Yakınlık ligasyonu testi, sabit dokuda protein arginin metilasyonunun saptanmasına, lokalizasyonuna ve miktarının belirlenmesine izin verir

Özet

Yakınlık ligasyon testi, modifiye edilmiş arginin kalıntısı bilinmediğinde ve/veya spesifik bir antikor mevcut olmadığında belirli bir proteinin arginin metilasyonunu lokalize etmek ve ölçmek için çok yararlı bir tekniktir.

Özet

Arginin metilasyonu, çok çeşitli biyolojik süreçlerde yer alan önemli bir translasyon sonrası modifikasyon olarak ortaya çıkmaktadır. Dokudaki çalışması genellikle hedef arginin kalıntısını tanıyan spesifik bir antikorun olmaması ile sınırlıdır. Yakınlık ligasyon testi (PLA) başlangıçta protein / protein etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir. Burada, glukokortikoid reseptörüne (GR) uyguladığımız arginin metilasyonunun tespitine adanmış bir PLA protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Daha önce PRMT5'in hücrelerde GR'leri dimetilat ettiğini gösterdikten sonra, meme tümörlerinde GR metilasyonunu ölçmek için bir pan simetrik dimetil antikoru ve bir anti-GR antikoru ile PLA kullandık. PLA'nın, metilasyon bölgesi tanımlanmamış olsa bile, bir hedef proteinin arginin metilasyonunu ölçmek için benzersiz bir yaklaşım sunduğunu gösteriyoruz. Bu teknik, etkili pan antikorlarının mevcut olduğu diğer translasyon sonrası modifikasyonlara genişletilebilir. Bu nedenle, örnek olarak GR kullanarak sabit dokuda arginin metilasyonunu tespit etmek için kullanılan PLA teknolojisini detaylandırıyoruz.

Giriş

Protein arginin metiltransferazlar (PRMT'ler) ile arginin metilasyonu, çok sayıda biyolojik süreçte yer alan bol miktarda bir translasyon sonrası modifikasyondur (PTM). PRMT'ler, metil gruplarının S-adenosil metiyoninden arginin kalıntılarına transferini katalize eder. PRMT ailesi, gerçekleştirdikleri metilasyon tipine göre sınıflandırılmış dokuz üyeden oluşur. Tüm üyeler monometilasyon (MMA) gerçekleştirir. Tip 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ve 8) PRMT'ler asimetrik dimetilasyonu (ADMA) katalize ederken, tip 2 (PRMT5 ve 9) simetrik dimetilasyonu (SDMA) katalize eder ve tip 3 (PRMT7) sadece MMA¹ üretir. Çok sayıda substratı metilleyerek, farklı PRMT'ler DNA onarımı, transkripsiyonel düzenleme, bağışıklık tepkisi, RNA işleme ve sinyal iletimi gibi çok çeşitli önemli hücresel süreçleri düzenler ^2,3. Bu, özellikle PRMT'lerin steroid reseptörlerinin aktivitesini sadece reseptörlerin kendilerini değil, aynı zamanda düzenleyicilerini veya histonlarını² metilleyerek değiştirdiği steroid hormon sinyali için geçerlidir.

