Le test de ligature de proximité permet la détection, la localisation et la quantification de la méthylation de la protéine arginine dans les tissus fixés

Résumé

Le test de ligature de proximité est une technique très utile pour localiser et quantifier la méthylation de l’arginine d’une protéine donnée lorsque le résidu d’arginine modifié est inconnu et/ou si aucun anticorps spécifique n’est disponible.

Résumé

La méthylation de l’arginine est en train de devenir une modification post-traductionnelle clé impliquée dans un large éventail de processus biologiques. Son étude dans les tissus est souvent limitée par l’absence d’anticorps spécifique reconnaissant le résidu d’arginine cible. Le test de ligature de proximité (PLA) a été développé à l’origine pour étudier les interactions protéine-protéine. Ici, nous décrivons en détail un protocole PLA dédié à la détection de la méthylation de l’arginine que nous avons appliqué au récepteur des glucocorticoïdes (GR). Ayant précédemment montré que PRMT5 diméthyle les GR dans les cellules, nous avons utilisé le PLA avec un anticorps diméthyle à symétrie pan-symétrique et un anticorps anti-GR pour mesurer la méthylation des GR dans les tumeurs mammaires. Nous démontrons que le PLA offre une approche unique pour mesurer la méthylation de l’arginine d’une protéine cible, même lorsque le site de méthylation n’a pas été identifié. Cette technique pourrait être étendue à d’autres modifications post-traductionnelles où des anticorps pan-efficaces sont disponibles. Par conséquent, nous détaillons la technologie PLA utilisée pour détecter la méthylation de l’arginine dans les tissus fixés en utilisant la RG comme exemple.

Introduction

La méthylation de l’arginine par les protéines arginine méthyltransférases (PRMT) est une modification post-traductionnelle abondante (PTM) impliquée dans de nombreux processus biologiques. Les PRMT catalysent le transfert des groupes méthyles de la S-adénosylméthionine aux résidus d’arginine. La famille des PRMT comprend neuf membres classés selon le type de méthylation qu’ils effectuent. Tous les membres effectuent la monométhylation (MMA). Les PRMT de type 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 et 8) catalysent la diméthylation asymétrique (ADMA), tandis que les PRMT5 et 9 de type 2 catalysent la diméthylation symétrique (SDMA) et les PRMT de type 3 (PRMT7) ne génèrent que de la MMA¹. En méthylant de nombreux substrats, les différents PRMT régulent une grande variété de processus cellulaires importants tels que la réparation de l’ADN, la régulation transcriptionnelle, la réponse immunitaire, le traitement de l’ARN et la transduction du signal ^2,3. Cela est particulièrement vrai pour la signalisation des hormones stéroïdiennes, où les PRMT modifient l’activité des récepteurs stéroïdiens en méthylant non seulement les récepteurs eux-mêmes, mais aussi leurs régulateurs ou histones².

La méthylation de l’arginine est largement étudiée dans le cancer, car la majorité des PRMT se sont révélées surexprimées dans le cancer par rapport aux tissus normaux, et leur expression est souvent associée à un mauvais pronostic ^4,5. La détection de la méthylation de l’arginine in vivo est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires associées à cette modification. Ceci est conventionnellement réalisé en effectuant une immunohistochimie (IHC) avec un anticorps spécifique reconnaissant le résidu d’arginine méthylé. Cependant, cette méthode est très limitée car elle est basée sur l’identification du résidu d’arginine modifié et repose sur l’efficacité de l’anticorps utilisé. Le test de ligature de proximité in situ (PLA) a été initialement développé pour étudier les interactions protéine/protéine dans les cellules ou les tissus fixes⁶. Il est intéressant de noter que cette technologie peut également être utilisée pour détecter les PTM à l’aide d’un anticorps pan contre la modification d’intérêt, ainsi que d’un anticorps reconnaissant la protéine ciblée. Notre équipe a précédemment adapté cette technique pour étudier la méthylation du récepteur alpha des œstrogènes (ERα), en utilisant un anticorps anti-ERα et un anticorps reconnaissant spécifiquement le site de méthylation sur l’arginine 260⁷. Il convient de noter que cette technique peut être étendue aux anticorps reconnaissant un type particulier de méthylation, même lorsque le résidu méthylé est inconnu. En effet, plusieurs entreprises fournissent des anticorps pan-anticorps reconnaissant spécifiquement la MMA, l’ADMA ou la SDMA qui peuvent être utilisés avec succès pour étudier la méthylation des protéines in vivo.

Ici, en tant que preuve de concept, nous présentons une analyse détaillée de la méthylation de la GR à l’aide d’anticorps SDMA dans les tumeurs du sein humain, de la conception expérimentale à l’analyse des données.

Protocole

Un consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patient. Le protocole d’étude a été approuvé par le comité d’éthique institutionnel du Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.

1. Choix des anticorps

1. Utiliser des anticorps primaires validés par IHC ou immunofluorescence (IF).
   REMARQUE : Les anticorps primaires sélectionnés pour l’étude sont cruciaux pour le succès du PLA et plus particulièrement dans les tissus fixés. L’utilisation d’un anticorps validé par l’IHC ou l’IF augmentera le taux de réussite de l’expérience. L’optimisation et la spécificité des anticorps sont nécessaires avant de réaliser des expériences, idéalement en réalisant des expériences de contrôle dans des cellules invalidées pour l’expression de la protéine d’intérêt et en utilisant un inhibiteur spécifique de l’activité enzymatique de la méthyltransférase impliquée. Ici, les conditions ont été préalablement optimisées¹⁰.

2. Préparation de pastilles de lignées cellulaires enrobées de paraffine

REMARQUE : Les échantillons sont incorporés dans un gel, puis placés dans un processeur de tissus automatisé pour la déshydratation des échantillons et l’incorporation de paraffine.

1. Préparez la pastille cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL en utilisant la dissociation de la trypsine.
   REMARQUE : Ne grattez pas pour récolter les cellules.
2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Centrifuger les cellules à température ambiante (RT) à 200 x g. Aspirez le surnageant PBS.
4. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de formol à 4 % et conserver les tubes à 4 °C pendant 3 h.
5. Lavez les cellules dans une solution saline 1X tamponnée au tris (TBS).
   REMARQUE : N’utilisez pas de solution à base de phosphate car elle dépolymérise le gel.
6. Ajouter 1 mL de TBS et homogénéiser pendant 30 s par vortex. Centrifuger pendant 5 min à 200 x g et retirer le surnageant.
7. Répétez deux fois les étapes 2.5 à 2.7.
8. Effectuez l’inclusion du tissu dans le processeur de tissu automatisé en suivant le programme spécifique :
   Formol 1 h 37 °C
   Eau distillée 2 min RT
   EtOH 70 % 40 min 45 °C
   EtOH 80 % 40 min 45 °C
   EtOH 95 % 40 min 45 °C
   EtOH 100 % 40 min 45 °C
   EtOH 100 % 40 min 45 °C
   EtOH 100 % 40 min 45 °C
   Xylène 40 min 45 °C
   Xylène 40 min 45 °C
   Xylène 40 min 45 °C
   Paraffine 1 h 60 °C
   Paraffine 1 h 60 °C
   Paraffine 1 h 30 min 60 °C

3. Fixation des tissus et préparation des lames

1. Fixez les tissus dans du formol à 4 % pendant 24 h avant l’inclusion.
2. Découper des coupes en série de 3 m d’épaisseur des blocs contenant des tissus à l’aide d’un microtome.
3. Effectuez la déparaffinisation avec l’autocolorant en incubant séquentiellement les lames dans du xylène (10 min) deux fois, de l’éthanol à 100 % (5 min), de l’éthanol à 95 % (5 min) et de l’eau (5 min).
4. Effectuer la récupération d’épitopes induite par la chaleur dans un tampon de citrate de 10 mM à l’aide d’un bain-marie à 98 °C pendant 40 min au pH approprié (généralement 6-9).
   REMARQUE : Les deux anticorps doivent fonctionner au même pH pour que la méthode soit efficace. Plusieurs tests ont été effectués avant d’établir le pH optimal utilisé ici. Les anticorps utilisés dans cette étude sont l’anticorps SDMA et l’anticorps GR.
5. Laissez refroidir les lames pendant 20 min, puis lavez-les dans 1x PBS pendant 20 min.

4. Expérience IHC

REMARQUE : Les expériences IHC sont réalisées à l’aide de l’instrument de recherche Discovery XT (Table of Materials) pour l’automatisation et la reproductibilité.

1. Pour éviter l’extinction de la peroxydase, utilisez l’inhibiteur inclus dans le kit de diaminobenzidine (DAB).
2. Incuber les lames avec les deux anticorps primaires dilués dans le diluant d’anticorps pendant 60 min.
3. Incuber les lames avec l’anticorps secondaire anti-peroxydase de raifort (HRP) pendant 16 min ou l’anticorps anti-souris pendant 30 min.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un kit commercial de diaminobenzidine (DAB) (Table des matériaux) pour la détection IHC.
4. Appliquer de l’hématoxyline (100 μL/lame pendant 8 min) et du bleuissement (100 μL/lame pendant 4 min) sur les échantillons pour colorer les noyaux.
5. Lavez les lames à l’eau chaude savonneuse, puis déshydratez-les à l’aide d’un colorateur automatique et montez-les sur une pantoufle de couverture automatisée à l’aide d’un support de montage.

5. Réactions de dosage de la ligature de proximité

REMARQUE : Tous les réactifs utilisés sont inclus dans les kits PLA (Table of Materials). Il est recommandé d’utiliser 40 μL de réactif pour 1^cm2 de tissu. Toutes les incubations doivent être effectuées dans un environnement humide pour éviter une évaporation excessive. Ne laissez pas l’échantillon sécher, car cela pourrait entraîner un bruit de fond. Il est recommandé d’utiliser 1x tampon A (tampon de lavage in situ , Table des matériaux) pour les lavages dans les bocaux. Il doit y avoir un volume minimum de 70 mL dans les bocaux lors de l’incubation des échantillons sous agitation. Les échantillons doivent être conservés à RT avant utilisation.

1. Trempe à la peroxydase
   1. Délimitez la zone de réaction à l’aide d’un stylo hydrophobe pour éviter une évaporation excessive de la solution pendant l’expérience. Ajouter une goutte de solution de peroxyde d’hydrogène par 1^cm2 de chaque échantillon. Incuber pendant 5 min à RT.
      REMARQUE : Il est recommandé d’optimiser le temps d’incubation en fonction des échantillons/anticorps utilisés.
2. Bloquant
   1. Versez doucement le tampon A sur les échantillons et lavez-le à 50 tr/min sous agitation pendant 5 min à RT.
   2. Tapotez le tampon A restant et ajoutez une goutte par 1 cm² de solution de blocage (incluse dans le kit PLA). Incuber pendant 30 min à 37 °C.
3. Incubation primaire de l’anticorps
   1. Diluez les deux anticorps primaires à des concentrations appropriées dans le diluant d’anticorps.
   2. Retirez la solution bloquante des lames et ajoutez immédiatement la solution d’anticorps primaire (incluse dans le kit PLA). Incuber pendant 1 h dans une chambre humide à 37 °C.
4. Incubation de sonde PLA
   1. Diluez la sonde PLA PLUS (1:5) avec la sonde PLA moins (1:5) dans le diluant d’anticorps.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser 8 μL de sonde PLA moins le stock (5x), 8 μL de sonde PLA plus stock (5x) et 24 μL de diluant d’anticorps pour une réaction de 40 μL.
   2. Versez doucement le tampon A sur les échantillons et lavez-le à 50 tr/min pendant 5 min à RT.
   3. Tapotez le tampon A restant et appliquez la solution de sonde PLA (incluse dans le kit PLA) sur les échantillons. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
5. Ligature
   1. Décongelez le tampon de ligature (inclus dans le kit PLA) avant les étapes suivantes.
   2. Versez doucement le tampon A sur les échantillons et lavez-le à 50 tr/min pendant 5 min à RT.
   3. Diluez le tampon de ligature 5x (1:5) (inclus dans le kit PLA) dans de l’eau de haute pureté. Ajoutez la ligase (1:40) (incluse dans le kit PLA) immédiatement avant de l’ajouter à l’échantillon.
      REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter 8 μL du tampon de ligature 5x à 31 μL d’eau de haute pureté pour une réaction de 40 μL. Ajoutez ensuite 1 μL de ligase.
   4. Tapotez le tampon A restant et appliquez la solution de ligase sur les échantillons. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
6. Amplification
   1. Dégelez le tampon d’amplification avant les étapes suivantes.
   2. Versez doucement le tampon A sur les échantillons et lavez-le dans le tampon A à 50 tr/min pendant 2 min à RT.
   3. Diluez le tampon d’amplification 5x (1:5) (inclus dans le kit PLA) dans de l’eau de haute pureté. Ajoutez la polymérase (1:80) (incluse dans le kit PLA) immédiatement avant de la verser doucement sur l’échantillon.
      REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter 8 μL du tampon de ligature 5x à 31,5 μL d’eau de haute pureté pour une réaction de 40 μL. Ajoutez ensuite 0,5 μL de ligase.
   4. Tapotez le tampon A restant et appliquez la solution d’amplification sur les échantillons. Incuber pendant 2 h à 37 °C.
7. Détection
   1. Versez doucement le tampon A sur les échantillons et lavez-le dans le tampon A à 50 tr/min pendant 2 min à RT.
   2. Diluez le tampon à fond clair de détection 5x (1:5) (inclus dans le kit PLA) dans de l’eau de haute pureté.
      REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter 8 μL du tampon de détection 5x à 32 μL d’eau de haute pureté pour une réaction de 40 μL.
   3. Tapotez le tampon A restant et appliquez la solution de détection sur les échantillons. Incuber pendant 1 h à RT.
8. Développement de substrats
   1. Versez doucement le tampon A sur les échantillons et lavez-le dans le tampon A à 50 tr/min pendant 2 min à RT.
   2. Diluez la solution de substrat en diluant les réactifs de substrat A (1:70), B (1:100), C (1:100) et D (1:50) (inclus dans le kit PLA) dans de l’eau de haute pureté.
      REMARQUE : Il est recommandé d’ajouter 0,6 μL de substrat A, 0,4 μL de substrat B, 0,4 μL de substrat C et 0,8 μL de substrat D dans 37,8 μL d’eau de haute pureté pour une réaction de 40 μL.
   3. Tapotez le tampon A restant et appliquez la solution d’amplification sur les échantillons. Incuber pendant 10 min à RT.
9. Coloration nucléaire
   1. Versez doucement de l’eau distillée sur les échantillons et lavez-les dans de l’eau distillée à 50 tr/min pendant 2 min à RT.
   2. Tapotez le reste de l’eau distillée. Ajouter une goutte de colorant nucléaire (inclus dans le kit PLA) à chaque échantillon de 1^cm2 et incuber pendant 2 min à RT.
   3. Rincez les lames sous l’eau courante du robinet pendant 10 min pour laisser la tache mûrir et obtenir une coloration bleue. N’utilisez pas d’eau stagnante du robinet.
10. Déshydratation
    1. Incuber les lames dans une solution contenant de l’éthanol à 96 % deux fois pendant 2 min. Ensuite, incubez les lames dans une solution contenant de l’éthanol à 99,7 % deux fois pendant 2 min.
    2. Incuber les lames dans du xylène pendant 10 min. Transférez ensuite les lames sur du xylène frais.
11. Montage des glissières
    1. Utilisez un volume minimum de milieu d’enrobage non aqueux et appliquez une lamelle sur l’échantillon, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se coince sous les lamelles.
    2. Laissez sécher les lames avant de les analyser au microscope à fond clair.

6. Imagerie pour la localisation

1. Acquérez des images à l’aide d’un microscope vertical.
   REMARQUE : Dans cette étude, l’imagerie des lames a été réalisée à l’aide d’un microscope à fond clair vertical (tableau des matériaux). Les images ont été acquises dans des conditions identiques à un grossissement de 40x pour au moins 10 champs de vision choisis au hasard de manière automatisée. Il est recommandé d’analyser un minimum de 500 cellules par condition.

7. Analyse pour la quantification

REMARQUE : La quantification des échantillons a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ⁸. FIJI, une distribution ImageJ comprenant ImageJ et d’autres plugins préinstallés, a été utilisée pour les analyses ultérieures ^9,10.

1. Pour déterminer le nombre de points :
   1. Ouvrez l’image.
   2. Effectuez la déconvolution des couleurs. Pour cela, cliquez sur Image > Couleurs > Déconvolution des couleurs.
   3. Sélectionnez l’image : - (color_1) dans le nom du fichier.
   4. Utilisez la commande Rechercher des maxima pour déterminer le nombre de points (Traiter > Rechercher des maxima).
2. Pour déterminer le nombre de cellules :
   1. Ouvrez l’image.
   2. Effectuez la déconvolution des couleurs. Pour cela, cliquez sur Image > Couleurs > Déconvolution des couleurs.
   3. Sélectionnez l’image : - (color_1) dans le nom du fichier.
   4. Trouvez un seuil qui indique le nombre maximum de noyaux. Pour cela, cliquez sur Image > Luminosité/Contraste > Seuil.
   5. Remplissez les trous en cliquant sur Traiter > Binaire > Remplir les trous.
   6. Utilisez la commande watershed pour diviser les composants connectés en composants distincts. Cliquez sur Traiter > Binary > Watershed.
   7. Analysez les particules pour déterminer le nombre de noyaux en cliquant sur Analyser > Analyser les particules.

Résultats

En utilisant la procédure décrite ci-dessus, il est possible de détecter et de quantifier la méthylation d’une protéine d’intérêt. Nous montrons ici l’exemple de la méthylation de la RG par PRMT5. Les anticorps et les conditions expérimentales du PLA ont déjà été appliqués à des cellules¹⁰. En bref, les anticorps primaires ciblant la GR et la SDMA sont reconnus par des sondes de proximité conjuguées à des oligonucléotides complémentaires....

Discussion

La méthylation de l’arginine, comme les autres PTM, contribue à la régulation fine des fonctions protéiques. Cependant, son impact est sous-estimé en raison de la difficulté d’évaluer ces modifications, principalement en raison d’un manque d’outils. C’est particulièrement vrai lors de l’étude de la méthylation in vivo, où la seule façon de mesurer la méthylation de l’arginine est de posséder des anticorps spécifiques reconnaissant le résidu méthyl?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope