בדיקת קשירת קרבה מאפשרת זיהוי, לוקליזציה וכימות של מתילציה של חלבון ארגינין ברקמה קבועה

Summary

בדיקת קשירת קרבה היא טכניקה שימושית מאוד לאיתור וכימות מתילציה של ארגינין של חלבון נתון כאשר שאריות הארגינין שהשתנו אינן ידועות ו/או אם אין נוגדן ספציפי זמין.

Abstract

מתילציה של ארגינין מסתמנת כשינוי מפתח לאחר התרגום המעורב במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. המחקר שלו ברקמה מוגבל לרוב על ידי היעדר נוגדן ספציפי המזהה את שאריות ארגינין המטרה. בדיקת קשירת קרבה (PLA) פותחה במקור כדי לחקור אינטראקציות חלבון/חלבון. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול PLA המוקדש לזיהוי מתילציה של ארגינין שהחלנו על קולטן הגלוקוקורטיקואיד (GR). לאחר שהראינו בעבר כי PRMT5 dimethylates GRs בתאים, השתמשנו ב-PLA עם נוגדן דימתיל פאן-סימטרי ונוגדנים אנטי-GR כדי למדוד מתילציה של GR בגידולי שד. אנו מדגימים כי PLA מציע גישה ייחודית למדידת מתילציה של ארגינין של חלבון מטרה, גם כאשר אתר המתילציה לא זוהה. ניתן להרחיב טכניקה זו לשינויים אחרים לאחר התרגום שבהם קיימים נוגדנים יעילים למחצה. לפיכך, אנו מפרטים את טכנולוגיית ה-PLA המשמשת לזיהוי מתילציה של ארגינין ברקמה קבועה באמצעות GR כדוגמה.

Introduction

מתילציה של ארגינין על ידי חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) היא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) בשפע המעורב בתהליכים ביולוגיים רבים. PRMTs מזרזים את ההעברה של קבוצות מתיל מ-S-adenosyl methionine לשאריות ארגינין. משפחת PRMT כוללת תשעה חברים המסווגים לפי סוג המתילציה שהם מבצעים. כל החברים מבצעים מונומתילציה (MMA). PRMTs מסוג 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ו-8) מזרזים דימתילציה אסימטרית (ADMA), בעוד שסוג 2 (PRMT5 ו-9) מזרז דימתילציה סימטרית (SDMA), וסוג 3 (PRMT7) מייצר רק MMA¹. על ידי מתילציה של מצעים רבים, ה-PRMTs השונים מווסתים מגוון רחב של תהליכים תאיים חשובים כגון תיקון DNA, ויסות שעתוק, תגובה חיסונית, עיבוד RNA והעברת אותות ^2,3. זה נכון במיוחד עבור איתות הורמון סטרואידים, שבו PRMTs משנים את פעילותם של קולטני סטרואידים על ידי מתילציה לא רק של הקולטנים עצמם אלא גם של הרגולטורים או ההיסטונים שלהם².

מתילציה של ארגינין נחקרת בעיקר בסרטן, שכן רוב ה-PRMTs הוכחו כבעלי ביטוי יתר בסרטן בהשוואה לרקמות רגילות, וביטוים קשור לעתים קרובות לפרוגנוזה גרועה ^4,5. זיהוי מתילציה של ארגינין in vivo חיוני להבנת תפקודים תאיים הקשורים לשינוי זה. זה מושג באופן קונבנציונלי על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה (IHC) עם נוגדן ספציפי המזהה את שאריות הארגינין המתיליות. עם זאת, שיטה זו מוגבלת מאוד מכיוון שהיא מבוססת על זיהוי שאריות הארגינין ששונו ומסתמכת על יעילות הנוגדן בו נעשה שימוש. בדיקת קשירת קרבה באתרה (PLA) פותחה בתחילה כדי לחקור אינטראקציות חלבון/חלבון בתאים או רקמות קבועות⁶. מעניין לציין כי טכנולוגיה זו יכולה לשמש גם לאיתור PTMs באמצעות נוגדן פאן כנגד שינוי העניין, כמו גם נוגדן המזהה את החלבון הממוקד. הצוות שלנו התאים בעבר טכניקה זו לחקר מתילציה של קולטן אסטרוגן אלפא (ERα), תוך שימוש בנוגדנים נגד ERα ונוגדנים המזהה באופן ספציפי את אתר המתילציה על ארגינין 260⁷. יש לציין כי ניתן להרחיב טכניקה זו לנוגדנים המזהים סוג מיוחד של מתילציה גם כאשר שאריות המתיל אינן ידועות. ואכן, מספר חברות מספקות נוגדנים פאן המזהים במיוחד MMA, ADMA או SDMA שניתן להשתמש בהם בהצלחה לחקר מתילציה של חלבון in vivo.

כאן, כהוכחת רעיון, אנו מציגים ניתוח מפורט של מתילציה של GR באמצעות נוגדן SDMA בגידולי שד אנושיים מתכנון ניסיוני ועד ניתוח נתונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של המרכז לחקר הסרטן בליון.

1. בחירת הנוגדנים

1. השתמש בנוגדנים ראשוניים שאומתו על ידי IHC או אימונופלואורסצנציה (IF).
   הערה: הנוגדנים העיקריים שנבחרו למחקר חיוניים להצלחת PLA ובמיוחד ברקמות קבועות. שימוש בנוגדנים שאומתו על ידי IHC או IF יגדיל את אחוזי ההצלחה של הניסוי. אופטימיזציה וספציפיות של נוגדנים נדרשים לפני ביצוע ניסויים, באופן אידיאלי על ידי ביצוע ניסויי בקרה בתאים שנפסלו לביטוי החלבון המעניין ושימוש במעכב ספציפי לפעילות האנזימטית של המתיל טרנספראז המעורב. כאן התנאים עברו אופטימיזציה בעבר¹⁰.

2. הכנת גלולות קו תאים משובצות פרפין

הערה: הדגימות מוטמעות בג'ל ולאחר מכן מונחות במעבד רקמות אוטומטי לייבוש דגימה והטמעת פרפין.

1. הכן את כדור התא בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות דיסוציאציה של טריפסין.
   הערה: אין לגרד כדי לקצור תאים.
2. השעו מחדש את גלולת התא ב-1.5 מ"ל של מי מלח חוצצים פוספט (PBS).
3. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר (RT) ב-200 x גרם. שאפו את ה-PBS supernatant.
4. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של פורמלין 4% ואחסנו את הצינורות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
5. שטפו את התאים במי מלח 1X Tris-buffered-מלח (TBS).
   הערה: אל תשתמש בתמיסה מבוססת פוספט מכיוון שהיא מפרקת את הג'ל.
6. הוסף 1 מ"ל TBS והומוגניזציה למשך 30 שניות על ידי מערבולת. צנטריפוגה למשך 5 דקות בחום של 200 x גרם והסר את הסופרנטנט.
7. חזור על שלבים 2.5 עד 2.7 פעמיים.
8. בצע הכללת הרקמה במעבד הרקמות האוטומטי בהתאם לתוכנית הספציפית:
   פורמלין 1 שעות 37 מעלות צלזיוס
   מים מזוקקים 2 דקות RT
   EtOH 70% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   EtOH 80% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   EtOH 95% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   EtOH 100% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   EtOH 100% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   EtOH 100% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   קסילן 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   קסילן 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   קסילן 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
   פרפין 1 שעות 60 מעלות צלזיוס
   פרפין 1 שעות 60 מעלות צלזיוס
   פרפין 1 שעה 30 דקות 60 מעלות צלזיוס

3. קיבוע רקמות והכנת שקופיות

1. יש לתקן את הרקמות בפורמלין 4% למשך 24 שעות לפני ההכללה.
2. חותכים חלקים סדרתיים בעובי 3 מיקרומטר של הבלוקים המכילים רקמות בעזרת מיקרוטום.
3. בצע דה-פרפיניזציה עם הצביעה האוטומטית על ידי דגירה רציפה של שקופיות בקסילן (10 דקות) פעמיים, 100% אתנול (5 דקות), 95% אתנול (5 דקות) ומים (5 דקות).
4. בצע אחזור אפיטופ המושרה על ידי חום במאגר ציטראט של 10 מ"מ באמצעות אמבט מים ב-98 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות ב-pH המתאים (בדרך כלל 6-9).
   הערה: שני הנוגדנים צריכים לעבוד באותו pH כדי שהשיטה תצליח. בוצעו מספר בדיקות לפני קביעת ה-pH האופטימלי המשמש כאן. הנוגדנים ששימשו במחקר זה הם נוגדן SDMA ונוגדני GR.
5. הניחו לשקופיות להתקרר במשך 20 דקות, ואז שטפו אותן ב-1x PBS למשך 20 דקות.

4. ניסוי IHC

הערה: ניסויי IHC מבוצעים באמצעות מכשיר המחקר Discovery XT (טבלת חומרים) לאוטומציה ושחזור.

1. כדי להימנע מכיבוי פרוקסידאז, השתמש במעכב הכלול בערכת דיאמינובנזידין (DAB).
2. דגרו את השקופיות עם שני הנוגדנים העיקריים המדוללים בדילול הנוגדנים למשך 60 דקות.
3. דגרו את השקופיות עם נוגדן פרוקסידאז צנון סוסים משני (HRP) למשך 16 דקות או נוגדן נגד עכבר למשך 30 דקות.
   הערה: מומלץ להשתמש בערכת דיאמינובנזידין מסחרית (DAB) (טבלת חומרים) לזיהוי IHC.
4. מרחו המטוקסילין (100 מיקרוליטר / שקופית למשך 8 דקות) וכחול (100 מיקרוליטר / שקופית למשך 4 דקות) על הדגימות כדי להכתים את הגרעינים.
5. שטפו את המגלשות במי סבון חמים, ולאחר מכן יבשו באמצעות מכתש אוטומטי והרכיבו על נעלי בית אוטומטיות באמצעות אמצעי הרכבה.

5. תגובות בדיקת קשירת קרבה

הערה: כל הריאגנטים המשמשים כלולים בערכות PLA (טבלת חומרים). מומלץ להשתמש ב -40 מיקרוליטר מגיב עבור 1 ס"מ² של רקמה. כל הדגירה צריכה להתבצע בסביבה לחה כדי למנוע אידוי יתר. אל תאפשר לדגימה להתייבש, מכיוון שהדבר עלול להוביל לרעשי רקע. מומלץ להשתמש במאגר 1x A (מאגר כביסה באתר , טבלת חומרים) לשטיפות בצנצנות. צריך להיות נפח מינימלי של 70 מ"ל בצנצנות בעת דגירה של דגימות בתסיסה. יש לשמור דגימות ב-RT לפני השימוש.

1. מרווה פרוקסידאז
   1. תוחמים את אזור התגובה באמצעות עט הידרופובי כדי למנוע אידוי יתר של התמיסה במהלך הניסוי. הוסף טיפה אחת של תמיסת מי חמצן לכל 1 ס"מ² מכל דגימה. דגירה למשך 5 דקות ב-RT.
      הערה: מומלץ לייעל את זמן הדגירה בהתאם לדגימות/נוגדנים המשמשים.
2. חסימת
   1. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד תחת תסיסה למשך 5 דקות ב-RT.
   2. הקש על המאגר הנותר A והוסף טיפה אחת לכל 1 ס"מ² של תמיסת חסימה (כלולה בערכת PLA). יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
3. דגירה ראשונית של נוגדנים
   1. לדלל את שני הנוגדנים העיקריים בריכוזים מתאימים בדילול הנוגדנים.
   2. הסר את תמיסת החסימה מהשקופיות והוסף מיד את תמיסת הנוגדנים העיקרית (כלולה בערכת PLA). דגירה למשך שעה בתא לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. דגירה של בדיקת PLA
   1. לדלל את בדיקת ה-PLA PLUS (1:5) עם בדיקת PLA מינוס (1:5) בדילול הנוגדנים.
      הערה: מומלץ להשתמש ב-8 מיקרוליטר של בדיקת PLA מינוס מלאי (5x), 8 מיקרוליטר של בדיקת PLA בתוספת מלאי (5x) ו-24 מיקרוליטר של מדלל נוגדנים לתגובה של 40 מיקרוליטר.
   2. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT.
   3. הקש על המאגר הנותר A והחל את פתרון בדיקת ה-PLA (הכלול בערכת ה-PLA) על הדגימות. יש לדגור למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. קשירה
   1. הפשירו את מאגר הקשירה (כלול בערכת PLA) לפני השלבים הבאים.
   2. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT.
   3. לדלל את מאגר הקשירה פי 5 (1:5) (כלול בערכת PLA) במים בעלי טוהר גבוה. הוסף את הליגאז (1:40) (כלול בערכת PLA) מיד לפני הוספתו לדגימה.
      הערה: מומלץ להוסיף 8 מיקרוליטר של מאגר הקשירה פי 5 ל-31 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר. לאחר מכן מוסיפים 1 מיקרוליטר ליגאז.
   4. הקש על המאגר הנותר A והחל את תמיסת הליגאז על הדגימות. יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
6. הגברה
   1. הפשירו את מאגר ההגברה לפני השלבים הבאים.
   2. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
   3. לדלל את מאגר ההגברה פי 5 (1:5) (כלול בערכת PLA) במים בטוהר גבוה. הוסף את הפולימראז (1:80) (כלול בערכת PLA) מיד לפני שטפטף אותו בעדינות על הדגימה.
      הערה: מומלץ להוסיף 8 מיקרוליטר ממאגר הקשירה פי 5 ל-31.5 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר ליגאז.
   4. הקש על המאגר הנותר A והחל את תמיסת ההגברה על הדגימות. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
7. זיהוי
   1. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
   2. לדלל את חוצץ השדה הבהיר לגילוי פי 5 (1:5) (כלול בערכת PLA) במים בטוהר גבוה.
      הערה: מומלץ להוסיף 8 מיקרוליטר ממאגר הזיהוי פי 5 ל-32 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר.
   3. הקש על המאגר הנותר A והחל את פתרון הזיהוי על הדגימות. דגירה למשך שעה ב-RT.
8. פיתוח מצע
   1. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
   2. לדלל את תמיסת המצע על ידי דילול ריאגנטים של המצע A (1:70), B (1:100), C (1:100) ו-D (1:50) (כלול בערכת PLA) במים בטוהר גבוה.
      הערה: מומלץ להוסיף 0.6 מיקרוליטר של מצע A, 0.4 מיקרוליטר של מצע B, 0.4 מיקרוליטר של מצע C ו-0.8 מיקרוליטר של מצע D ב-37.8 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר.
   3. הקש על המאגר הנותר A והחל את תמיסת ההגברה על הדגימות. דגירה למשך 10 דקות ב-RT.
9. צביעה גרעינית
   1. טפטפו בעדינות מים מזוקקים על הדגימות ושטפו במים מזוקקים ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
   2. הקש על שארית המים המזוקקים. הוסף טיפה אחת של כתם גרעיני (כלול בערכת PLA) לכל דגימה בגודל 1 ס"מ² ודגירה למשך 2 דקות ב-RT.
   3. שטפו את השקופיות מתחת למי ברז זורמים למשך 10 דקות כדי לתת לכתם להתבגר ולקבל צבע כחול. אין להשתמש במי ברז עומדים.
10. התייבשות
    1. דגרו את השקופיות בתמיסה המכילה 96% אתנול פעמיים למשך 2 דקות. לאחר מכן דגרו את השקופיות בתמיסה המכילה 99.7% אתנול פעמיים למשך 2 דקות.
    2. דגרו את השקופיות בקסילן למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את השקופיות לקסילן טרי.
11. הרכבת המגלשות
    1. השתמש בנפח מינימלי של אמצעי הרכבה לא מימי והחל כיסוי על גבי הדגימה, כדי להבטיח שלא ייתפסו בועות אוויר מתחת לכיסויים.
    2. הניחו לשקופיות להתייבש לפני הניתוח במיקרוסקופ בעל שדה בהיר.

6. הדמיה ללוקליזציה

1. רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף.
   הערה: במחקר זה, הדמיה של שקופיות בוצעה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף (טבלת חומרים). התמונות נרכשו בתנאים זהים בהגדלה של פי 40 עבור לפחות 10 שדות ראייה שנבחרו באופן אקראי באופן אוטומטי. מומלץ לנתח מינימום של 500 תאים לכל מצב.

7. אנליזה לכימות

הערה: כימות הדגימות בוצע באמצעות תוכנת ImageJ⁸. FIJI, הפצת ImageJ הכוללת את ImageJ ותוספים אחרים שהותקנו מראש, שימשה לניתוחים הבאים ^9,10.

1. כדי לקבוע את מספר הנקודות:
   1. פתח את התמונה.
   2. בצע דה-קונבולוציה של צבע. לשם כך, לחץ על תמונה > צבעים > דה-קונבולוציה של צבע.
   3. בחר תמונה: - (color_1) בשם הקובץ.
   4. השתמש בפקודה Find Maxima כדי לקבוע את מספר הנקודות (Process > Find Maxima).
2. כדי לקבוע את מספר התאים:
   1. פתח את התמונה.
   2. בצע דה-קונבולוציה של צבע. לשם כך, לחץ על תמונה > צבעים > דה-קונבולוציה של צבע.
   3. בחר תמונה: - (color_1) בשם הקובץ.
   4. מצא סף המציג את המספר המרבי של גרעינים. לשם כך, לחץ על תמונה > בהירות/ניגודיות > סף.
   5. מלא את החורים על ידי לחיצה על תהליך > בינארי > מילוי חורים.
   6. השתמש בפקודת פרשת המים כדי לחלק רכיבים מחוברים לרכיבים נפרדים. לחץ על תהליך > בינארי > פרשת מים.
   7. נתח חלקיקים כדי לקבוע את מספר הגרעינים על ידי לחיצה על נתח > נתח חלקיקים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות ההליך המתואר לעיל, ניתן לזהות ולכמת את המתילציה של חלבון מעניין. כאן, אנו מראים את הדוגמה של מתילציה של GR על ידי PRMT5. הנוגדנים ותנאי הניסוי ל-PLA יושמו בעבר על תאים¹⁰. בקצרה, נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-GR ו-SDMA מזוהים על ידי בדיקות קרבה מצומדות עם אוליגונוק...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מתילציה של ארגינין, כמו PTMs אחרים, תורמת לוויסות עדין של תפקודי החלבון. עם זאת, השפעתו אינה מוערכת בשל הקושי להעריך שינויים אלה, בעיקר בגלל מחסור בכלים. זה נכון במיוחד כאשר חוקרים מתילציה in vivo, כאשר הדרך היחידה למדוד מתילציה של ארגינין היא להחזיק נוגדנים ספציפיים המזה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope