근접 결찰 분석(proximity ligation assay)을 통해 고정 조직에서 단백질 아르기닌 메틸화(protein arginine methylation)를 검출, 국소화 및 정량화할 수 있습니다.

요약

근접 결찰 분석법은 변형된 아르기닌 잔류물을 알 수 없거나 특정 항체를 사용할 수 없는 경우 주어진 단백질의 아르기닌 메틸화를 국소화하고 정량화하는 데 매우 유용한 기술입니다.

초록

아르기닌 메틸화(arginine methylation)는 광범위한 생물학적 과정과 관련된 중요한 번역 후 변형(post-translational modification)으로 부상하고 있습니다. 조직에 대한 연구는 표적 아르기닌 잔류물을 인식하는 특정 항체가 없기 때문에 종종 제한됩니다. 근접 결찰 분석법(PLA)은 원래 단백질/단백질 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었습니다. 여기에서는 글루코코르티코이드 수용체(GR)에 적용한 아르기닌 메틸화 검출 전용 PLA 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이전에 PRMT5가 세포의 GR을 디메틸화한다는 것을 보여준 후, 우리는 PLA를 팬 대칭 디메틸 항체 및 항-GR 항체와 함께 사용하여 유방 종양의 GR 메틸화를 측정했습니다. 우리는 PLA가 메틸화 부위가 확인되지 않은 경우에도 표적 단백질의 아르기닌 메틸화를 측정하는 고유한 접근 방식을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 효과적인 pan 항체를 사용할 수 있는 다른 post-translational modification으로 확장될 수 있습니다. 따라서 GR을 예로 들어 고정 조직에서 아르기닌 메틸화를 감지하는 데 사용되는 PLA 기술에 대해 자세히 설명합니다.

서문

단백질 아르기닌 메틸전이효소(PRMT)에 의한 아르기닌 메틸화는 수많은 생물학적 과정에 관여하는 풍부한 번역 후 변형(PTM)입니다. PRMT는 S-아데노실 메티오닌에서 아르기닌 잔기로 메틸기의 전달을 촉매합니다. PRMT 제품군은 수행하는 메틸화 유형에 따라 분류된 9개의 구성원으로 구성됩니다. 모든 구성원은 모노메틸화(MMA)를 수행합니다. 유형 1(PRMT1, 2, 3, 4, 6 및 8) PRMT는 비대칭 디메틸화(ADMA)를 촉매하는 반면, 유형 2(PRMT5 및 9)는 대칭 디메틸화(SDMA)를 촉매하고 유형 3(PRMT7)은 MMA¹만 생성합니다. 수많은 기질을 메틸화함으로써 다양한 PRMT는 DNA 복구, 전사 조절, 면역 반응, RNA 처리 및 신호 전달과 같은 다양한 중요한 세포 과정을 조절합니다 ^2,3. 이것은 PRMT가 수용체 자체뿐만 아니라 조절자 또는 히스톤을 메틸화하여 스테로이드 수용체의 활성을 수정하는 스테로이드 호르몬 신호전달에 특히 해당됩니다².

아르기닌 메틸화는 주로 암에서 연구되고 있는데, PRMT의 대다수가 정상 조직과 비교하여 암에서 과발현되는 것으로 나타났으며, 이들의 발현은 종종 나쁜 예후와 관련이 있습니다 ^4,5. 생체 내에서 아르기닌 메틸화를 검출하는 것은 이러한 변형과 관련된 세포 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 이는 일반적으로 메틸화된 아르기닌 잔류물을 인식하는 특정 항체로 면역조직화학(IHC)을 수행하여 달성됩니다. 그러나 이 방법은 변형된 아르기닌 잔류물의 식별을 기반으로 하고 사용된 항체의 효능에 의존하기 때문에 매우 제한적입니다. 현장 근접 결찰 분석법(In situ proximity ligation assay, PLA)은 처음에 고정된 세포 또는 조직에서 단백질/단백질 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었습니다⁶. 흥미롭게도, 이 기술은 관심 변형에 대한 팬 항체와 표적 단백질을 인식하는 항체를 사용하여 PTM을 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리 팀은 이전에 항-ERα 항체와 아르기닌 260⁷의 메틸화 부위를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 에스트로겐 수용체 알파(ERα) 메틸화를 연구하기 위해 이 기술을 적용했습니다. 주목할 점은 이 기술은 메틸화된 잔류물을 알 수 없는 경우에도 특별한 유형의 메틸화를 인식하는 항체로 확장될 수 있다는 것입니다. 실제로, 몇몇 회사들은 in vivo에서 단백질 메틸화를 연구하는 데 성공적으로 사용될 수 있는 MMA, ADMA 또는 SDMA를 특별히 인식하는 pan 항체를 공급하고 있습니다.

여기에서는 개념 증명으로 실험 설계에서 데이터 분석에 이르기까지 인간 유방 종양에서 SDMA 항체를 사용한 GR 메틸화에 대한 자세한 분석을 제시합니다.

프로토콜

각 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구 프로토콜은 리옹 암 연구 센터(Cancer Research Center of Lyon)의 기관 윤리 위원회(institutional ethics committee)의 승인을 받았습니다.

1. 항체의 선택

1. IHC 또는 면역형광(IF)으로 검증된 1차 항체를 사용합니다.
   참고: 연구를 위해 선택된 1차 항체는 PLA의 성공에 매우 중요하며, 특히 고정 조직에서 매우 중요합니다. IHC 또는 IF에서 검증한 항체를 사용하면 실험의 성공률이 높아집니다. 실험을 수행하기 전에 항체의 최적화 및 특이성이 필요하며, 이상적으로는 관심 단백질의 발현에 대해 무효화된 세포에서 대조 실험을 수행하고 관련된 메틸전이효소의 효소 활성에 특이적인 억제제를 사용하는 것이 좋습니다. 여기서 조건은 이전에 최적화되었습니다¹⁰.

2. 파라핀 함유 세포주 펠렛 준비

참고: 샘플은 겔에 내장된 다음 샘플 탈수 및 파라핀 포매를 위해 자동화된 조직 처리기에 배치됩니다.

1. 트립신 해리를 사용하여 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 세포 펠릿을 준비합니다.
   알림: 세포를 채취하기 위해 긁지 마십시오.
2. 세포 펠릿을 1.5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.
3. 실온(RT)에서 200 x g의 세포를 원심분리합니다. PBS 상층액을 흡입합니다.
4. 펠릿을 4% 포르말린 1mL에 재현탁시키고 튜브를 4°C에서 3시간 동안 보관합니다.
5. 1X Tris-buffered-saline (TBS)으로 세포를 세척합니다.
   알림: 인산염 기반 용액은 겔을 해중합하므로 사용하지 마십시오.
6. TBS 1mL를 첨가하고 볼텍싱으로 30초 동안 균질화합니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
7. 2.5-2.7단계를 두 번 반복합니다.
8. 특정 프로그램에 따라 자동화된 조직 처리기에 조직을 포함시킵니다.
   포르말린 1시간 37°C
   증류수 2분 RT
   EtOH 70% 40분 45°C
   EtOH 80% 40분 45°C
   EtOH 95% 40분 45°C
   EtOH 100% 40분 45°C
   EtOH 100% 40분 45°C
   EtOH 100% 40분 45°C
   크실렌 40분 45°C
   크실렌 40분 45°C
   크실렌 40분 45°C
   파라핀 1 시간 60 ° C
   파라핀 1 시간 60 ° C
   파라핀 1 시간 30 분 60 ° C

3. 조직 정착과 활주 준비

1. 포함하기 전에 24시간 동안 4% 포르말린에 조직을 고정합니다.
2. 마이크로톰으로 조직을 포함하는 블록의 3μm 두께의 연속 절편을 절단합니다.
3. 자일렌(10분)을 2회, 100% 에탄올(5분), 95% 에탄올(5분), 물(5분)을 차례로 배양하여 오토염색기로 파라핀화를 수행합니다.
4. 적절한 pH(보통 6-9)에서 40분 동안 98°C의 수조를 사용하여 10mM 시트레이트 버퍼에서 열 유도 에피토프 회수를 수행합니다.
   참고: 두 항체가 동일한 pH에서 작동해야 방법이 성공할 수 있습니다. 본원에 사용된 최적의 pH를 확립하기 전에 몇 가지 테스트를 수행하였다. 본 연구에서 사용된 항체는 SDMA 항체와 GR 항체이다.
5. 슬라이드를 20분 동안 식힌 다음 1x PBS에서 20분 동안 세탁합니다.

4. IHC 실험

참고: IHC 실험은 자동화 및 재현성을 위해 Discovery XT 연구 기기(재료 표)를 사용하여 수행됩니다.

1. 과산화효소 담금질을 피하려면 디아미노벤지딘(DAB) 키트에 포함된 억제제를 사용하십시오.
2. 항체 희석제에 희석된 두 개의 기본 항체로 슬라이드를 60분 동안 배양합니다.
3. 2차 항토끼 무 과산화효소(HRP) 항체로 슬라이드를 16분 동안 배양하거나 항 마우스 항체를 30분 동안 배양합니다.
   알림: IHC 검출을 위해 상용 디아미노벤지딘(DAB) 키트(재료 표)를 사용하는 것이 좋습니다.
4. 시료에 헤마톡실린(100μL/슬라이드 8분)과 블루잉(100μL/슬라이드 4분)을 도포하여 핵을 염색합니다.
5. 슬라이드를 따뜻한 비눗물로 세척한 다음 자동 염색기를 사용하여 탈수하고 장착 매체를 사용하여 자동 커버 슬리퍼에 장착합니다.

5. 근접 결찰 분석 반응

참고: 사용된 모든 시약은 PLA 키트(Table of Materials)에 포함되어 있습니다. 1cm² 의 조직에 대해 40μL의 시약을 사용하는 것이 좋습니다. 모든 배양은 과도한 증발을 방지하기 위해 습한 환경에서 수행되어야 합니다. s를 허용하지 마십시오amp건조되면 배경 소음이 발생할 수 있습니다. 항아리의 세척을 위해 1x 버퍼 A(현장 세척 버퍼, 재료 표)를 사용하는 것이 좋습니다. 교반 상태에서 샘플을 배양할 때 항아리에 최소 70mL의 부피가 있어야 합니다. 샘플은 사용하기 전에 RT에 보관해야 합니다.

1. 과산화효소 담금질
   1. 실험 중 용액의 과도한 증발을 방지하기 위해 소수성 펜을 사용하여 반응 영역을 구분합니다. 각 샘플의 1cm² 당 과산화수소 용액 한 방울을 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 사용된 샘플/항체에 따라 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다.
2. 블로킹
   1. 완충액 A를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 5분 동안 교반하면서 50rpm의 완충액 A에서 세척합니다.
   2. 나머지 버퍼 A를 두드리고 차단 용액 1cm² 당 한 방울을 추가합니다(PLA 키트에 포함). 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 1차 항체 배양
   1. 항체 희석제에서 두 가지 기본 항체를 적절한 농도로 희석합니다.
   2. 슬라이드에서 차단 용액을 제거하고 즉시 1차 항체 용액(PLA 키트에 포함)을 추가합니다. 37°C의 습도 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
4. PLA 프로브 배양
   1. 항체 희석제에서 PLA 프로브 PLUS(1:5)를 PLA 프로브 마이너스(1:5)로 희석합니다.
      참고: 40 μL 반응의 경우 8 μL의 PLA 프로브에서 재고(5x)를 뺀 값, 8 μL의 PLA 프로브와 재고(5x) 및 24 μL의 항체 희석제를 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 버퍼 A를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 5분 동안 50rpm으로 버퍼 A를 세척합니다.
   3. 나머지 버퍼 A를 탭아웃하고 PLA 프로브 솔루션(PLA 키트에 포함)을 샘플에 적용합니다. 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
5. 결찰
   1. 다음 단계를 수행하기 전에 ligation buffer(PLA 키트에 포함)를 해동합니다.
   2. 버퍼 A를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 5분 동안 50rpm으로 버퍼 A를 세척합니다.
   3. 5x ligation buffer(1:5)(PLA 키트에 포함)를 고순도 물에 희석합니다. 샘플에 추가하기 직전에 ligase (1:40) (PLA 키트에 포함)를 추가합니다.
      참고: 40 μL 반응을 위해 31 μL의 고순도 물에 8 μL의 5x ligation buffer를 추가하는 것이 좋습니다. 그런 다음 1μL의 리가아제를 추가합니다.
   4. 나머지 버퍼 A를 탭아웃하고 리가제 용액을 샘플에 적용합니다. 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
6. 증폭
   1. 다음 단계를 수행하기 전에 증폭 버퍼를 해동합니다.
   2. 버퍼 A를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 2분 동안 50rpm으로 버퍼 A를 세척합니다.
   3. 5x 증폭 버퍼(1:5)(PLA 키트에 포함)를 고순도 물로 희석합니다. 중합효소(1:80)(PLA 키트에 포함)를 시료에 부드럽게 떨어뜨리기 직전에 추가합니다.
      참고: 40 μL 반응을 위해 31.5 μL의 고순도 물에 8 μL의 5x ligation buffer를 추가하는 것이 좋습니다. 그런 다음 0.5μL의 리가아제를 추가합니다.
   4. 나머지 버퍼 A를 탭아웃하고 증폭 용액을 샘플에 적용합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.
7. 탐지
   1. 버퍼 A를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 2분 동안 50rpm으로 버퍼 A를 세척합니다.
   2. 5x 검출 명시야 버퍼(1:5)(PLA 키트에 포함)를 고순도 물로 희석합니다.
      참고: 40μL 반응을 위해 32μL의 고순도 물에 8μL의 5x 검출 버퍼를 추가하는 것이 좋습니다.
   3. 나머지 버퍼 A를 탭아웃하고 검출 용액을 샘플에 적용합니다. RT에서 1시간 동안 배양합니다.
8. 기판 개발
   1. 버퍼 A를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 2분 동안 50rpm으로 버퍼 A를 세척합니다.
   2. 기질 시약 A(1:70), B(1:100), C(1:100) 및 D(1:50)(PLA 키트에 포함)를 고순도 물에 희석하여 기질 용액을 희석합니다.
      참고: 40 μL 반응을 위해 37.8 μL의 고순도 물에 0.6 μL의 기질 A, 0.4 μL의 기질 B, 0.4 μL의 기질 C 및 0.8 μL의 기질 D를 첨가하는 것이 좋습니다.
   3. 나머지 버퍼 A를 탭아웃하고 증폭 용액을 샘플에 적용합니다. RT에서 10분 동안 배양합니다.
9. 핵 염색
   1. 증류수를 샘플에 부드럽게 떨어뜨리고 RT에서 50분 동안 2rpm의 증류수로 세척합니다.
   2. 남은 증류수를 두드립니다. 각 1cm² 샘플에 핵 염색 한 방울(PLA 키트에 포함됨)을 추가하고 RT에서 2분 동안 배양합니다.
   3. 흐르는 수돗물에 슬라이드를 10분 동안 헹구어 얼룩이 성숙하고 파란색을 띠도록 합니다. 고인 수돗물을 사용하지 마십시오.
10. 탈수
    1. 96% 에탄올이 함유된 용액에 슬라이드를 2분 동안 두 번 배양합니다. 그런 다음 99.7% 에탄올이 포함된 용액에 슬라이드를 2분 동안 두 번 배양합니다.
    2. 슬라이드를 자일렌에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 새로운 자일렌으로 옮깁니다.
11. 슬라이드 장착
    1. 최소한의 비수성 장착 매체를 사용하고 샘플 상단에 커버슬립을 적용하여 커버슬립 아래에 기포가 끼지 않도록 합니다.
    2. 명시야 현미경에서 분석하기 전에 슬라이드를 건조시킵니다.

6. 위치 파악을 위한 이미징

1. 정립 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.
   참고: 이 연구에서는 정립 명시야 현미경(Table of Materials)에서 슬라이드 이미징을 수행했습니다. 이미지는 무작위로 선택된 최소 10개의 시야각에 대해 40배 배율의 동일한 조건에서 자동화된 방식으로 획득되었습니다. 조건당 최소 500개의 셀을 분석하는 것이 좋습니다.

7. 정량화를 위한 분석

참고: 샘플의 정량화는 ImageJ 소프트웨어⁸을 사용하여 수행되었습니다. ImageJ 및 기타 사전 설치된 플러그인을 포함하는 ImageJ 배포판인 FIJI가 후속 분석에 사용되었습니다 ^9,10.

1. 점의 수를 결정하려면:
   1. 이미지를 엽니다.
   2. 컬러 디콘볼루션을 수행합니다. 이를 위해 Image > Colors > Color Deconvolution을 클릭합니다.
   3. 파일 이름에서 - (color_1)을 선택합니다.
   4. 최대값 찾기 명령을 사용하여 점 수를 확인합니다(프로세스 > 최대값 찾기).
2. 셀 수를 확인하려면:
   1. 이미지를 엽니다.
   2. 컬러 디콘볼루션을 수행합니다. 이를 위해 Image > Colors > Color Deconvolution을 클릭하십시오.
   3. 파일 이름에서 이미지: - (color_1)를 선택합니다.
   4. 최대 핵 수를 표시하는 임계값을 찾습니다. 이를 위해 Image > Brightness/Contrast > Threshold를 클릭합니다.
   5. Process > Binary > Fill holees를 클릭하여 구멍을 채웁니다.
   6. 유역 명령을 사용하여 연결된 구성요소를 별도의 구성요소로 분할합니다. Process > Binary > Watershed를 클릭합니다.
   7. Analyze > Analyze Particles를 클릭하여 핵 수를 결정하기 위해 입자를 분석합니다.

결과

위에서 설명한 절차를 사용하여 관심 단백질의 메틸화를 검출하고 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 PRMT5에 의한 GR의 메틸화의 예를 보여줍니다. PLA에 대한 항체 및 실험 조건은 이전에 세포¹⁰에 적용되었습니다. 간단히 말해서, GR 및 SDMA를 표적으로 하는 1차 항체는 상보적 올리고뉴클레오티드와 접합된 근접 프로브에 의해 인식됩니다. 그런 다음, 원?...

토론

아르기닌 메틸화는 다른 PTM과 마찬가지로 단백질 기능의 미세한 조절에 기여합니다. 그러나 이러한 수정 사항을 평가하기가 어렵기 때문에 그 영향이 과소 평가되고 있으며, 주로 도구가 부족하기 때문입니다. 이는 생체 내에서 메틸화를 연구할 때 특히 그러한데, 아르기닌 메틸화를 측정하는 유일한 방법은 관심 단백질의 메틸화된 잔류물을 인식하는 특정 항체?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope