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Method Article
* Estos autores han contribuido por igual
El ensayo de ligadura de proximidad es una técnica muy útil para localizar y cuantificar la metilación de arginina de una proteína determinada cuando se desconoce el residuo de arginina modificado y/o si no se dispone de un anticuerpo específico.
La metilación de arginina está emergiendo como una modificación postraduccional clave involucrada en una amplia gama de procesos biológicos. Su estudio en tejidos a menudo está limitado por la falta de un anticuerpo específico que reconozca el residuo de arginina objetivo. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) se desarrolló originalmente para estudiar las interacciones proteína/proteína. En este trabajo describimos en detalle un protocolo de PLA dedicado a la detección de la metilación de arginina que aplicamos al receptor de glucocorticoides (GR). Habiendo demostrado previamente que PRMT5 dimetila GRs en las células, utilizamos PLA con un anticuerpo dimetil pansimétrico y un anticuerpo anti-GR para medir la metilación de GR en tumores de mama. Demostramos que el PLA ofrece un enfoque único para medir la metilación de arginina de una proteína diana, incluso cuando no se ha identificado el sitio de metilación. Esta técnica podría extenderse a otras modificaciones postraduccionales en las que se dispone de anticuerpos panes eficaces. De ahí que detallemos la tecnología PLA utilizada para detectar la metilación de arginina en tejido fijo utilizando como ejemplo la GR.
La metilación de arginina por la proteína arginina metiltransferasas (PRMTs) es una abundante modificación postraduccional (PTM) involucrada en numerosos procesos biológicos. Las PRMT catalizan la transferencia de grupos metilo de la S-adenosil metionina a los residuos de arginina. La familia PRMT está compuesta por nueve miembros clasificados según el tipo de metilación que realizan. Todos los miembros realizan la monometilación (MMA). Las PRMT de tipo 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 y 8) catalizan la dimetilación asimétrica (ADMA), mientras que las de tipo 2 (PRMT5 y 9) catalizan la dimetilación simétrica (SDMA) y las de tipo 3 (PRMT7) solo generan MMA1. Al metilar numerosos sustratos, los diferentes PRMT regulan una amplia variedad de procesos celulares importantes, como la reparación del ADN, la regulación transcripcional, la respuesta inmunitaria, el procesamiento del ARN y la transducción de señales 2,3. Esto es particularmente cierto para la señalización de hormonas esteroideas, donde los PRMT modifican la actividad de los receptores de esteroides metilando no solo los receptores en sí, sino también sus reguladores o histonas2.
La metilación de la arginina se ha estudiado ampliamente en el cáncer, ya que se ha demostrado que la mayoría de los PRMT están sobreexpresados en el cáncer en comparación con los tejidos normales, y su expresión se asocia a menudo con un mal pronóstico 4,5. La detección de la metilación de arginina in vivo es esencial para comprender las funciones celulares asociadas con esta modificación. Esto se logra convencionalmente mediante la realización de inmunohistoquímica (IHQ) con un anticuerpo específico que reconoce el residuo de arginina metilado. Sin embargo, este método es muy limitado, ya que se basa en la identificación del residuo de arginina modificada y se basa en la eficacia del anticuerpo utilizado. El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) in situ se desarrolló inicialmente para estudiar las interacciones proteína/proteína en células o tejidos fijos6. Curiosamente, esta tecnología también se puede utilizar para detectar PTM utilizando un anticuerpo panforme contra la modificación del interés, así como un anticuerpo que reconoce la proteína objetivo. Nuestro equipo adaptó previamente esta técnica para estudiar la metilación del receptor de estrógeno alfa (ERα), utilizando un anticuerpo anti-ERα y un anticuerpo que reconoce específicamente el sitio de metilación de la arginina 2607. Cabe destacar que esta técnica puede extenderse a los anticuerpos que reconocen un tipo especial de metilación, incluso cuando se desconoce el residuo metilado. De hecho, varias empresas suministran anticuerpos pan que reconocen específicamente MMA, ADMA o SDMA que pueden utilizarse con éxito para estudiar la metilación de proteínas in vivo.
Aquí, como prueba de concepto, presentamos un análisis detallado de la metilación de GR utilizando el anticuerpo SDMA en tumores de mama humanos desde el diseño experimental hasta el análisis de datos.
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente. El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética institucional del Centro de Investigación del Cáncer de Lyon.
1. Elección de los anticuerpos
2. Preparación de pellets de línea celular incluidos en parafina
NOTA: Las muestras se incrustan en un gel y luego se colocan en un procesador de tejidos automatizado para la deshidratación de la muestra y la inclusión en parafina.
3. Fijación de tejidos y preparación de portaobjetos
4. Experimento IHQ
NOTA: Los experimentos de IHC se realizan utilizando el instrumento de investigación Discovery XT (Tabla de Materiales) para la automatización y la reproducibilidad.
5. Reacciones del ensayo de ligadura de proximidad
NOTA: Todos los reactivos utilizados están incluidos en los kits de PLA (Tabla de Materiales). Se recomienda utilizar 40 μL de reactivo por 1cm2 de tejido. Todas las incubaciones deben realizarse en un ambiente húmedo para evitar la evaporación excesiva. No permita que la muestra se seque, ya que esto puede provocar ruido de fondo. Se recomienda utilizar 1x tampón A (tampón de lavado in situ , Tabla de Materiales) para los lavados en los frascos. Debe haber un volumen mínimo de 70 mL en los frascos cuando se incuban muestras bajo agitación. Las muestras deben mantenerse en RT antes de su uso.
6. Imágenes para la localización
7. Análisis para la cuantificación
NOTA: La cuantificación de las muestras se realizó con el software ImageJ8. Para los análisis posteriores se utilizó FIJI, una distribución de ImageJ que incluía ImageJ y otros plugins preinstalados 9,10.
Utilizando el procedimiento descrito anteriormente, es posible detectar y cuantificar la metilación de una proteína de interés. Aquí, mostramos el ejemplo de la metilación de GR por PRMT5. Los anticuerpos y las condiciones experimentales para el PLA se aplicaron previamente a las células10. En resumen, los anticuerpos primarios dirigidos a GR y SDMA se reconocen mediante sondas de proximidad conjugadas con oligonucleótidos complementarios. Luego, la hibrida...
La metilación de la arginina, al igual que otros PTM, contribuye a la regulación fina de las funciones de las proteínas. Sin embargo, su impacto está subestimado debido a la dificultad de evaluar estas modificaciones, principalmente por la falta de herramientas. Esto es particularmente cierto cuando se estudia la metilación in vivo, donde la única forma de medir la metilación de arginina es poseer anticuerpos específicos que reconozcan el residuo metilado de la proteína...
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses
Nos gustaría agradecer a B. Manship por la revisión del manuscrito. Agradecemos a Laura Francols, Clémentine Le Nevé, Plataforma de Investigación en Patología (CRCL) por su ayuda técnica. La Figura 1 fue creada utilizando Servier Medical Art. Este estudio ha contado con el apoyo de la Liga Inter-régionale contra el Cáncer y de la Asociación «Le Cancer du sein, parlons-en».
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesion slides TOMO 90°, x100 | VWR | 631-1239 | |
anti-GR antibody (mouse) | Santa Cruz | sc393232 | |
anti-GR antibody (mouse) | santa cruz | sc393232 | |
anti-PRMT5 antibody (rabbit) | Merck | 07-405 | |
anti-SDMA antibody (rabbit) | CST | 13222 | |
Automate d'inclusion | Leica | ASP 6025 | Paraffin infiltration and block preparation |
Autostainer XL | Leica | ST5010 | Autostainer |
Cassettes Q path macrostar III x1500 | VWR | 720-2233 | |
CC1 | Roche | 5279801001 | |
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL | MMF | F/T0050 | |
Dako antibody diluent | Dako Agilent | S202230-2 | antibody diluent |
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit | Roche | 760-159 | Diaminobenzidine (DAB) kit |
Discovery Wash | Roche | 7311079001 | |
Duolink insitu PLA probe anti-mouse minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | PLA kit (probe anti-rabbit minus) |
Duolink insitu detection reagents brightfield | Sigma-Aldrich | DUO92012 | PLA kit (in situ detection reagents) |
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus | Sigma-Aldrich | DUO92002 | PLA kit (probe anti-rabbit plus) |
Duolink insitu wash buffer brightfield | Sigma-Aldrich | DUO82047 | PLA kit (in situ wash buffer) |
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L | VWR | 83804.360 | |
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 20821.365 | |
EZ Prep 10x | Roche | 5279771001 | |
Formol, ready to use, 5 L | MMF | F/40877-36 | Formalin |
Fully automated glass coverslipper | Leica | CV5030 | automated coverslipper |
Glass coverslips 24 x 40 | Dutscher | 100037 | |
Hematoxylin | Ventana | 760-2021 | |
IHC instrument | Roche | DISCOVERY XT | Automation of IHC |
LCS | Roche | 5264839001 | |
Microtome | Thermo Scientific | Microm HM340E | Cutting of the tissues including in blocks |
Mounting Medium Pertex | Histolab | 00801-FR | |
PAP Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg | Sakura | 4511 | |
Pasteur Disposable Pipettes | Fisher Scientific | 12583237 | |
PBS Buffer 10x, 100 mL | MMF | F/T0020 | |
Reaction Buffer 10x | Roche | 5353955001 | |
Ribo Wash 10x | Roche | 5266262001 | |
RiboCC1 | Roche | 5266297001 | |
Secondary antibody anti-mouse | Abcam | ab133469 | |
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP | Roche | 760-4311 | |
Tissue Embedding center | MMF | EC 350 | |
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 28975.360 | |
Zeiss Axio Imager M2 microscope | upright bright-field microscope |
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