Der Proximity-Ligation-Assay ermöglicht den Nachweis, die Lokalisierung und die Quantifizierung der Protein-Arginin-Methylierung in fixiertem Gewebe

Zusammenfassung

Der Proximity-Ligation-Assay ist eine sehr nützliche Technik zur Lokalisierung und Quantifizierung der Arginin-Methylierung eines bestimmten Proteins, wenn der modifizierte Argininrest unbekannt ist und/oder wenn kein spezifischer Antikörper verfügbar ist.

Zusammenfassung

Die Arginin-Methylierung entwickelt sich zu einer wichtigen posttranslationalen Modifikation, die an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist. Die Untersuchung im Gewebe wird oft durch das Fehlen eines spezifischen Antikörpers eingeschränkt, der den Ziel-Argininrest erkennt. Der Proximity-Ligation-Assay (PLA) wurde ursprünglich entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir im Detail ein PLA-Protokoll zum Nachweis der Arginin-Methylierung, das wir auf den Glukokortikoidrezeptor (GR) angewendet haben. Nachdem wir zuvor gezeigt hatten, dass PRMT5 GRs in Zellen dimethyliert, verwendeten wir PLA mit einem pansymmetrischen Dimethyl-Antikörper und einem Anti-GR-Antikörper, um die GR-Methylierung in Brusttumoren zu messen. Wir zeigen, dass PLA einen einzigartigen Ansatz bietet, um die Arginin-Methylierung eines Zielproteins zu messen, selbst wenn der Ort der Methylierung nicht identifiziert wurde. Diese Technik könnte auf andere posttranslationale Modifikationen ausgeweitet werden, bei denen wirksame pan-Antikörper verfügbar sind. Daher beschreiben wir die PLA-Technologie, die zum Nachweis der Arginin-Methylierung in fixiertem Gewebe verwendet wird, am Beispiel von GR.

Einleitung

Die Arginin-Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) ist eine häufig vorkommende posttranslationale Modifikation (PTM), die an zahlreichen biologischen Prozessen beteiligt ist. PRMTs katalysieren den Transfer von Methylgruppen vom S-Adenosylmethionin zu Argininresten. Die PRMT-Familie besteht aus neun Mitgliedern, die nach der Art der Methylierung, die sie durchführen, klassifiziert werden. Alle Mitglieder führen eine Monomethylierung (MMA) durch. Typ 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 und 8) PRMTs katalysieren die asymmetrische Dimethylierung (ADMA), während Typ 2 (PRMT5 und 9) die symmetrische Dimethylierung (SDMA) katalysieren und Typ 3 (PRMT7) nur MMA¹ erzeugen. Durch die Methylierung zahlreicher Substrate regulieren die verschiedenen PRMTs eine Vielzahl wichtiger zellulärer Prozesse wie DNA-Reparatur, transkriptionelle Regulation, Immunantwort, RNA-Prozessierung und Signaltransduktion ^2,3. Dies gilt insbesondere für die Signalübertragung von Steroidhormonen, bei denen PRMTs die Aktivität von Steroidrezeptoren modifizieren, indem sie nicht nur die Rezeptoren selbst, sondern auch ihre Regulatoren oder Histone methylieren².

Die Arginin-Methylierung wird weitgehend bei Krebs untersucht, da die Mehrzahl der PRMTs bei Krebs im Vergleich zu normalem Gewebe überexprimiert wurde und ihre Expression oft mit einer schlechten Prognose verbunden ist ^4,5. Der Nachweis der Arginin-Methylierung in vivo ist essentiell für das Verständnis der zellulären Funktionen, die mit dieser Modifikation verbunden sind. Dies wird herkömmlicherweise durch die Durchführung einer Immunhistochemie (IHC) mit einem spezifischen Antikörper erreicht, der den methylierten Argininrest erkennt. Diese Methode ist jedoch sehr eingeschränkt, da sie auf der Identifizierung des modifizierten Argininrests basiert und auf der Wirksamkeit des verwendeten Antikörpers beruht. Der In-situ-Proximity-Ligationsassay (PLA) wurde ursprünglich entwickelt, um Protein/Protein-Wechselwirkungen in fixierten Zellen oder Geweben zu untersuchen⁶. Interessanterweise kann diese Technologie auch zum Nachweis von PTMs verwendet werden, wobei ein Pan-Antikörper gegen die Modifikation von Interesse verwendet wird, sowie ein Antikörper, der das Zielprotein erkennt. Unser Team hat diese Technik zuvor angepasst, um die Methylierung des Östrogenrezeptors alpha (ERα) zu untersuchen, indem es einen Anti-ERα-Antikörper und einen Antikörper verwendete, der die Methylierungsstelle auf Arginin 260⁷ spezifisch erkennt. Bemerkenswert ist, dass diese Technik auf Antikörper ausgedehnt werden kann, die eine spezielle Art der Methylierung erkennen, selbst wenn der methylierte Rest unbekannt ist. In der Tat liefern mehrere Unternehmen Pan-Antikörper, die speziell MMA, ADMA oder SDMA erkennen und erfolgreich zur Untersuchung der Proteinmethylierung in vivo eingesetzt werden können.

Hier präsentieren wir als Proof-of-Concept eine detaillierte Analyse der GR-Methylierung mittels SDMA-Antikörpern in humanen Brusttumoren vom Versuchsdesign bis zur Datenanalyse.

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Protokoll

Von jedem Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Ethikkommission des Krebsforschungszentrums von Lyon genehmigt.

1. Auswahl der Antikörper

1. Verwenden Sie Primärantikörper, die durch IHC oder Immunfluoreszenz (IF) validiert wurden.
   HINWEIS: Die für die Studie ausgewählten Primärantikörper sind entscheidend für den Erfolg von PLA und insbesondere im fixierten Gewebe. Die Verwendung eines Antikörpers, der durch IHC oder IF validiert wurde, erhöht die Erfolgsrate des Experiments. Optimierung und Spezifität von Antikörpern sind erforderlich, bevor Experimente durchgeführt werden, idealerweise durch Durchführung von Kontrollexperimenten in Zellen, die für die Expression des interessierenden Proteins ungültig geworden sind, und unter Verwendung eines Inhibitors, der spezifisch für die enzymatische Aktivität der beteiligten Methyltransferase ist. Hier wurden die Bedingungen zuvor^{optimiert 10}.

2. Vorbereitung von in Paraffin eingebetteten Zelllinien-Pellets

HINWEIS: Die Proben werden in ein Gel eingebettet und dann zur Probendehydrierung und Paraffineinbettung in einen automatisierten Gewebeprozessor gegeben.

1. Bereiten Sie das Zellpellet in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung der Trypsindissoziation vor.
   HINWEIS: Kratzen Sie nicht, um Zellen zu ernten.
2. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur (RT) bei 200 x g. Aspirieren Sie den PBS-Überstand.
4. Das Pellet in 1 mL 4%igem Formalin resuspendieren und die Röhrchen 3 h lang bei 4 °C lagern.
5. Waschen Sie die Zellen in 1X Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS).
   HINWEIS: Verwenden Sie keine Lösung auf Phosphatbasis, da diese das Gel depolymerisiert.
6. 1 mL TBS zugeben und durch Vortexen 30 s lang homogenisieren. 5 min bei 200 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.7 zweimal.
8. Führen Sie die Aufnahme des Gewebes in den automatisierten Gewebeprozessor nach dem spezifischen Programm durch:
   Formalin 1 h 37 °C
   Destilliertes Wasser 2 min RT
   EtOH 70% 40 min 45 °C
   EtOH 80% 40 min 45 °C
   EtOH 95% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   EtOH 100% 40 min 45 °C
   Xylol 40 min 45 °C
   Xylol 40 min 45 °C
   Xylol 40 min 45 °C
   Paraffin 1 h 60 °C
   Paraffin 1 h 60 °C
   Paraffin 1 h 30 min 60 °C

3. Gewebefixierung und Vorbereitung des Objektträgers

1. Fixieren Sie das Gewebe 24 Stunden lang in 4% Formalin, bevor Sie es einschließen.
2. Schneiden Sie 3 μm dicke Serienabschnitte der Blöcke mit Geweben mit einem Mikrotom ab.
3. Führen Sie eine Entparaffinisierung mit dem Autostainer durch, indem Sie die Objektträger nacheinander zweimal in Xylol (10 min), 100 % Ethanol (5 min), 95 % Ethanol (5 min) und Wasser (5 min) inkubieren.
4. Führen Sie eine hitzeinduzierte Epitopgewinnung in 10 mM Citratpuffer durch und verwenden Sie ein Wasserbad bei 98 °C für 40 Minuten bei dem entsprechenden pH-Wert (normalerweise 6-9).
   HINWEIS: Die beiden Antikörper müssen beim gleichen pH-Wert wirken, damit die Methode erfolgreich ist. Mehrere Tests wurden durchgeführt, bevor der hier verwendete optimale pH-Wert bestimmt wurde. Bei den in dieser Studie verwendeten Antikörpern handelt es sich um den SDMA-Antikörper und den GR-Antikörper.
5. Die Dias 20 min abkühlen lassen, dann in 1x PBS 20 min waschen.

4. IHC-Versuch

HINWEIS: IHC-Experimente werden mit dem Forschungsinstrument Discovery XT (Table of Materials) durchgeführt, um Automatisierung und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

1. Um eine Peroxidase-Quenching zu vermeiden, verwenden Sie den Inhibitor, der im Diaminobenzidin (DAB)-Kit enthalten ist.
2. Inkubieren Sie die Objektträger mit den beiden Primärantikörpern, die im Antikörperverdünnungsmittel verdünnt sind, für 60 Minuten.
3. Inkubieren Sie die Objektträger 16 Minuten lang mit dem sekundären Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-Antikörper (HRP) oder 30 Minuten lang mit dem Anti-Maus-Antikörper.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, ein handelsübliches Diaminobenzidin (DAB)-Kit (Table of Materials) für den IHC-Nachweis zu verwenden.
4. Tragen Sie Hämatoxylin (100 μl/Objektträger für 8 min) und Bläuung (100 μl/Objektträger für 4 min) auf die Proben auf, um die Zellkerne zu färben.
5. Waschen Sie die Objektträger in warmem Seifenwasser, trocknen Sie sie dann mit einem Autostainer und montieren Sie sie mit einem Eindeckmedium auf einen automatischen Eindecker.

5. Reaktionen auf Proximity-Ligationsassays

HINWEIS: Alle verwendeten Reagenzien sind in den PLA-Kits (Table of Materials) enthalten. Es wird empfohlen, 40 μl Reagenz für 1 cm² Gewebe zu verwenden. Alle Inkubationen müssen in einer feuchten Umgebung durchgeführt werden, um eine übermäßige Verdunstung zu verhindern. Lassen Sie die Probe nicht austrocknen, da dies zu Hintergrundgeräuschen führen kann. Es wird empfohlen, 1x Puffer A (in situ Waschpuffer, Table of Materials) für die Waschvorgänge in den Gläsern zu verwenden. Bei der Inkubation von Proben unter Rühren sollte ein Mindestvolumen von 70 ml in den Gläsern vorhanden sein. Die Proben sollten vor der Verwendung bei RT aufbewahrt werden.

