El ensayo de ligadura de proximidad permite la detección, localización y cuantificación de la metilación de la proteína arginina en tejido fijo

Resumen

El ensayo de ligadura de proximidad es una técnica muy útil para localizar y cuantificar la metilación de arginina de una proteína determinada cuando se desconoce el residuo de arginina modificado y/o si no se dispone de un anticuerpo específico.

Resumen

La metilación de arginina está emergiendo como una modificación postraduccional clave involucrada en una amplia gama de procesos biológicos. Su estudio en tejidos a menudo está limitado por la falta de un anticuerpo específico que reconozca el residuo de arginina objetivo. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) se desarrolló originalmente para estudiar las interacciones proteína/proteína. En este trabajo describimos en detalle un protocolo de PLA dedicado a la detección de la metilación de arginina que aplicamos al receptor de glucocorticoides (GR). Habiendo demostrado previamente que PRMT5 dimetila GRs en las células, utilizamos PLA con un anticuerpo dimetil pansimétrico y un anticuerpo anti-GR para medir la metilación de GR en tumores de mama. Demostramos que el PLA ofrece un enfoque único para medir la metilación de arginina de una proteína diana, incluso cuando no se ha identificado el sitio de metilación. Esta técnica podría extenderse a otras modificaciones postraduccionales en las que se dispone de anticuerpos panes eficaces. De ahí que detallemos la tecnología PLA utilizada para detectar la metilación de arginina en tejido fijo utilizando como ejemplo la GR.

Introducción

La metilación de arginina por la proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) es una abundante modificación postraduccional (PTM) involucrada en numerosos procesos biológicos. Las PRMT catalizan la transferencia de grupos metilo de la S-adenosil metionina a los residuos de arginina. La familia PRMT está compuesta por nueve miembros clasificados según el tipo de metilación que realizan. Todos los miembros realizan la monometilación (MMA). Las PRMT de tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 y 8) catalizan la dimetilación asimétrica (ADMA), mientras que las de tipo 2 (PRMT5 y 9) catalizan la dimetilación simétrica (SDMA) y las de tipo 3 (PRMT7) solo generan MMA¹. Al metilar numerosos sustratos, los diferentes PRMT regulan una amplia variedad de procesos celulares importantes, como la reparación del ADN, la regulación transcripcional, la respuesta inmunitaria, el procesamiento del ARN y la transducción de señales ^2,3. Esto es particularmente cierto para la señalización de hormonas esteroideas, donde los PRMT modifican la actividad de los receptores de esteroides metilando no solo los receptores en sí, sino también sus reguladores o histonas².

La metilación de la arginina se ha estudiado ampliamente en el cáncer, ya que se ha demostrado que la mayoría de los PRMT están sobreexpresados en el cáncer en comparación con los tejidos normales, y su expresión se asocia a menudo con un mal pronóstico ^4,5. La detección de la metilación de arginina in vivo es esencial para comprender las funciones celulares asociadas con esta modificación. Esto se logra convencionalmente mediante la realización de inmunohistoquímica (IHQ) con un anticuerpo específico que reconoce el residuo de arginina metilado. Sin embargo, este método es muy limitado, ya que se basa en la identificación del residuo de arginina modificada y se basa en la eficacia del anticuerpo utilizado. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) in situ se desarrolló inicialmente para estudiar las interacciones proteína/proteína en células o tejidos fijos⁶. Curiosamente, esta tecnología también se puede utilizar para detectar PTM utilizando un anticuerpo panforme contra la modificación del interés, así como un anticuerpo que reconoce la proteína objetivo. Nuestro equipo adaptó previamente esta técnica para estudiar la metilación del receptor de estrógeno alfa (ERα), utilizando un anticuerpo anti-ERα y un anticuerpo que reconoce específicamente el sitio de metilación de la arginina 260⁷. Cabe destacar que esta técnica puede extenderse a los anticuerpos que reconocen un tipo especial de metilación, incluso cuando se desconoce el residuo metilado. De hecho, varias empresas suministran anticuerpos pan que reconocen específicamente MMA, ADMA o SDMA que pueden utilizarse con éxito para estudiar la metilación de proteínas in vivo.

Aquí, como prueba de concepto, presentamos un análisis detallado de la metilación de GR utilizando el anticuerpo SDMA en tumores de mama humanos desde el diseño experimental hasta el análisis de datos.

Protocolo

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente. El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética institucional del Centro de Investigación del Cáncer de Lyon.

1. Elección de los anticuerpos

1. Utilizar anticuerpos primarios validados por IHQ o inmunofluorescencia (IF).
   NOTA: Los anticuerpos primarios seleccionados para el estudio son cruciales para el éxito del PLA y, más concretamente, en el tejido fijo. El uso de un anticuerpo validado por IHQ o IF aumentará la tasa de éxito del experimento. La optimización y especificidad de los anticuerpos son necesarias antes de realizar experimentos, idealmente mediante la realización de experimentos de control en células invalidadas para la expresión de la proteína de interés y el uso de un inhibidor específico de la actividad enzimática de la metiltransferasa involucrada. Aquí las condiciones se han optimizado previamente¹⁰.

2. Preparación de pellets de línea celular incluidos en parafina

NOTA: Las muestras se incrustan en un gel y luego se colocan en un procesador de tejidos automatizado para la deshidratación de la muestra y la inclusión en parafina.

1. Prepare el pellet de celda en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL utilizando disociación de tripsina.
   NOTA: No raspe para recolectar células.
2. Vuelva a suspender el pellet celular en 1,5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Centrifugar las celdas a temperatura ambiente (RT) a 200 x g. Aspire el sobrenadante PBS.
4. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de formalina al 4% y almacene los tubos a 4 °C durante 3 h.
5. Lave las células con 1X solución salina tamponada con Tris (TBS).
   NOTA: No utilice una solución a base de fosfato, ya que despolimeriza el gel.
6. Añadir 1 mL de TBS y homogeneizar durante 30 s por vórtice. Centrifugar durante 5 min a 200 x g y retirar el sobrenadante.
7. Repita los pasos 2.5 a 2.7 dos veces.
8. Realizar la inclusión del tejido en el procesador automatizado de tejidos siguiendo el programa específico:
   Formalina 1 h 37 °C
   Agua destilada 2 min RT
   EtOH 70% 40 min 45 °C
   EtOH 80% 40 min 45 °C
   EtOH 95% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   Xileno 40 min 45 °C
   Xileno 40 min 45 °C
   Xileno 40 min 45 °C
   Parafina 1 h 60 °C
   Parafina 1 h 60 °C
   Parafina 1 h 30 min 60 °C

3. Fijación de tejidos y preparación de portaobjetos

1. Fijar los tejidos en formol al 4% durante 24 h antes de la inclusión.
2. Corte secciones seriadas de 3 μm de espesor de los bloques que contienen tejidos con un micrótomo.
3. Lleve a cabo la desparafinación con el autotinción incubando secuencialmente dos veces portaobjetos en xileno (10 min), etanol al 100 % (5 min), etanol al 95 % (5 min) y agua (5 min).
4. Realice la recuperación de epítopos inducida por calor en tampón de citrato de 10 mM utilizando un baño de agua a 98 °C durante 40 min al pH adecuado (generalmente 6-9).
   NOTA: Los dos anticuerpos tienen que funcionar al mismo pH para que el método tenga éxito. Se realizaron varias pruebas antes de establecer el pH óptimo utilizado en este documento. Los anticuerpos utilizados en este estudio son el anticuerpo SDMA y el anticuerpo GR.
5. Deje que los portaobjetos se enfríen durante 20 minutos, luego lávelos en 1x PBS durante 20 minutos.

4. Experimento IHQ

NOTA: Los experimentos de IHC se realizan utilizando el instrumento de investigación Discovery XT (Tabla de Materiales) para la automatización y la reproducibilidad.

1. Para evitar el enfriamiento de la peroxidasa, use el inhibidor incluido en el kit de diaminobenzidina (DAB).
2. Incubar los portaobjetos con los dos anticuerpos primarios diluidos en el diluyente de anticuerpos durante 60 min.
3. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo secundario anti-conejo rábano picante peroxidasa (HRP) durante 16 min o el anticuerpo anti-ratón durante 30 min.
   NOTA: Se recomienda utilizar un kit comercial de diaminobenzidina (DAB) (Tabla de Materiales) para la detección de IHQ.
4. Aplique hematoxilina (100 μL/portaobjetos durante 8 min) y azulado (100 μL/portaobjetos durante 4 min) a las muestras para teñir los núcleos.
5. Lave los portaobjetos con agua tibia y jabón, luego deshidrátelos con un tinte automático y móntelos en una zapatilla de cubierta automática con un medio de montaje.

5. Reacciones del ensayo de ligadura de proximidad

NOTA: Todos los reactivos utilizados están incluidos en los kits de PLA (Tabla de Materiales). Se recomienda utilizar 40 μL de reactivo por 1^cm2 de tejido. Todas las incubaciones deben realizarse en un ambiente húmedo para evitar la evaporación excesiva. No permita que la muestra se seque, ya que esto puede provocar ruido de fondo. Se recomienda utilizar 1x tampón A (tampón de lavado in situ , Tabla de Materiales) para los lavados en los frascos. Debe haber un volumen mínimo de 70 mL en los frascos cuando se incuban muestras bajo agitación. Las muestras deben mantenerse en RT antes de su uso.

1. Enfriamiento de la peroxidasa
   1. Delimite el área de reacción con un bolígrafo hidrofóbico para evitar la evaporación excesiva de la solución durante el experimento. Añadir una gota de solución de peróxido de hidrógeno por cada^cm2 de cada muestra. Incubar durante 5 min en RT.
      NOTA: Se recomienda optimizar el tiempo de incubación en función de las muestras/anticuerpos utilizados.
2. Bloqueante
   1. Gotee suavemente el tampón A sobre las muestras y lave en el tampón A a 50 rpm bajo agitación durante 5 min a RT.
   2. Retire el tampón A restante y agregue una gota por 1^cm2 de solución de bloqueo (incluida en el kit de PLA). Incubar durante 30 min a 37 °C.
3. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Diluir los dos anticuerpos primarios a concentraciones adecuadas en el diluyente de anticuerpos.
   2. Retire la solución bloqueante de los portaobjetos y agregue inmediatamente la solución de anticuerpos primarios (incluida en el kit de PLA). Incubar durante 1 h en una cámara de humedad a 37 °C.
4. Incubación de sondas de PLA
   1. Diluya la sonda PLA PLUS (1:5) con la sonda PLA minus (1:5) en el diluyente de anticuerpos.
      NOTA: Se recomienda utilizar 8 μL de sonda de PLA menos material (5x), 8 μL de sonda de PLA más stock (5x) y 24 μL de diluyente de anticuerpos para una reacción de 40 μL.
   2. Gotee suavemente el tampón A sobre las muestras y lave en el tampón A a 50 rpm durante 5 min en RT.
   3. Extraiga el tampón A restante y aplique la solución de sonda de PLA (incluida en el kit de PLA) a las muestras. Incubar durante 1 h a 37 °C.
5. Ligadura
   1. Descongele el tampón de ligadura (incluido en el kit de PLA) antes de los siguientes pasos.
   2. Gotee suavemente el tampón A sobre las muestras y lave en el tampón A a 50 rpm durante 5 min en RT.
   3. Diluir el tampón de ligadura 5x (1:5) (incluido en el kit de PLA) en agua de alta pureza. Añada la ligasa (1:40) (incluida en el kit de PLA) inmediatamente antes de añadirla a la muestra.
      NOTA: Se recomienda añadir 8 μL del tampón de ligadura 5x a 31 μL de agua de alta pureza para una reacción de 40 μL. A continuación, añada 1 μL de ligasa.
   4. Extraiga el tampón A restante y aplique la solución de ligasa a las muestras. Incubar durante 30 min a 37 °C.
6. Amplificación
   1. Descongele el búfer de amplificación antes de los siguientes pasos.
   2. Gotee suavemente el tampón A sobre las muestras y lave en el tampón A a 50 rpm durante 2 min a RT.
   3. Diluya el tampón de amplificación 5x (1:5) (incluido en el kit de PLA) en agua de alta pureza. Añada la polimerasa (1:80) (incluida en el kit de PLA) inmediatamente antes de gotearla suavemente sobre la muestra.
      NOTA: Se recomienda añadir 8 μL del tampón de ligadura 5x a 31,5 μL de agua de alta pureza para una reacción de 40 μL. A continuación, añada 0,5 μL de ligasa.
   4. Extraiga el tampón A restante y aplique la solución de amplificación a las muestras. Incubar durante 2 h a 37 °C.
7. Detección
   1. Gotee suavemente el tampón A sobre las muestras y lave en el tampón A a 50 rpm durante 2 min a RT.
   2. Divida el tampón de campo claro de detección 5x (1:5) (incluido en el kit de PLA) en agua de alta pureza.
      NOTA: Se recomienda añadir 8 μL del tampón de detección 5x a 32 μL de agua de alta pureza para una reacción de 40 μL.
   3. Extraiga el tampón A restante y aplique la solución de detección a las muestras. Incubar durante 1 h en RT.
8. Desarrollo de sustratos
   1. Gotee suavemente el tampón A sobre las muestras y lave en el tampón A a 50 rpm durante 2 min a RT.
   2. Diluya la solución de sustrato diluyendo los reactivos de sustrato A (1:70), B (1:100), C (1:100) y D (1:50) (incluidos en el kit de PLA) en agua de alta pureza.
      NOTA: Se recomienda añadir 0,6 μL de sustrato A, 0,4 μL de sustrato B, 0,4 μL de sustrato C y 0,8 μL de sustrato D en 37,8 μL de agua de alta pureza para una reacción de 40 μL.
   3. Extraiga el tampón A restante y aplique la solución de amplificación a las muestras. Incubar durante 10 min en RT.
9. Tinción nuclear
   1. Gotee suavemente agua destilada sobre las muestras y lávese en agua destilada a 50 rpm durante 2 min en RT.
   2. Retira el agua destilada restante. Añadir una gota de tinción nuclear (incluida en el kit de PLA) a cada muestra de 1^cm2 e incubar durante 2 min a RT.
   3. Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 10 minutos para que la mancha madure y obtenga una coloración azul. No use agua del grifo estancada.
10. Deshidratación
    1. Incubar los portaobjetos en una solución que contenga etanol al 96% dos veces durante 2 min. A continuación, incube los portaobjetos en una solución que contenga etanol al 99,7% dos veces durante 2 min.
    2. Incuba los portaobjetos en xileno durante 10 min. Luego transfiera los portaobjetos a xileno fresco.
11. Montaje de las correderas
    1. Utilice un volumen mínimo de medio de montaje no acuoso y aplique un cubreobjetos encima de la muestra, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo de los cubreobjetos.
    2. Deje que los portaobjetos se sequen antes de analizarlos en un microscopio de campo claro.

6. Imágenes para la localización

1. Adquisición de imágenes con un microscopio vertical.
   NOTA: En este estudio, las imágenes de los portaobjetos se realizaron bajo un microscopio vertical de campo claro (Tabla de Materiales). Las imágenes se adquirieron en condiciones idénticas con un aumento de 40x para al menos 10 campos de visión elegidos al azar de forma automatizada. Se recomienda analizar un mínimo de 500 células por condición.

7. Análisis para la cuantificación

NOTA: La cuantificación de las muestras se realizó con el software ImageJ⁸. Para los análisis posteriores se utilizó FIJI, una distribución de ImageJ que incluía ImageJ y otros plugins preinstalados ^9,10.

1. Para determinar el número de puntos:
   1. Abre la imagen.
   2. Realizar la deconvolución de color. Para ello, haga clic en Imagen > Colores > Deconvolución de color.
   3. Seleccione la imagen: - (color_1) en el nombre del archivo.
   4. Utilice el comando Buscar máximos para determinar el número de puntos (Procesar > Buscar máximos).
2. Para determinar el número de celdas:
   1. Abre la imagen.
   2. Realizar la deconvolución de color. Para ello, haga clic en Imagen > Colores > Deconvolución de color.
   3. Seleccione la imagen: - (color_1) en el nombre del archivo.
   4. Encuentre un umbral que muestre el número máximo de núcleos. Para ello, haga clic en Imagen > Brillo/Contraste > Umbral.
   5. Rellene los agujeros haciendo clic en Procesar > Binario > Llenar agujeros.
   6. Utilice el comando watershed para dividir los componentes conectados en otros separados. Haga clic en Procesar > binario > cuenca hidrográfica.
   7. Analizar partículas para determinar el número de núcleos haciendo clic en Analizar > Analizar partículas.

Resultados

Utilizando el procedimiento descrito anteriormente, es posible detectar y cuantificar la metilación de una proteína de interés. Aquí, mostramos el ejemplo de la metilación de GR por PRMT5. Los anticuerpos y las condiciones experimentales para el PLA se aplicaron previamente a las células¹⁰. En resumen, los anticuerpos primarios dirigidos a GR y SDMA se reconocen mediante sondas de proximidad conjugadas con oligonucleótidos complementarios. Luego, la hibrida...

Discusión

La metilación de la arginina, al igual que otros PTM, contribuye a la regulación fina de las funciones de las proteínas. Sin embargo, su impacto está subestimado debido a la dificultad de evaluar estas modificaciones, principalmente por la falta de herramientas. Esto es particularmente cierto cuando se estudia la metilación in vivo, donde la única forma de medir la metilación de arginina es poseer anticuerpos específicos que reconozcan el residuo metilado de la proteína...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope