邻位连接测定可检测、定位和定量固定组织中的蛋白质精氨酸甲基化

摘要

当修饰的精氨酸残基未知和/或没有特异性抗体可用时，邻位连接测定是一种非常有用的技术，用于定位和定量给定蛋白质的精氨酸甲基化。

摘要

精氨酸甲基化正在成为一种关键的翻译后修饰，涉及广泛的生物过程。它在组织中的研究通常受到缺乏识别靶标精氨酸残基的特异性抗体的限制。邻位连接测定 （PLA） 最初是为了研究蛋白质/蛋白质相互作用而开发的。在这里，我们详细描述了一种专门用于检测精氨酸甲基化的 PLA 方案，我们将其应用于糖皮质激素受体 （GR）。之前已经证明 PRMT5 使细胞中的 GR 二甲基化，我们使用 PLA 与泛对称二甲基抗体和抗 GR 抗体来测量乳腺肿瘤中的 GR 甲基化。我们证明 PLA 提供了一种独特的方法来测量靶蛋白的精氨酸甲基化，即使尚未确定甲基化位点。该技术可以扩展到其他可用有效 pan 抗体的翻译后修饰。因此，我们以 GR 为例详细介绍了用于检测固定组织中精氨酸甲基化的 PLA 技术。

引言

蛋白质精氨酸甲基转移酶 （PRMT） 的精氨酸甲基化是一种丰富的翻译后修饰 （PTM），参与许多生物过程。PRMT 催化甲基从 S-腺苷甲硫氨酸转移到精氨酸残基。PRMT 家族由 9 个成员组成，根据它们执行的甲基化类型进行分类。所有成员都进行单甲基化 （MMA）。1 型 （PRMT1、2、3、4、6 和 8） PRMT 催化不对称二甲基化 （ADMA），而 2 型 （PRMT5 和 9） 催化对称二甲基化 （SDMA），而 3 型 （PRMT7） 仅产生 MMA¹。通过甲基化多种底物，不同的 PRMT 调节各种重要的细胞过程，例如 DNA 修复、转录调节、免疫反应、RNA 加工和信号转导 ^2,3。对于类固醇激素信号转导尤其如此，其中 PRMT 不仅通过甲基化受体本身，还甲基化其调节因子或组蛋白来改变类固醇受体的活性²。

精氨酸甲基化在癌症中被广泛研究，因为与正常组织相比，大多数 PRMT 在癌症中过表达，并且它们的表达通常与不良预后有关 ^4,5。体内精氨酸甲基化检测对于了解与这种修饰相关的细胞功能至关重要。这通常是通过使用识别甲基化精氨酸残基的特异性抗体进行免疫组织化学 （IHC） 来实现的。然而，这种方法非常有限，因为它基于修饰的精氨酸残基的鉴定，并依赖于所用抗体的功效。原位邻位连接测定 （PLA） 最初是为了研究固定细胞或组织中的蛋白质/蛋白质相互作用而开发的⁶。有趣的是，该技术还可用于使用针对目标修饰的 pan 抗体以及识别目标蛋白的抗体来检测 PTM。我们的团队之前使用抗 ERα 抗体和特异性识别精氨酸 260⁷ 上甲基化位点的抗体，将这项技术用于研究雌激素受体 α （ERα） 甲基化。值得注意的是，即使甲基化残基未知，该技术也可以扩展到识别特殊类型甲基化的抗体。事实上，有几家公司提供特异性识别 MMA、ADMA 或 SDMA 的泛抗体，这些抗体可以成功地用于研究体内蛋白质甲基化。

在这里，作为概念验证，我们详细分析了使用 SDMA 抗体在人乳腺肿瘤中进行 GR 甲基化，从实验设计到数据分析。

研究方案

获得每位患者的书面知情同意书。该研究方案得到了里昂癌症研究中心机构伦理委员会的批准。

1. 抗体的选择

1. 使用经 IHC 或免疫荧光 （IF） 验证的一抗。
   注：为研究选择的一抗对 PLA 的成功至关重要，尤其是在固定组织中。使用经 IHC 或 IF 验证的抗体将提高实验的成功率。在进行实验之前，需要对抗体进行优化和特异性分析，理想情况下，在目标蛋白表达无效的细胞中进行对照实验，并使用对所涉及的甲基转移酶的酶活性具有特异性的抑制剂。这里的条件之前已经优化过¹⁰.

2. 石蜡包埋的细胞系沉淀制备

注：将样品包埋在凝胶中，然后置于自动组织处理器中进行样品脱水和石蜡包埋。

1. 使用胰蛋白酶解离在 1.5 mL 微量离心管中制备细胞沉淀。
   注意：不要刮擦以收获细胞。
2. 将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
3. 在室温 （RT） 下以 200 x g 离心细胞。吸出 PBS 上清液。
4. 将沉淀重悬于 1 mL 4% 福尔马林中，并将试管在 4 °C 下储存 3 小时。
5. 用 1X Tris 缓冲盐水 （TBS） 洗涤细胞。
   注意：请勿使用磷酸盐基溶液，因为它会使凝胶解聚。
6. 加入 1 mL TBS 并通过涡旋匀浆 30 秒。以 200 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。
7. 重复步骤 2.5 到 2.7 两次。
8. 按照特定程序将组织纳入自动组织脱水机中：
   福尔马林 1 小时 37 °C
   蒸馏水 2 分钟 RT
   乙醇 70% 40 分钟 45 °C
   乙醇 80% 40 分钟 45 °C
   乙醇 95% 40 分钟 45 °C
   乙醇 100% 40 分钟 45 °C
   乙醇 100% 40 分钟 45 °C
   乙醇 100% 40 分钟 45 °C
   二甲苯 40 分钟 45 °C
   二甲苯 40 分钟 45 °C
   二甲苯 40 分钟 45 °C
   石蜡 1 小时 60 °C
   石蜡 1 小时 60 °C
   石蜡 1 小时 30 分钟 60 °C

3. 组织固定和玻片制备

1. 在纳入前将组织在 4% 福尔马林中固定 24 小时。
2. 用切片机切割含有组织的块的 3 μm 厚的连续切片。
3. 使用自动染色机进行脱蜡，将载玻片在二甲苯（10 分钟）、100% 乙醇（5 分钟）、95% 乙醇（5 分钟）和水（5 分钟）中依次孵育两次。
4. 使用 98 °C 水浴在适当的 pH 值（通常为 6-9）下，在 10 mM 柠檬酸盐缓冲液中进行热诱导表位修复 40 分钟。
   注：两种抗体必须在相同的 pH 值下起作用，该方法才能成功。在确定本文使用的最佳 pH 值之前，进行了几次测试。本研究中使用的抗体是 SDMA 抗体和 GR 抗体。
5. 让载玻片冷却 20 分钟，然后在 1x PBS 中洗涤 20 分钟。

4. IHC 实验

注：IHC 实验使用 Discovery XT 研究仪器（材料表）进行，以实现自动化和可重复性。

1. 为避免过氧化物酶淬灭，请使用二氨基联苯胺 （DAB） 试剂盒中包含的抑制剂。
2. 将玻片与在抗体稀释剂中稀释的两种一抗一起孵育 60 分钟。
3. 将玻片与抗兔辣根过氧化物酶 （HRP） 二抗孵育 16 分钟或抗小鼠抗体孵育 30 分钟。
   注：建议使用市售二氨基联苯胺 （DAB） 试剂盒（材料表）进行 IHC 检测。
4. 对样品进行苏木精（100 μL/玻片，8 分钟）和发蓝（100 μL/玻片，4 分钟）以对细胞核进行染色。
5. 用温肥皂水清洗玻片，然后使用自动染色剂脱水，并使用封固剂安装在自动盖玻片上。

5. 邻位连接测定反应

注：使用的所有试剂都包含在 PLA 试剂盒中（材料表）。建议对 1 cm² 的组织使用 40 μL 试剂。所有孵育都需要在潮湿的环境中进行，以防止过度蒸发。不要让样品变干，因为这可能会导致背景噪音。建议使用 1x 缓冲液 A（原位 洗涤缓冲液， 材料表）在罐子中进行洗涤。在搅拌下孵育样品时，罐中的最小体积应为 70 mL。样品在使用前应保存在 RT 中。

1. 过氧化物酶淬灭
   1. 使用疏水笔划定反应区域，以防止实验过程中溶液过度蒸发。每 1 cm² 每个样品加入一滴过氧化氢溶液。在 RT 孵育 5 分钟。
      注：建议根据使用的样品/抗体优化孵育时间。
2. 阻塞
   1. 将缓冲液 A 轻轻滴入样品上，并在缓冲液 A 中以 50 rpm 的速度在 RT 下搅拌洗涤 5 分钟。
   2. 轻敲剩余的缓冲液 A，每 1 cm² 添加一滴封闭溶液（包含在 PLA 试剂盒中）。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
3. 一抗孵育
   1. 在抗体稀释剂中稀释适当浓度的两种一抗。
   2. 从载玻片上去除封闭溶液，并立即添加一抗溶液（包含在 PLA 试剂盒中）。在 37 °C 的湿度室中孵育 1 小时。
4. PLA 探针孵育
   1. 在抗体稀释剂中用 PLA 探针 minus （1：5） 稀释 PLA 探针 PLUS （1：5）。
      注：对于 40 μL 反应，建议使用 8 μL PLA 探针不含原液 （5x）、8 μL PLA 探针加原液 （5x） 和 24 μL 抗体稀释剂。
   2. 将缓冲液 A 轻轻滴入样品上，并在 RT 下以 50 rpm 的转速在缓冲液 A 中洗涤 5 分钟。
   3. 轻敲剩余的缓冲液 A，然后将 PLA 探针溶液（包含在 PLA 试剂盒中）涂抹到样品上。在 37 °C 下孵育 1 小时。
5. 结扎
   1. 在以下步骤之前解冻连接缓冲液（包含在 PLA 试剂盒中）。
   2. 将缓冲液 A 轻轻滴入样品上，并在 RT 下以 50 rpm 的转速在缓冲液 A 中洗涤 5 分钟。
   3. 用高纯水稀释 5x 连接缓冲液 （1：5）（包含在 PLA 试剂盒中）。在将连接酶 （1：40） 添加到样品中之前，立即添加连接酶 （1：40）（包含在 PLA 试剂盒中）。
      注：建议将 8 μL 的 5x 连接缓冲液添加到 31 μL 高纯水中，进行 40 μL 反应。然后加入 1 μL 连接酶。
   4. 轻敲剩余的缓冲液 A，将连接酶溶液涂在样品上。在 37 °C 下孵育 30 分钟。
6. 放大
   1. 在以下步骤之前解冻扩增缓冲液。
   2. 将缓冲液 A 轻轻滴入样品上，并在缓冲液 A 中以 50 rpm 的速度在 RT 下洗涤 2 分钟。
   3. 在高纯水中稀释 5x 扩增缓冲液 （1：5）（包含在 PLA 试剂盒中）。立即加入聚合酶 （1：80）（包含在 PLA 试剂盒中），然后将其轻轻滴入样品上。
      注：建议将 8 μL 的 5x 连接缓冲液添加到 31.5 μL 高纯水中，进行 40 μL 反应。然后加入 0.5 μL 连接酶。
   4. 敲掉剩余的缓冲液 A，然后将扩增溶液涂在样品上。在 37 °C 下孵育 2 小时。
7. 检波
   1. 将缓冲液 A 轻轻滴入样品上，并在缓冲液 A 中以 50 rpm 的速度在 RT 下洗涤 2 分钟。
   2. 在高纯水中稀释 5x 检测明场缓冲液 （1：5）（包含在 PLA 试剂盒中）。
      注：建议将 8 μL 的 5x 检测缓冲液添加到 32 μL 高纯水中，进行 40 μL 反应。
   3. 轻敲剩余的缓冲液 A，然后将检测溶液涂抹在样品上。在 RT 下孵育 1 小时。
8. 基板开发
   1. 将缓冲液 A 轻轻滴入样品上，并在缓冲液 A 中以 50 rpm 的速度在 RT 下洗涤 2 分钟。
   2. 用高纯水中稀释底物试剂 A （1：70）、B （1：100）、C （1：100） 和 D （1：50）（包含在 PLA 试剂盒中）来稀释底物溶液。
      注：建议在 37.8 μL 高纯水中加入 0.6 μL 底物 A、0.4 μL 底物 B、0.4 μL 底物 C 和 0.8 μL 底物 D，进行 40 μL 反应。
   3. 敲掉剩余的缓冲液 A，然后将扩增溶液涂在样品上。在 RT 孵育 10 分钟。
9. 细胞核染色
   1. 将蒸馏水轻轻滴在样品上，并在 RT 下以 50 rpm 的蒸馏水洗涤 2 分钟。
   2. 敲掉剩余的蒸馏水。向每个 1 cm² 样品中加入一滴核染色剂（包含在 PLA 试剂盒中），并在室温下孵育 2 分钟。
   3. 用流动的自来水冲洗玻片 10 分钟，让污渍成熟并获得蓝色。不要使用积水。
10. 脱水
    1. 将玻片在含有 96% 乙醇的溶液中孵育两次，每次 2 分钟。然后将玻片在含有 99.7% 乙醇的溶液中孵育两次，每次 2 分钟。
    2. 将载玻片在二甲苯中孵育 10 分钟。然后将载玻片转移到新鲜的二甲苯中。
11. 安装滑轨
    1. 使用最小体积的非水性封固剂，并在样品顶部盖上盖玻片，确保盖玻片下没有气泡。
    2. 在明场显微镜上分析之前，让载玻片干燥。

6. 用于定位的成像

1. 使用正置显微镜采集图像。
   注意：在这项研究中，载玻片的成像是在正置明场显微镜下进行的（材料表）。在相同条件下以 40 倍放大倍率以自动方式获取至少 10 个随机选择的视野的图像。建议每种条件至少分析 500 个细胞。

7. 定量分析

注意：使用 ImageJ 软件⁸ 对样品进行定量。FIJI 是一个 ImageJ 发行版，包括 ImageJ 和其他预装插件，用于后续分析 ^9,10。

1. 要确定点数：
   1. 打开图像。
   2. 执行 颜色反卷积。为此，请单击 Image > Colors > Color Deconvolution。
   3. 选择文件名中的 image： - （color_1）。
   4. 使用 Find Maxima 命令确定点数 （Process > Find Maxima）。
2. 要确定单元格的数量：
   1. 打开图像。
   2. 执行 颜色反卷积。为此，请单击 Image > Colors > Color Deconvolution。
   3. 选择文件名中的 image： - （color_1）。
   4. 找到一个显示最大原子核数的阈值。为此，请单击 图像 > 亮度/对比度 > 阈值。
   5. 通过单击 Process > Binary > Fill Holes 来填充孔。
   6. 使用 watershed 命令将连接的零部件划分为单独的零部件。单击 Process > Binary > Watershed。
   7. 通过单击 Analyze > Analyze Particles 来确定原子核的数量。

结果

使用上述程序，可以检测和定量目标蛋白质的甲基化。在这里，我们展示了 PRMT5 甲基化 GR 的例子。PLA 的抗体和实验条件先前应用于细胞¹⁰。简而言之，靶向 GR 和 SDMA 的一抗通过与互补寡核苷酸偶联的邻位探针来识别。然后，当蛋白质非常接近时，就会发生环状 DNA 探针的杂交。该 DNA 的后续扩增在明场显微镜下通过 HRP 可视化（图 1

讨论

与其他 PTM 一样，精氨酸甲基化有助于蛋白质功能的精细调节。然而，由于难以评估这些修改，其影响被低估了，主要是因为缺乏工具。在研究 体内甲基化时尤其如此，其中测量精氨酸甲基化的唯一方法是拥有识别目标蛋白质甲基化残基的特异性抗体。这显然构成了一个限制，因为必须知道甲基化精氨酸残基，并且必须有用于修饰的特异性有效抗体用于 IHC 应用，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope