O ensaio de ligação de proximidade permite a detecção, localização e quantificação da metilação da proteína arginina em tecido fixo

Resumo

O ensaio de ligação de proximidade é uma técnica muito útil para localizar e quantificar a metilação da arginina de uma determinada proteína quando o resíduo de arginina modificado é desconhecido e/ou se nenhum anticorpo específico estiver disponível.

Resumo

A metilação da arginina está emergindo como uma modificação pós-traducional chave envolvida em uma ampla gama de processos biológicos. Seu estudo em tecido é frequentemente limitado pela falta de um anticorpo específico que reconheça o resíduo de arginina alvo. O ensaio de ligação de proximidade (PLA) foi originalmente desenvolvido para estudar as interações proteína/proteína. Aqui, descrevemos em detalhes um protocolo de PLA dedicado à detecção da metilação da arginina que aplicamos ao receptor de glicocorticóide (GR). Tendo mostrado anteriormente que o PRMT5 dimetila GRs nas células, usamos PLA com um anticorpo dimetil pan-simétrico e um anticorpo anti-GR para medir a metilação do GR em tumores de mama. Demonstramos que o PLA oferece uma abordagem única para medir a metilação da arginina de uma proteína-alvo, mesmo quando o local de metilação não foi identificado. Essa técnica pode ser estendida a outras modificações pós-traducionais onde anticorpos pan eficazes estão disponíveis. Portanto, detalhamos a tecnologia PLA usada para detectar a metilação da arginina em tecidos fixos usando GR como exemplo.

Introdução

A metilação da arginina por proteínas arginina metiltransferases (PRMTs) é uma modificação pós-traducional abundante (PTM) envolvida em vários processos biológicos. Os PRMTs catalisam a transferência de grupos metil dos resíduos de S-adenosil metionina para arginina. A família PRMT compreende nove membros classificados de acordo com o tipo de metilação que realizam. Todos os membros realizam monometilação (MMA). Os PRMTs do tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 e 8) catalisam a dimetilação assimétrica (ADMA), enquanto os tipos 2 (PRMT5 e 9) catalisam a dimetilação simétrica (SDMA) e o tipo 3 (PRMT7) geram apenas MMA¹. Ao metilar vários substratos, os diferentes PRMTs regulam uma ampla variedade de processos celulares importantes, como reparo de DNA, regulação transcricional, resposta imune, processamento de RNA e transdução de sinal ^2,3. Isso é particularmente verdadeiro para a sinalização de hormônios esteróides, onde os PRMTs modificam a atividade dos receptores de esteróides metilando não apenas os próprios receptores, mas também seus reguladores ou histonas².

A metilação da arginina é amplamente estudada no câncer, pois a maioria das PRMTs demonstrou ser superexpressa no câncer em comparação com os tecidos normais, e sua expressão é frequentemente associada a um mau prognóstico ^4,5. A detecção da metilação da arginina in vivo é essencial para entender as funções celulares associadas a essa modificação. Isso é convencionalmente obtido pela realização de imuno-histoquímica (IHQ) com um anticorpo específico que reconhece o resíduo de arginina metilada. No entanto, este método é muito limitado, pois se baseia na identificação do resíduo de arginina modificado e depende da eficácia do anticorpo usado. O ensaio de ligação de proximidade in situ (PLA) foi inicialmente desenvolvido para estudar as interações proteína/proteína em células ou tecidos fixos⁶. Curiosamente, essa tecnologia também pode ser usada para detectar PTMs usando um anticorpo pan contra a modificação de interesse, bem como um anticorpo que reconhece a proteína alvo. Nossa equipe adaptou anteriormente essa técnica para estudar a metilação do receptor de estrogênio alfa (ERα), usando um anticorpo anti-ERα e um anticorpo que reconhece especificamente o local de metilação na arginina 260⁷. É importante observar que essa técnica pode ser estendida a anticorpos que reconhecem um tipo especial de metilação, mesmo quando o resíduo metilado é desconhecido. De fato, várias empresas fornecem anticorpos pan que reconhecem especificamente MMA, ADMA ou SDMA que podem ser usados com sucesso para estudar a metilação de proteínas in vivo.

Aqui, como prova de conceito, apresentamos uma análise detalhada da metilação de GR usando o anticorpo SDMA em tumores de mama humanos, desde o desenho experimental até a análise de dados.

Protocolo

O consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional do Centro de Pesquisa do Câncer de Lyon.

1. Escolha dos anticorpos

1. Use anticorpos primários validados por IHQ ou imunofluorescência (IF).
   NOTA: Os anticorpos primários selecionados para o estudo são cruciais para o sucesso do PLA e, mais particularmente, no tecido fixo. O uso de um anticorpo validado por IHC ou IF aumentará a taxa de sucesso do experimento. A otimização e a especificidade dos anticorpos são necessárias antes da realização de experimentos, idealmente realizando experimentos de controle em células invalidadas para a expressão da proteína de interesse e usando um inibidor específico para a atividade enzimática da metiltransferase envolvida. Aqui, as condições foram previamente otimizadas¹⁰.

2. Preparação de pellets de linha celular embebida em parafina

NOTA: As amostras são incluídas em um gel e, em seguida, colocadas em um processador de tecidos automatizado para desidratação da amostra e inclusão de parafina.

1. Preparar o sedimento celular num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando a dissociação da tripsina.
   NOTA: Não raspe para colher células.
2. Ressuspenda o pellet celular em 1,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Centrifugar as pilhas à temperatura ambiente (RT) a 200 x g. Aspire o sobrenadante PBS.
4. Ressuspenda o pellet em 1 mL de formalina a 4% e armazene os tubos a 4 °C por 3 h.
5. Lave as células em 1X Tris-buffered-salino (TBS).
   NOTA: Não use uma solução à base de fosfato, pois ela despolimeriza o gel.
6. Adicione 1 mL de TBS e homogeneize por 30 s por vórtice. Centrifugue por 5 min a 200 x g e remova o sobrenadante.
7. Repita as etapas 2.5 a 2.7 duas vezes.
8. Realize a inclusão do tecido no processador de tecidos automatizado seguindo o programa específico:
   Formalina 1 h 37 °C
   Água destilada 2 min RT
   EtOH 70% 40 min 45 °C
   EtOH 80% 40 min 45 °C
   EtOH 95% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   Xileno 40 min 45 °C
   Xileno 40 min 45 °C
   Xileno 40 min 45 °C
   Parafina 1 h 60 °C
   Parafina 1 h 60 °C
   Parafina 1 h 30 min 60 °C

3. Fixação do tecido e preparação da lâmina

1. Fixe os tecidos em formol a 4% por 24 h antes da inclusão.
2. Corte cortes seriados de 3 μm de espessura dos blocos contendo tecidos com um micrótomo.
3. Realize a desparafinização com o autocorador incubando sequencialmente lâminas em xileno (10 min) duas vezes, etanol 100% (5 min), etanol 95% (5 min) e água (5 min).
4. Realize a recuperação de epítopos induzida por calor em tampão citrato 10 mM usando um banho-maria a 98 ° C por 40 min no pH apropriado (geralmente 6-9).
   NOTA: Os dois anticorpos precisam trabalhar no mesmo pH para que o método seja bem-sucedido. Vários testes foram realizados antes de estabelecer o pH ideal aqui utilizado. Os anticorpos usados neste estudo são o anticorpo SDMA e o anticorpo GR.
5. Deixe as lâminas esfriarem por 20 min e depois lave-as em 1x PBS por 20 min.

4. Experiência IHC

NOTA: Os experimentos IHC são realizados usando o instrumento de pesquisa Discovery XT (Tabela de Materiais) para automação e reprodutibilidade.

1. Para evitar a extinção da peroxidase, use o inibidor incluído no kit de diaminobenzidina (DAB).
2. Incubar as lâminas com os dois anticorpos primários diluídos no diluente de anticorpos durante 60 min.
3. Incube as lâminas com o anticorpo secundário anti-peroxidase de rabanete-cavalo (HRP) por 16 min ou o anticorpo anti-camundongo por 30 min.
   NOTA: Recomenda-se o uso de um kit comercial de diaminobenzidina (DAB) (Tabela de Materiais) para detecção de IHC.
4. Aplicar hematoxilina (100 μL/lâmina por 8 min) e azulamento (100 μL/lâmina por 4 min) nas amostras para corar os núcleos.
5. Lave as lâminas em água morna com sabão, desidrate usando um corador automático e monte em uma lama de cobertura automatizada usando um meio de montagem.

5. Reações do ensaio de ligação de proximidade

NOTA: Todos os reagentes utilizados estão incluídos nos kits PLA (Tabela de Materiais). Recomenda-se o uso de 40 μL de reagente para 1 cm² de tecido. Todas as incubações precisam ser realizadas em um ambiente úmido para evitar evaporação excessiva. Não deixe a amostra secar, pois isso pode causar ruído de fundo. Recomenda-se o uso de 1x tampão A (tampão de lavagem in situ , Tabela de Materiais) para as lavagens nos frascos. Deve haver um volume mínimo de 70 mL nos frascos ao incubar amostras sob agitação. As amostras devem ser mantidas em RT antes do uso.

1. Têmpera da peroxidase
   1. Delimitar a área de reacção com uma caneta hidrofóbica para evitar a evaporação excessiva da solução durante a experiência. Adicionar uma gota de solução de peróxido de hidrogénio por cada 1^cm2 de cada amostra. Incube por 5 min em RT.
      NOTA: Recomenda-se otimizar o tempo de incubação de acordo com as amostras/anticorpos utilizados.
2. Bloqueio
   1. Goteje suavemente o tampão A nas amostras e lave no tampão A a 50 rpm sob agitação por 5 min em RT.
   2. Retire o tampão A restante e adicione uma gota por 1 cm² de solução de bloqueio (incluída no kit PLA). Incubar durante 30 min a 37 °C.
3. Incubação primária de anticorpos
   1. Diluir os dois anticorpos primários em concentrações adequadas no diluente de anticorpos.
   2. Remova a solução de bloqueio das lâminas e adicione imediatamente a solução de anticorpo primário (incluída no kit PLA). Incubar durante 1 h numa câmara de humidade a 37 °C.
4. Incubação de sonda PLA
   1. Diluir a sonda PLA PLUS (1:5) com a sonda PLA menos (1:5) no diluente de anticorpos.
      NOTA: Recomenda-se usar 8 μL de sonda PLA menos estoque (5x), 8 μL de sonda PLA mais estoque (5x) e 24 μL de diluente de anticorpos para uma reação de 40 μL.
   2. Goteje suavemente o tampão A nas amostras e lave no tampão A a 50 rpm por 5 min em RT.
   3. Retire o tampão A restante e aplique a solução de sonda PLA (incluída no kit PLA) às amostras. Incubar durante 1 h a 37 °C.
5. Ligadura
   1. Descongele o tampão de ligação (incluído no kit PLA) antes das etapas a seguir.
   2. Goteje suavemente o tampão A nas amostras e lave no tampão A a 50 rpm por 5 min em RT.
   3. Dilua o tampão de ligadura 5x (1:5) (incluído no kit PLA) em água de alta pureza. Adicione a ligase (1:40) (incluída no kit PLA) imediatamente antes de adicioná-la à amostra.
      NOTA: Recomenda-se adicionar 8 μL do tampão de ligação 5x a 31 μL de água de alta pureza para uma reação de 40 μL. Em seguida, adicione 1 μL de ligase.
   4. Retire o tampão A restante e aplique a solução de ligase às amostras. Incubar durante 30 min a 37 °C.
6. Amplificação
   1. Descongele o buffer de amplificação antes das etapas a seguir.
   2. Goteje suavemente o tampão A nas amostras e lave no tampão A a 50 rpm por 2 min em RT.
   3. Dilua o tampão de amplificação 5x (1:5) (incluído no kit PLA) em água de alta pureza. Adicione a polimerase (1:80) (incluída no kit PLA) imediatamente antes de pingar suavemente na amostra.
      NOTA: Recomenda-se adicionar 8 μL do tampão de ligação 5x a 31,5 μL de água de alta pureza para uma reação de 40 μL. Em seguida, adicione 0,5 μL de ligase.
   4. Retire o tampão A restante e aplique a solução de amplificação às amostras. Incubar durante 2 h a 37 °C.
7. Detecção
   1. Goteje suavemente o tampão A nas amostras e lave no tampão A a 50 rpm por 2 min em RT.
   2. Dilua o tampão de campo claro de detecção 5x (1:5) (incluído no kit PLA) em água de alta pureza.
      NOTA: Recomenda-se adicionar 8 μL do tampão de detecção 5x a 32 μL de água de alta pureza para uma reação de 40 μL.
   3. Retire o tampão A restante e aplique a solução de detecção às amostras. Incubar por 1 h em RT.
8. Desenvolvimento de substrato
   1. Goteje suavemente o tampão A nas amostras e lave no tampão A a 50 rpm por 2 min em RT.
   2. Dilua a solução de substrato diluindo os reagentes de substrato A (1:70), B (1:100), C (1:100) e D (1:50) (incluídos no kit PLA) em água de alta pureza.
      NOTA: Recomenda-se adicionar 0,6 μL de substrato A, 0,4 μL de substrato B, 0,4 μL de substrato C e 0,8 μL de substrato D em 37,8 μL de água de alta pureza para uma reação de 40 μL.
   3. Retire o tampão A restante e aplique a solução de amplificação às amostras. Incubar por 10 min em RT.
9. Coloração nuclear
   1. Pingue suavemente água destilada nas amostras e lave em água destilada a 50 rpm por 2 min em RT.
   2. Retire a água destilada restante. Adicione uma gota de corante nuclear (incluída no kit PLA) a cada amostra de 1 cm² e incube por 2 min em RT.
   3. Enxágue as lâminas em água corrente da torneira por 10 min para deixar a mancha amadurecer e obter uma coloração azulada. Não use água da torneira parada.
10. Desidratação
    1. Incubar as lâminas em uma solução contendo etanol a 96% duas vezes por 2 min. Em seguida, incubar as lâminas em uma solução contendo etanol a 99,7% duas vezes por 2 min.
    2. Incubar as lâminas em xileno durante 10 min. Em seguida, transfira as lâminas para xileno fresco.
11. Montagem das corrediças
    1. Use um volume mínimo de meio de montagem não aquoso e aplique uma lamínula em cima da amostra, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa sob as lamínulas.
    2. Deixe as lâminas secarem antes de analisar em um microscópio de campo claro.

6. Imagem para localização

1. Adquira imagens usando um microscópio vertical.
   NOTA: Neste estudo, a imagem das lâminas foi realizada em um microscópio vertical de campo claro (Tabela de Materiais). As imagens foram adquiridas em condições idênticas com ampliação de 40x para pelo menos 10 campos de visão escolhidos aleatoriamente de maneira automatizada. Recomenda-se analisar um mínimo de 500 células por condição.

7. Análise para quantificação

NOTA: A quantificação das amostras foi realizada por meio do software ImageJ⁸. FIJI, uma distribuição ImageJ incluindo ImageJ e outros plugins pré-instalados, foi usada para as análises subsequentes ^9,10.

1. Para determinar o número de pontos:
   1. Abra a imagem.
   2. Execute a deconvolução de cores. Para isso, clique em Imagem > Cores > Deconvolução de Cores.
   3. Selecione a imagem: - (color_1) no nome do arquivo.
   4. Use o comando Localizar Máximos para determinar o número de pontos (Processar > Localizar Máximos).
2. Para determinar o número de células:
   1. Abra a imagem.
   2. Execute a deconvolução de cores. Para isso, clique em Imagem > Cores > Deconvolução de Cores.
   3. Selecione a imagem: - (color_1) no nome do arquivo.
   4. Encontre um limite que mostre o número máximo de núcleos. Para isso, clique em Imagem > Brilho/Contraste > Limite.
   5. Preencha os buracos clicando em Processar > Binário > Preencher Furos.
   6. Use o comando watershed para dividir os componentes conectados em componentes separados. Clique em Processar > Binário > Bacia Hidrográfica.
   7. Analise partículas para determinar o número de núcleos clicando em Analisar > Analisar Partículas.

Resultados

Usando o procedimento descrito acima, é possível detectar e quantificar a metilação de uma proteína de interesse. Aqui, mostramos o exemplo da metilação da RG por PRMT5. Os anticorpos e as condições experimentais para PLA foram previamente aplicados às células¹⁰. Resumidamente, os anticorpos primários direcionados a GR e SDMA são reconhecidos por sondas de proximidade conjugadas com oligonucleotídeos complementares. Então, a hibridização de uma so...

Discussão

A metilação da arginina, como outros PTMs, contribui para a regulação fina das funções das proteínas. No entanto, seu impacto é subestimado devido à dificuldade em avaliar essas modificações, principalmente devido à falta de ferramentas. Isso é particularmente verdadeiro ao estudar a metilação in vivo, onde a única maneira de medir a metilação da arginina é possuir anticorpos específicos que reconheçam o resíduo metilado da proteína de interesse. Isso cons...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope