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Method Article
* 这些作者具有相同的贡献
当修饰的精氨酸残基未知和/或没有特异性抗体可用时,邻位连接测定是一种非常有用的技术,用于定位和定量给定蛋白质的精氨酸甲基化。
精氨酸甲基化正在成为一种关键的翻译后修饰,涉及广泛的生物过程。它在组织中的研究通常受到缺乏识别靶标精氨酸残基的特异性抗体的限制。邻位连接测定 (PLA) 最初是为了研究蛋白质/蛋白质相互作用而开发的。在这里,我们详细描述了一种专门用于检测精氨酸甲基化的 PLA 方案,我们将其应用于糖皮质激素受体 (GR)。之前已经证明 PRMT5 使细胞中的 GR 二甲基化,我们使用 PLA 与泛对称二甲基抗体和抗 GR 抗体来测量乳腺肿瘤中的 GR 甲基化。我们证明 PLA 提供了一种独特的方法来测量靶蛋白的精氨酸甲基化,即使尚未确定甲基化位点。该技术可以扩展到其他可用有效 pan 抗体的翻译后修饰。因此,我们以 GR 为例详细介绍了用于检测固定组织中精氨酸甲基化的 PLA 技术。
蛋白质精氨酸甲基转移酶 (PRMT) 的精氨酸甲基化是一种丰富的翻译后修饰 (PTM),参与许多生物过程。PRMT 催化甲基从 S-腺苷甲硫氨酸转移到精氨酸残基。PRMT 家族由 9 个成员组成,根据它们执行的甲基化类型进行分类。所有成员都进行单甲基化 (MMA)。1 型 (PRMT1、2、3、4、6 和 8) PRMT 催化不对称二甲基化 (ADMA),而 2 型 (PRMT5 和 9) 催化对称二甲基化 (SDMA),而 3 型 (PRMT7) 仅产生 MMA1。通过甲基化多种底物,不同的 PRMT 调节各种重要的细胞过程,例如 DNA 修复、转录调节、免疫反应、RNA 加工和信号转导 2,3。对于类固醇激素信号转导尤其如此,其中 PRMT 不仅通过甲基化受体本身,还甲基化其调节因子或组蛋白来改变类固醇受体的活性2。
精氨酸甲基化在癌症中被广泛研究,因为与正常组织相比,大多数 PRMT 在癌症中过表达,并且它们的表达通常与不良预后有关 4,5。体内精氨酸甲基化检测对于了解与这种修饰相关的细胞功能至关重要。这通常是通过使用识别甲基化精氨酸残基的特异性抗体进行免疫组织化学 (IHC) 来实现的。然而,这种方法非常有限,因为它基于修饰的精氨酸残基的鉴定,并依赖于所用抗体的功效。原位邻位连接测定 (PLA) 最初是为了研究固定细胞或组织中的蛋白质/蛋白质相互作用而开发的6。有趣的是,该技术还可用于使用针对目标修饰的 pan 抗体以及识别目标蛋白的抗体来检测 PTM。我们的团队之前使用抗 ERα 抗体和特异性识别精氨酸 2607 上甲基化位点的抗体,将这项技术用于研究雌激素受体 α (ERα) 甲基化。值得注意的是,即使甲基化残基未知,该技术也可以扩展到识别特殊类型甲基化的抗体。事实上,有几家公司提供特异性识别 MMA、ADMA 或 SDMA 的泛抗体,这些抗体可以成功地用于研究体内蛋白质甲基化。
在这里,作为概念验证,我们详细分析了使用 SDMA 抗体在人乳腺肿瘤中进行 GR 甲基化,从实验设计到数据分析。
获得每位患者的书面知情同意书。该研究方案得到了里昂癌症研究中心机构伦理委员会的批准。
1. 抗体的选择
2. 石蜡包埋的细胞系沉淀制备
注:将样品包埋在凝胶中,然后置于自动组织处理器中进行样品脱水和石蜡包埋。
3. 组织固定和玻片制备
4. IHC 实验
注:IHC 实验使用 Discovery XT 研究仪器(材料表)进行,以实现自动化和可重复性。
5. 邻位连接测定反应
注:使用的所有试剂都包含在 PLA 试剂盒中(材料表)。建议对 1 cm2 的组织使用 40 μL 试剂。所有孵育都需要在潮湿的环境中进行,以防止过度蒸发。不要让样品变干,因为这可能会导致背景噪音。建议使用 1x 缓冲液 A(原位 洗涤缓冲液, 材料表)在罐子中进行洗涤。在搅拌下孵育样品时,罐中的最小体积应为 70 mL。样品在使用前应保存在 RT 中。
6. 用于定位的成像
7. 定量分析
注意:使用 ImageJ 软件8 对样品进行定量。FIJI 是一个 ImageJ 发行版,包括 ImageJ 和其他预装插件,用于后续分析 9,10。
使用上述程序,可以检测和定量目标蛋白质的甲基化。在这里,我们展示了 PRMT5 甲基化 GR 的例子。PLA 的抗体和实验条件先前应用于细胞10。简而言之,靶向 GR 和 SDMA 的一抗通过与互补寡核苷酸偶联的邻位探针来识别。然后,当蛋白质非常接近时,就会发生环状 DNA 探针的杂交。该 DNA 的后续扩增在明场显微镜下通过 HRP 可视化(图 1
与其他 PTM 一样,精氨酸甲基化有助于蛋白质功能的精细调节。然而,由于难以评估这些修改,其影响被低估了,主要是因为缺乏工具。在研究 体内甲基化时尤其如此,其中测量精氨酸甲基化的唯一方法是拥有识别目标蛋白质甲基化残基的特异性抗体。这显然构成了一个限制,因为必须知道甲基化精氨酸残基,并且必须有用于修饰的特异性有效抗体用于 IHC 应用,?...
作者声明他们没有利益冲突
我们要感谢 B. Manship 校对手稿。感谢 Laura Francols、Clémentine Le Nevé、研究病理学平台 (CRCL) 提供的技术帮助。Figure 1 是使用 Servier Medical Art 创建的。这项研究得到了 Ligue Inter-régionale contre le Cancer 和协会的支持:“Le Cancer du sein, parlons-en”。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesion slides TOMO 90°, x100 | VWR | 631-1239 | |
anti-GR antibody (mouse) | Santa Cruz | sc393232 | |
anti-GR antibody (mouse) | santa cruz | sc393232 | |
anti-PRMT5 antibody (rabbit) | Merck | 07-405 | |
anti-SDMA antibody (rabbit) | CST | 13222 | |
Automate d'inclusion | Leica | ASP 6025 | Paraffin infiltration and block preparation |
Autostainer XL | Leica | ST5010 | Autostainer |
Cassettes Q path macrostar III x1500 | VWR | 720-2233 | |
CC1 | Roche | 5279801001 | |
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL | MMF | F/T0050 | |
Dako antibody diluent | Dako Agilent | S202230-2 | antibody diluent |
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit | Roche | 760-159 | Diaminobenzidine (DAB) kit |
Discovery Wash | Roche | 7311079001 | |
Duolink insitu PLA probe anti-mouse minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | PLA kit (probe anti-rabbit minus) |
Duolink insitu detection reagents brightfield | Sigma-Aldrich | DUO92012 | PLA kit (in situ detection reagents) |
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus | Sigma-Aldrich | DUO92002 | PLA kit (probe anti-rabbit plus) |
Duolink insitu wash buffer brightfield | Sigma-Aldrich | DUO82047 | PLA kit (in situ wash buffer) |
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L | VWR | 83804.360 | |
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 20821.365 | |
EZ Prep 10x | Roche | 5279771001 | |
Formol, ready to use, 5 L | MMF | F/40877-36 | Formalin |
Fully automated glass coverslipper | Leica | CV5030 | automated coverslipper |
Glass coverslips 24 x 40 | Dutscher | 100037 | |
Hematoxylin | Ventana | 760-2021 | |
IHC instrument | Roche | DISCOVERY XT | Automation of IHC |
LCS | Roche | 5264839001 | |
Microtome | Thermo Scientific | Microm HM340E | Cutting of the tissues including in blocks |
Mounting Medium Pertex | Histolab | 00801-FR | |
PAP Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg | Sakura | 4511 | |
Pasteur Disposable Pipettes | Fisher Scientific | 12583237 | |
PBS Buffer 10x, 100 mL | MMF | F/T0020 | |
Reaction Buffer 10x | Roche | 5353955001 | |
Ribo Wash 10x | Roche | 5266262001 | |
RiboCC1 | Roche | 5266297001 | |
Secondary antibody anti-mouse | Abcam | ab133469 | |
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP | Roche | 760-4311 | |
Tissue Embedding center | MMF | EC 350 | |
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 28975.360 | |
Zeiss Axio Imager M2 microscope | upright bright-field microscope |
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