Arginin metilasyonu büyük ölçüde kanserde incelenmiştir, çünkü PRMT'lerin çoğunun kanserde normal dokulara kıyasla aşırı eksprese edildiği gösterilmiştir ve ekspresyonları genellikle kötü prognoz^{ile ilişkilidir 4,5}. Arginin metilasyonunun in vivo olarak saptanması, bu modifikasyonla ilişkili hücresel fonksiyonların anlaşılmasında esastır. Bu, geleneksel olarak, metillenmiş arginin kalıntısını tanıyan spesifik bir antikor ile immünohistokimya (IHC) yapılarak elde edilir. Bununla birlikte, bu yöntem, modifiye edilmiş arginin kalıntısının tanımlanmasına dayandığından ve kullanılan antikorun etkinliğine dayandığından çok sınırlıdır. İn situ yakınlık ligasyon testi (PLA) başlangıçta sabit hücrelerde veya dokularda protein / protein etkileşimlerini incelemek için geliştirilmiştir⁶. İlginç bir şekilde, bu teknoloji, ilgilenilen modifikasyona karşı bir pan antikoru ve ayrıca hedeflenen proteini tanıyan bir antikor kullanarak PTM'leri tespit etmek için de kullanılabilir. Ekibimiz daha önce bu tekniği östrojen reseptörü alfa (ERα) metilasyonunu incelemek için uyarlamış, bir anti-ERα antikoru ve arginin 260⁷ üzerindeki metilasyon bölgesini spesifik olarak tanıyan bir antikor kullanmıştı. Dikkat çekici bir şekilde, bu teknik, metillenmiş kalıntı bilinmediğinde bile özel bir metilasyon tipini tanıyan antikorlara genişletilebilir. Gerçekten de, birkaç şirket, in vivo protein metilasyonunu incelemek için başarıyla kullanılabilen MMA, ADMA veya SDMA'yı özel olarak tanıyan pan antikorları tedarik etmektedir.

Burada, bir kavram kanıtı olarak, deneysel tasarımdan veri analizine kadar insan meme tümörlerinde SDMA antikoru kullanılarak GR metilasyonunun ayrıntılı bir analizini sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Her hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Çalışma protokolü, Lyon Kanser Araştırma Merkezi kurumsal etik kurulu tarafından onaylandı.

1. Antikorların seçimi

1. IHC veya immünofloresan (IF) ile doğrulanmış birincil antikorları kullanın.
   NOT: Çalışma için seçilen primer antikorlar, PLA'nın başarısı için ve özellikle sabit dokuda çok önemlidir. IHC veya IF tarafından doğrulanmış bir antikor kullanmak, deneyin başarı oranını artıracaktır. Deneyler yapılmadan önce antikorların optimizasyonu ve özgüllüğü gereklidir, ideal olarak ilgilenilen proteinin ekspresyonu için geçersiz kılınmış hücrelerde kontrol deneyleri yapılarak ve ilgili metiltransferazın enzimatik aktivitesine özgü bir inhibitör kullanılarak. Burada koşullar daha önce optimize edilmiştir¹⁰.

2. Parafine gömülü hücre hattı pelet hazırlama

NOT: Numuneler bir jel içine gömülür ve daha sonra numune dehidrasyonu ve parafin gömülmesi için otomatik bir doku işlemcisine yerleştirilir.

1. Tripsin ayrışması kullanarak hücre peletini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın.
   NOT: Hücreleri hasat etmek için kazımayın.
2. Hücre peletini 1.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.
3. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 200 x g'da santrifüjleyin. PBS süpernatantını aspire edin.
4. Peleti 1 mL% 4 formalin içinde tekrar süspanse edin ve tüpleri 3 saat boyunca 4 ° C'de saklayın.
5. Hücreleri 1X Tris-tamponlu salin (TBS) içinde yıkayın.
   NOT: Jeli depolimerize ettiği için fosfat bazlı bir çözelti kullanmayın.
6. 1 mL TBS ekleyin ve girdaplama ile 30 saniye boyunca homojenize edin. 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
7. 2.5 ile 2.7 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın.
8. Spesifik programı izleyerek dokunun otomatik doku işlemcisine dahil edilmesini gerçekleştirin:
   Formalin 1 sa 37 °C
   Damıtılmış su 2 dk RT
   EtOH %70 40 dk 45 °C
   EtOH %80 40 dk 45 °C
   EtOH %95 40 dk 45 °C
   EtOH %100 40 dk 45 °C
   EtOH %100 40 dk 45 °C
   EtOH %100 40 dk 45 °C
   Ksilen 40 dk 45 °C
   Ksilen 40 dk 45 °C
   Ksilen 40 dk 45 °C
   Parafin 1 sa 60 °C
   Parafin 1 sa 60 °C
   Parafin 1 saat 30 dk 60 °C

3. Doku fiksasyonu ve slayt hazırlama

1. Dokuları, dahil edilmeden önce 24 saat boyunca% 4 formalin içinde sabitleyin.
2. Doku içeren blokların 3 μm kalınlığında seri kesitlerini bir mikrotom ile kesin.
3. Slaytları ksilen (10 dakika) içinde iki kez,% 100 etanol (5 dakika),% 95 etanol (5 dakika) ve su (5 dakika) içinde sırayla inkübe ederek otomatik boyalayıcı ile deparafinizasyon gerçekleştirin.
4. Uygun pH'ta (genellikle 6-9) 40 dakika boyunca 98 ° C'de bir su banyosu kullanarak 10 mM sitrat tamponunda ısıya bağlı epitop alımı gerçekleştirin.
   NOT: Yöntemin başarılı olması için iki antikorun aynı pH'ta çalışması gerekir. Burada kullanılan optimum pH'ı belirlemeden önce birkaç test yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan antikorlar SDMA antikoru ve GR antikorudur.
5. Slaytları 20 dakika soğumaya bırakın, ardından 1x PBS'de 20 dakika yıkayın.

4. IHC deneyi

NOT: IHC deneyleri, otomasyon ve tekrarlanabilirlik için Discovery XT araştırma aracı (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. Peroksidaz söndürmesini önlemek için, diaminobenzidin (DAB) kitinde bulunan inhibitörü kullanın.
2. Slaytları, antikor seyrelticisinde seyreltilmiş iki birincil antikor ile 60 dakika boyunca inkübe edin.
3. Slaytları ikincil tavşan önleyici at turpu peroksidaz (HRP) antikoru ile 16 dakika veya anti-fare antikoru ile 30 dakika inkübe edin.
   NOT: IHC tespiti için ticari bir diaminobenzidin (DAB) kiti (Malzeme Tablosu) kullanılması önerilir.
4. Çekirdekleri boyamak için numunelere hematoksilen (8 dakika boyunca 100 μL / slayt) ve mavileştirme (4 dakika boyunca 100 μL / slayt) uygulayın.
5. Slaytları ılık sabunlu suda yıkayın, ardından bir otomatik boyayıcı kullanarak kurutun ve bir montaj ortamı kullanarak otomatik bir kapak terliği üzerine monte edin.

5. Yakınlık ligasyonu test reaksiyonları

NOT: Kullanılan tüm reaktifler PLA kitlerine dahildir (Malzeme Tablosu). 1^cm2 doku için 40 μL reaktif kullanılması tavsiye edilir. Aşırı buharlaşmayı önlemek için tüm inkübasyonların nemli bir ortamda yapılması gerekir. Arka plan gürültüsüne neden olabileceğinden numunenin kurumasına izin vermeyin. Kavanozlardaki yıkamalar için 1x tampon A (yerinde yıkama tamponu, Malzeme Tablosu) kullanılması tavsiye edilir. Numuneler çalkalama altında inkübe edilirken kavanozlarda minimum 70 mL hacim olmalıdır. Numuneler kullanılmadan önce RT'de tutulmalıdır.

1. Peroksidaz söndürme
   1. Deney sırasında çözeltinin aşırı buharlaşmasını önlemek için hidrofobik bir kalem kullanarak reaksiyon alanını sınırlayın. Her numunenin 1^cm2'si başına bir damla hidrojen peroksit çözeltisi ekleyin. RT'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Kuluçka süresinin kullanılan numunelere/antikorlara göre optimize edilmesi önerilir.
2. Engelleme
   1. Tampon A'yı numunelerin üzerine nazikçe damlatın ve RT'de 5 dakika boyunca çalkalama altında 50 rpm'de tampon A'da yıkayın.
   2. Kalan tampon A'ya dokunun ve her 1^cm2 engelleme çözeltisine bir damla ekleyin (PLA kitinde bulunur). 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
3. Birincil antikor inkübasyonu
   1. İki birincil antikoru, antikor seyrelticisindeki uygun konsantrasyonlarda seyreltin.
   2. Blokaj solüsyonunu slaytlardan çıkarın ve hemen birincil antikor solüsyonunu (PLA kitinde bulunur) ekleyin. 37 °C'de bir nem odasında 1 saat inkübe edin.
4. PLA prob inkübasyonu
   1. PLA probu ARTI'yı (1:5) antikor seyrelticisindeki PLA probu eksi (1:5) ile seyreltin.
      NOT: 40 μL'lik bir reaksiyon için 8 μL PLA probu eksi stok (5x), 8 μL PLA probu artı stok (5x) ve 24 μL antikor seyreltici kullanılması önerilir.
   2. Tampon A'yı numunelerin üzerine nazikçe damlatın ve tampon A'da 50 rpm'de RT'de 5 dakika yıkayın.
   3. Kalan tampon A'ya dokunun ve PLA prob çözeltisini (PLA kitinde bulunur) numunelere uygulayın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
5. Ligasyon
   1. Aşağıdaki adımlardan önce ligasyon tamponunu (PLA kitinde bulunur) çözün.
   2. Tampon A'yı numunelerin üzerine nazikçe damlatın ve tampon A'da 50 rpm'de RT'de 5 dakika yıkayın.
   3. 5x ligasyon tamponunu (1:5) (PLA kitinde bulunur) yüksek saflıkta suyla seyreltin. Ligazı, numuneye eklemeden hemen önce (1:40) (PLA kitinde bulunur) ekleyin.
      NOT: 40 μL'lik bir reaksiyon için 31 μL yüksek saflıkta suya 8 μL 5x ligasyon tamponu eklenmesi önerilir. Sonra 1 μL ligaz ekleyin.
   4. Kalan tampon A'ya hafifçe vurun ve ligaz çözeltisini numunelere uygulayın. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Amplifikasyon
   1. Aşağıdaki adımlardan önce amplifikasyon arabelleğini çözün.
   2. Tampon A'yı numunelerin üzerine nazikçe damlatın ve tampon A'da 50 rpm'de RT'de 2 dakika yıkayın.
   3. 5x amplifikasyon tamponunu (1:5) (PLA kitinde bulunur) yüksek saflıkta suyla seyreltin. Polimerazı (1:80) (PLA kitinde bulunur) numuneye nazikçe damlatmadan hemen önce ekleyin.
      NOT: 40 μL'lik bir reaksiyon için 31,5 μL yüksek saflıkta suya 8 μL 5x ligasyon tamponu eklenmesi önerilir. Ardından 0,5 μL ligaz ekleyin.
   4. Kalan tampon A'ya dokunun ve amplifikasyon solüsyonunu numunelere uygulayın. 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
7. Algılama
   1. Tampon A'yı numunelerin üzerine nazikçe damlatın ve tampon A'da 50 rpm'de RT'de 2 dakika yıkayın.
   2. 5x algılamalı parlak alan tamponunu (1:5) (PLA kitinde bulunur) yüksek saflıkta suyla seyreltin.
      NOT: 40 μL'lik bir reaksiyon için 32 μL yüksek saflıkta suya 8 μL 5x algılama tamponu eklenmesi önerilir.
   3. Kalan tampon A'ya dokunun ve algılama solüsyonunu numunelere uygulayın. RT'de 1 saat inkübe edin.
8. Substrat geliştirme
   1. Tampon A'yı numunelerin üzerine nazikçe damlatın ve tampon A'da 50 rpm'de RT'de 2 dakika yıkayın.
   2. Substrat reaktifleri A (1:70), B (1:100), C (1:100) ve D (1:50) (PLA kitinde bulunur) yüksek saflıkta suda seyrelterek substrat çözeltisini seyreltin.
      NOT: 40 μL'lik bir reaksiyon için 37,8 μL yüksek saflıkta suya 0,6 μL substrat A, 0,4 μL substrat B, 0,4 μL substrat C ve 0,8 μL substrat D eklenmesi önerilir.
   3. Kalan tampon A'ya dokunun ve amplifikasyon solüsyonunu numunelere uygulayın. RT'de 10 dakika inkübe edin.
9. Nükleer boyama
   1. Numunelerin üzerine damıtılmış suyu nazikçe damlatın ve RT'de 2 dakika boyunca 50 rpm'de damıtılmış suda yıkayın.
   2. Kalan damıtılmış suyu hafifçe vurun. Her 1^cm2 örneğine bir damla nükleer leke (PLA kitinde bulunur) ekleyin ve RT'de 2 dakika inkübe edin.
   3. Lekenin olgunlaşması ve mavi bir renk elde etmesi için slaytları akan musluk suyu altında 10 dakika durulayın. Durgun musluk suyu kullanmayın.
10. Dehidratasyon
    1. Slaytları% 96 etanol içeren bir çözelti içinde iki kez 2 dakika inkübe edin. Daha sonra slaytları %99,7 etanol içeren bir çözelti içinde iki kez 2 dakika inkübe edin.
    2. Slaytları ksilen içinde 10 dakika inkübe edin. Ardından slaytları taze ksilene aktarın.
11. Kızakların montajı
    1. Minimum hacimde susuz montaj ortamı kullanın ve numunenin üzerine bir lamel uygulayın, böylece lamellerin altına hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.
    2. Parlak alan mikroskobunda analiz etmeden önce slaytların kurumasını bekleyin.

6. Lokalizasyon için görüntüleme

1. Dik bir mikroskop kullanarak görüntüler elde edin.
   NOT: Bu çalışmada, slaytların görüntülenmesi dik parlak alan mikroskobu altında gerçekleştirilmiştir (Malzeme Tablosu). Görüntüler, otomatik bir şekilde rastgele seçilen en az 10 görüş alanı için 40x büyütmede aynı koşullar altında elde edildi. Koşul başına en az 500 hücrenin analiz edilmesi önerilir.

7. Kantitasyon analizi

NOT: Numunelerin miktar tayini ImageJ yazılımı⁸ kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonraki analizler için ImageJ ve diğer önceden yüklenmiş eklentileri içeren bir ImageJ dağıtımı olan FIJI^{kullanıldı 9,10}.

1. Nokta sayısını belirlemek için:
   1. Resmi açın.
   2. Renk evrişimini giderme işlemi gerçekleştirin. Bunun için Image > Colors > Color Deconvolution'a tıklayın.
   3. Dosya adında resim: - (color_1) öğesini seçin.
   4. Nokta sayısını belirlemek için Maxima'yı Bul komutunu kullanın (İşlem > Maxima'yı Bul).
2. Hücre sayısını belirlemek için:
   1. Resmi açın.
   2. Renk evrişimini giderme işlemi gerçekleştirin. Bunun için Image > Colors > Color Deconvolution'a tıklayın.
   3. Dosya adında resim: - (color_1) öğesini seçin.
   4. Maksimum çekirdek sayısını gösteren bir eşik bulun. Bunun için Görüntü > Parlaklık/Kontrast > Eşiği üzerine tıklayın.
   5. İşlem > İkili > Boşlukları Doldur'a tıklayarak delikleri doldurun.
   6. Bağlı bileşenleri ayrı bileşenlere bölmek için watershed komutunu kullanın. İşlem > İkili > Havzası'na tıklayın.
   7. Parçacıkları Analiz Et > Analiz Et'e tıklayarak çekirdek sayısını belirlemek için parçacıkları analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedürü kullanarak, ilgilenilen bir proteinin metilasyonunu tespit etmek ve ölçmek mümkündür. Burada, GR'nin PRMT5 ile metilasyonu örneğini gösteriyoruz. PLA için antikorlar ve deneysel koşullar daha önce¹⁰ hücrelerine uygulanmıştı. Kısaca, GR ve SDMA'yı hedefleyen primer antikorlar, tamamlayıcı oligonükleotidlerle konjuge edilmiş yakınlık probları ile tanınır. Daha sonra, dairesel bir DNA probunun hibridizasyonu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Arginin metilasyonu, diğer PTM'ler gibi, protein fonksiyonlarının ince düzenlenmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, öncelikle araç eksikliği nedeniyle, bu değişikliklerin değerlendirilmesindeki zorluk nedeniyle etkisi hafife alınmaktadır. Bu, özellikle arginin metilasyonunu ölçmenin tek yolunun, ilgilenilen proteinin metillenmiş kalıntısını tanıyan spesifik antikorlara sahip olmak olduğu in vivo metilasyonu incelerken geçerlidir. Metillenmiş arginin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope