20821.365 | |
EZ Prep 10x | Roche | 5279771001 | |
Formol, ready to use, 5 L | MMF | F/40877-36 | Formalin |
Fully automated glass coverslipper | Leica | CV5030 | automated coverslipper |
Glass coverslips 24 x 40 | Dutscher | 100037 | |
Hematoxylin | Ventana | 760-2021 | |
IHC instrument | Roche | DISCOVERY XT | Automation of IHC |
LCS | Roche | 5264839001 | |
Microtome | Thermo Scientific | Microm HM340E | Cutting of the tissues including in blocks |
Mounting Medium Pertex | Histolab | 00801-FR | |
PAP Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg | Sakura | 4511 | |
Pasteur Disposable Pipettes | Fisher Scientific | 12583237 | |
PBS Buffer 10x, 100 mL | MMF | F/T0020 | |
Reaction Buffer 10x | Roche | 5353955001 | |
Ribo Wash 10x | Roche | 5266262001 | |
RiboCC1 | Roche | 5266297001 | |
Secondary antibody anti-mouse | Abcam | ab133469 | |
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP | Roche | 760-4311 | |
Tissue Embedding center | MMF | EC 350 | |
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 28975.360 | |
Zeiss Axio Imager M2 microscope | upright bright-field microscope |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved