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Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Le test de ligature de proximité est une technique très utile pour localiser et quantifier la méthylation de l’arginine d’une protéine donnée lorsque le résidu d’arginine modifié est inconnu et/ou si aucun anticorps spécifique n’est disponible.
La méthylation de l’arginine est en train de devenir une modification post-traductionnelle clé impliquée dans un large éventail de processus biologiques. Son étude dans les tissus est souvent limitée par l’absence d’anticorps spécifique reconnaissant le résidu d’arginine cible. Le test de ligature de proximité (PLA) a été développé à l’origine pour étudier les interactions protéine-protéine. Ici, nous décrivons en détail un protocole PLA dédié à la détection de la méthylation de l’arginine que nous avons appliqué au récepteur des glucocorticoïdes (GR). Ayant précédemment montré que PRMT5 diméthyle les GR dans les cellules, nous avons utilisé le PLA avec un anticorps diméthyle à symétrie pan-symétrique et un anticorps anti-GR pour mesurer la méthylation des GR dans les tumeurs mammaires. Nous démontrons que le PLA offre une approche unique pour mesurer la méthylation de l’arginine d’une protéine cible, même lorsque le site de méthylation n’a pas été identifié. Cette technique pourrait être étendue à d’autres modifications post-traductionnelles où des anticorps pan-efficaces sont disponibles. Par conséquent, nous détaillons la technologie PLA utilisée pour détecter la méthylation de l’arginine dans les tissus fixés en utilisant la RG comme exemple.
La méthylation de l’arginine par les protéines arginine méthyltransférases (PRMT) est une modification post-traductionnelle abondante (PTM) impliquée dans de nombreux processus biologiques. Les PRMT catalysent le transfert des groupes méthyles de la S-adénosylméthionine aux résidus d’arginine. La famille des PRMT comprend neuf membres classés selon le type de méthylation qu’ils effectuent. Tous les membres effectuent la monométhylation (MMA). Les PRMT de type 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 et 8) catalysent la diméthylation asymétrique (ADMA), tandis que les PRMT5 et 9 de type 2 catalysent la diméthylation symétrique (SDMA) et les PRMT de type 3 (PRMT7) ne génèrent que de la MMA1. En méthylant de nombreux substrats, les différents PRMT régulent une grande variété de processus cellulaires importants tels que la réparation de l’ADN, la régulation transcriptionnelle, la réponse immunitaire, le traitement de l’ARN et la transduction du signal 2,3. Cela est particulièrement vrai pour la signalisation des hormones stéroïdiennes, où les PRMT modifient l’activité des récepteurs stéroïdiens en méthylant non seulement les récepteurs eux-mêmes, mais aussi leurs régulateurs ou histones2.
La méthylation de l’arginine est largement étudiée dans le cancer, car la majorité des PRMT se sont révélées surexprimées dans le cancer par rapport aux tissus normaux, et leur expression est souvent associée à un mauvais pronostic 4,5. La détection de la méthylation de l’arginine in vivo est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires associées à cette modification. Ceci est conventionnellement réalisé en effectuant une immunohistochimie (IHC) avec un anticorps spécifique reconnaissant le résidu d’arginine méthylé. Cependant, cette méthode est très limitée car elle est basée sur l’identification du résidu d’arginine modifié et repose sur l’efficacité de l’anticorps utilisé. Le test de ligature de proximité in situ (PLA) a été initialement développé pour étudier les interactions protéine/protéine dans les cellules ou les tissus fixes6. Il est intéressant de noter que cette technologie peut également être utilisée pour détecter les PTM à l’aide d’un anticorps pan contre la modification d’intérêt, ainsi que d’un anticorps reconnaissant la protéine ciblée. Notre équipe a précédemment adapté cette technique pour étudier la méthylation du récepteur alpha des œstrogènes (ERα), en utilisant un anticorps anti-ERα et un anticorps reconnaissant spécifiquement le site de méthylation sur l’arginine 2607. Il convient de noter que cette technique peut être étendue aux anticorps reconnaissant un type particulier de méthylation, même lorsque le résidu méthylé est inconnu. En effet, plusieurs entreprises fournissent des anticorps pan-anticorps reconnaissant spécifiquement la MMA, l’ADMA ou la SDMA qui peuvent être utilisés avec succès pour étudier la méthylation des protéines in vivo.
Ici, en tant que preuve de concept, nous présentons une analyse détaillée de la méthylation de la GR à l’aide d’anticorps SDMA dans les tumeurs du sein humain, de la conception expérimentale à l’analyse des données.
Un consentement éclairé écrit a été obtenu de chaque patient. Le protocole d’étude a été approuvé par le comité d’éthique institutionnel du Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.
1. Choix des anticorps
2. Préparation de pastilles de lignées cellulaires enrobées de paraffine
REMARQUE : Les échantillons sont incorporés dans un gel, puis placés dans un processeur de tissus automatisé pour la déshydratation des échantillons et l’incorporation de paraffine.
3. Fixation des tissus et préparation des lames
4. Expérience IHC
REMARQUE : Les expériences IHC sont réalisées à l’aide de l’instrument de recherche Discovery XT (Table of Materials) pour l’automatisation et la reproductibilité.
5. Réactions de dosage de la ligature de proximité
REMARQUE : Tous les réactifs utilisés sont inclus dans les kits PLA (Table of Materials). Il est recommandé d’utiliser 40 μL de réactif pour 1cm2 de tissu. Toutes les incubations doivent être effectuées dans un environnement humide pour éviter une évaporation excessive. Ne laissez pas l’échantillon sécher, car cela pourrait entraîner un bruit de fond. Il est recommandé d’utiliser 1x tampon A (tampon de lavage in situ , Table des matériaux) pour les lavages dans les bocaux. Il doit y avoir un volume minimum de 70 mL dans les bocaux lors de l’incubation des échantillons sous agitation. Les échantillons doivent être conservés à RT avant utilisation.
6. Imagerie pour la localisation
7. Analyse pour la quantification
REMARQUE : La quantification des échantillons a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ8. FIJI, une distribution ImageJ comprenant ImageJ et d’autres plugins préinstallés, a été utilisée pour les analyses ultérieures 9,10.
En utilisant la procédure décrite ci-dessus, il est possible de détecter et de quantifier la méthylation d’une protéine d’intérêt. Nous montrons ici l’exemple de la méthylation de la RG par PRMT5. Les anticorps et les conditions expérimentales du PLA ont déjà été appliqués à des cellules10. En bref, les anticorps primaires ciblant la GR et la SDMA sont reconnus par des sondes de proximité conjuguées à des oligonucléotides complémentaires....
La méthylation de l’arginine, comme les autres PTM, contribue à la régulation fine des fonctions protéiques. Cependant, son impact est sous-estimé en raison de la difficulté d’évaluer ces modifications, principalement en raison d’un manque d’outils. C’est particulièrement vrai lors de l’étude de la méthylation in vivo, où la seule façon de mesurer la méthylation de l’arginine est de posséder des anticorps spécifiques reconnaissant le résidu méthyl?...
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts
Nous tenons à remercier B. Manship pour la relecture du manuscrit. Nous remercions Laura Francols, Clémentine Le Nevé, Plateforme de recherche en pathologie (CRCL) pour leur aide technique. La figure 1 a été réalisée à l’aide de Servier Medical Art. Cette étude a été soutenue par la Ligue Inter-régionale contre le Cancer et l’Association : « Le Cancer du sein, parlons-en ».
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adhesion slides TOMO 90°, x100 | VWR | 631-1239 | |
anti-GR antibody (mouse) | Santa Cruz | sc393232 | |
anti-GR antibody (mouse) | santa cruz | sc393232 | |
anti-PRMT5 antibody (rabbit) | Merck | 07-405 | |
anti-SDMA antibody (rabbit) | CST | 13222 | |
Automate d'inclusion | Leica | ASP 6025 | Paraffin infiltration and block preparation |
Autostainer XL | Leica | ST5010 | Autostainer |
Cassettes Q path macrostar III x1500 | VWR | 720-2233 | |
CC1 | Roche | 5279801001 | |
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL | MMF | F/T0050 | |
Dako antibody diluent | Dako Agilent | S202230-2 | antibody diluent |
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit | Roche | 760-159 | Diaminobenzidine (DAB) kit |
Discovery Wash | Roche | 7311079001 | |
Duolink insitu PLA probe anti-mouse minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | PLA kit (probe anti-rabbit minus) |
Duolink insitu detection reagents brightfield | Sigma-Aldrich | DUO92012 | PLA kit (in situ detection reagents) |
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus | Sigma-Aldrich | DUO92002 | PLA kit (probe anti-rabbit plus) |
Duolink insitu wash buffer brightfield | Sigma-Aldrich | DUO82047 | PLA kit (in situ wash buffer) |
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L | VWR | 83804.360 | |
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 20821.365 | |
EZ Prep 10x | Roche | 5279771001 | |
Formol, ready to use, 5 L | MMF | F/40877-36 | Formalin |
Fully automated glass coverslipper | Leica | CV5030 | automated coverslipper |
Glass coverslips 24 x 40 | Dutscher | 100037 | |
Hematoxylin | Ventana | 760-2021 | |
IHC instrument | Roche | DISCOVERY XT | Automation of IHC |
LCS | Roche | 5264839001 | |
Microtome | Thermo Scientific | Microm HM340E | Cutting of the tissues including in blocks |
Mounting Medium Pertex | Histolab | 00801-FR | |
PAP Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z672548-1EA | |
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg | Sakura | 4511 | |
Pasteur Disposable Pipettes | Fisher Scientific | 12583237 | |
PBS Buffer 10x, 100 mL | MMF | F/T0020 | |
Reaction Buffer 10x | Roche | 5353955001 | |
Ribo Wash 10x | Roche | 5266262001 | |
RiboCC1 | Roche | 5266297001 | |
Secondary antibody anti-mouse | Abcam | ab133469 | |
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP | Roche | 760-4311 | |
Tissue Embedding center | MMF | EC 350 | |
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L | VWR | 28975.360 | |
Zeiss Axio Imager M2 microscope | upright bright-field microscope |
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