1. Peroxidase-Quenching
   1. Begrenzen Sie den Reaktionsbereich mit einem hydrophoben Stift, um eine übermäßige Verdunstung der Lösung während des Experiments zu verhindern. Geben Sie einen Tropfen Wasserstoffperoxidlösung pro 1 cm² jeder Probe hinzu. 5 min bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Inkubationszeit entsprechend den verwendeten Proben/Antikörpern zu optimieren.
2. Blockierend
   1. Puffer A vorsichtig auf die Proben tropfen und Puffer A bei 50 U/min unter Rühren 5 Minuten lang bei RT waschen.
   2. Klopfen Sie den restlichen Puffer A ab und fügen Sie einen Tropfen pro 1^cm2 Blockierungslösung (im PLA-Kit enthalten) hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren.
3. Inkubation von Primärantikörpern
   1. Verdünnen Sie die beiden Primärantikörper in geeigneten Konzentrationen im Antikörperverdünnungsmittel.
   2. Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern und fügen Sie sofort die primäre Antikörperlösung (im PLA-Kit enthalten) hinzu. 1 h in einer Feuchtigkeitskammer bei 37 °C inkubieren.
4. Inkubation der PLA-Sonde
   1. Verdünnen Sie die PLA-Sonde PLUS (1:5) mit der PLA-Sonde minus (1:5) im Antikörperverdünnungsmittel.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 8 μl PLA-Sonde minus Vorrat (5x), 8 μl PLA-Sonde plus Vorrat (5x) und 24 μl Antikörperverdünnungsmittel für eine 40-μl-Reaktion zu verwenden.
   2. Puffer A vorsichtig auf die Proben tropfen und in Puffer A bei 50 U/min für 50 U/min bei RT waschen.
   3. Klopfen Sie den restlichen Puffer A ab und tragen Sie die PLA-Sondenlösung (im PLA-Kit enthalten) auf die Proben auf. 1 h bei 37 °C inkubieren.
5. Gebundenheit
   1. Tauen Sie den Ligationspuffer (im PLA-Kit enthalten) vor den folgenden Schritten auf.
   2. Puffer A vorsichtig auf die Proben tropfen und in Puffer A bei 50 U/min für 50 U/min bei RT waschen.
   3. Verdünnen Sie den 5x Ligationspuffer (1:5) (im PLA-Kit enthalten) in hochreinem Wasser. Geben Sie die Ligase (1:40) (im PLA-Kit enthalten) unmittelbar vor der Zugabe zur Probe hinzu.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 8 μl des 5x Ligationspuffers zu 31 μl hochreinem Wasser hinzuzufügen, um eine Reaktion von 40 μl zu erzielen. Fügen Sie dann 1 μl Ligase hinzu.
   4. Klopfen Sie den restlichen Puffer A ab und tragen Sie die Ligaselösung auf die Proben auf. 30 min bei 37 °C inkubieren.
6. Verstärkung
   1. Tauen Sie den Amplifikationspuffer auf, bevor Sie die folgenden Schritte ausführen.
   2. Puffer A vorsichtig auf die Proben tropfen und in Puffer A bei 50 U/min für 2 Minuten bei RT waschen.
   3. Verdünnen Sie den 5x Amplifikationspuffer (1:5) (im PLA-Kit enthalten) in hochreinem Wasser. Geben Sie die Polymerase (1:80) (im PLA-Kit enthalten) sofort hinzu, bevor Sie sie vorsichtig auf die Probe tropfen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 8 μl des 5x Ligationspuffers zu 31,5 μl hochreinem Wasser hinzuzufügen, um eine 40 μl Reaktion zu erzielen. Fügen Sie dann 0,5 μl Ligase hinzu.
   4. Klopfen Sie den restlichen Puffer A ab und tragen Sie die Amplifikationslösung auf die Proben auf. 2 h bei 37 °C inkubieren.
7. Erkennung
   1. Puffer A vorsichtig auf die Proben tropfen und in Puffer A bei 50 U/min für 2 Minuten bei RT waschen.
   2. Verdünnen Sie den 5x Detektions-Hellfeldpuffer (1:5) (im PLA-Kit enthalten) in hochreinem Wasser.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 8 μl des 5x Detektionspuffers zu 32 μl hochreinem Wasser hinzuzufügen, um eine Reaktion von 40 μl zu erzielen.
   3. Klopfen Sie den restlichen Puffer A ab und tragen Sie die Nachweislösung auf die Proben auf. 1 h bei RT inkubieren.
8. Entwicklung des Substrats
   1. Puffer A vorsichtig auf die Proben tropfen und in Puffer A bei 50 U/min für 2 Minuten bei RT waschen.
   2. Verdünnen Sie die Substratlösung, indem Sie die Substratreagenzien A (1:70), B (1:100), C (1:100) und D (1:50) (im PLA-Kit enthalten) in hochreinem Wasser verdünnen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 0,6 μl Substrat A, 0,4 μl Substrat B, 0,4 μl Substrat C und 0,8 μl Substrat D in 37,8 μl hochreines Wasser für eine Reaktion von 40 μl hinzuzufügen.
   3. Klopfen Sie den restlichen Puffer A ab und tragen Sie die Amplifikationslösung auf die Proben auf. 10 Minuten bei RT inkubieren.
9. Nukleare Färbung
   1. Tropfen Sie vorsichtig destilliertes Wasser auf die Proben und waschen Sie es in destilliertem Wasser bei 50 U/min für 2 Minuten bei RT.
   2. Klopfen Sie das restliche destillierte Wasser ab. Geben Sie einen Tropfen Kernfleck (im PLA-Kit enthalten) zu jeder 1 cm² großen Probe und inkubieren Sie 2 Minuten lang bei RT.
   3. Spülen Sie die Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser ab, damit der Fleck reift und eine blaue Färbung entsteht. Verwenden Sie kein stehendes Leitungswasser.
10. Austrocknung
    1. Inkubieren Sie die Objektträger in einer Lösung mit 96 % Ethanol zweimal für 2 Minuten. Dann inkubieren Sie die Objektträger in einer Lösung mit 99,7 % Ethanol zweimal für 2 Minuten.
    2. Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Xylol. Übertragen Sie dann die Objektträger in frisches Xylol.
11. Montage der Rutschen
    1. Verwenden Sie ein Minimum an nichtwässrigem Eindeckmedium und tragen Sie ein Deckglas auf die Probe auf, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen unter den Deckgläsern verfangen.
    2. Lassen Sie die Objektträger trocknen, bevor Sie sie mit einem Hellfeldmikroskop analysieren.

6. Bildgebung für die Lokalisierung

1. Nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop auf.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde die Bildgebung von Objektträgern unter einem aufrechten Hellfeldmikroskop durchgeführt (Materialtabelle). Die Bilder wurden unter identischen Bedingungen bei 40-facher Vergrößerung für mindestens 10 zufällig ausgewählte Sichtfelder automatisiert aufgenommen. Es wird empfohlen, mindestens 500 Zellen pro Bedingung zu analysieren.

7. Analyse zur Quantifizierung

HINWEIS: Die Quantifizierung der Proben wurde mit der ImageJ-Software⁸ durchgeführt. Für die anschließenden Analysen wurde FIJI, eine ImageJ-Distribution mit ImageJ und anderen vorinstallierten Plugins, verwendet ^9,10.

1. So bestimmen Sie die Anzahl der Punkte:
   1. Öffnen Sie das Bild.
   2. Führen Sie eine Farbentfaltung durch. Klicken Sie dazu auf Image > Colors > Color Deconvolution.
   3. Wählen Sie das Bild aus: - (color_1) im Dateinamen.
   4. Verwenden Sie den Befehl Maxima suchen , um die Anzahl der Punkte zu bestimmen (Verarbeiten > Maxima suchen).
2. So bestimmen Sie die Anzahl der Zellen:
   1. Öffnen Sie das Bild.
   2. Führen Sie eine Farbentfaltung durch. Klicken Sie dazu auf Image > Colors > Color Deconvolution.
   3. Wählen Sie das Bild aus: - (color_1) im Dateinamen.
   4. Suchen Sie einen Schwellenwert, der die maximale Anzahl von Kernen anzeigt. Klicken Sie dazu auf Bild > Helligkeit/Kontrast > Schwellenwert.
   5. Füllen Sie die Löcher, indem Sie auf Prozess > Binär > Löcher füllen klicken.
   6. Verwenden Sie den Befehl watershed, um verbundene Komponenten in separate Komponenten zu unterteilen. Klicken Sie auf Verarbeiten > Binäres > Wasserscheide.
   7. Partikel analysieren, um die Anzahl der Kerne zu bestimmen, indem Sie auf Analysieren > Partikel analysieren klicken.

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Ergebnisse

Mit dem oben beschriebenen Verfahren ist es möglich, die Methylierung eines interessierenden Proteins nachzuweisen und zu quantifizieren. Hier zeigen wir das Beispiel der Methylierung von GR durch PRMT5. Die Antikörper und die experimentellen Bedingungen für PLA wurden zuvor an Zellen¹⁰ appliziert. Kurz gesagt, primäre Antikörper, die auf GR und SDMA abzielen, werden durch Proximity-Sonden erkannt, die mit komplementären Oligonukleotiden konjugiert sind. Dan...

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Diskussion

Die Arginin-Methylierung trägt wie andere PTMs zur Feinregulierung der Proteinfunktionen bei. Die Auswirkungen werden jedoch unterschätzt, da es schwierig ist, diese Änderungen zu bewerten, vor allem aufgrund fehlender Instrumente. Dies gilt insbesondere für die Untersuchung der Methylierung in vivo, wo die einzige Möglichkeit, die Arginin-Methylierung zu messen, darin besteht, spezifische Antikörper zu besitzen, die den methylierten Rest des interessierenden Proteins erke...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides TOMO 90°, x100	VWR	631-1239
anti-GR antibody (mouse)	Santa Cruz	sc393232
anti-GR antibody (mouse)	santa cruz	sc393232
anti-PRMT5 antibody (rabbit)	Merck	07-405
anti-SDMA antibody (rabbit)	CST	13222
Automate d'inclusion	Leica	ASP 6025	Paraffin infiltration and block preparation
Autostainer XL	Leica	ST5010	Autostainer
Cassettes Q path macrostar III  x1500	VWR	720-2233
CC1	Roche	5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mL	MMF	F/T0050
Dako antibody diluent	Dako Agilent	S202230-2	antibody diluent
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) kit	Roche	760-159	Diaminobenzidine (DAB) kit
Discovery Wash	Roche	7311079001
Duolink insitu  PLA probe anti-mouse minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	PLA  kit (probe anti-rabbit minus)
Duolink insitu detection reagents brightfield	Sigma-Aldrich	DUO92012	PLA  kit (in situ detection reagents)
Duolink insitu PLA probe anti-rabbit plus	Sigma-Aldrich	DUO92002	PLA  kit (probe anti-rabbit plus)
Duolink insitu wash buffer brightfield	Sigma-Aldrich	DUO82047	PLA  kit (in situ wash buffer)
Ethanol 96% VOL TECHNISOLV, 5 L	VWR	83804.360
Ethanol absolute ≥99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 L	VWR	20821.365
EZ Prep 10x	Roche	5279771001
Formol, ready to use, 5 L	MMF	F/40877-36	Formalin
Fully automated glass coverslipper	Leica	CV5030	automated coverslipper
Glass coverslips 24 x 40	Dutscher	100037
Hematoxylin	Ventana	760-2021
IHC instrument	Roche	DISCOVERY XT	Automation of IHC
LCS	Roche	5264839001
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM340E	Cutting of the tissues including in blocks
Mounting Medium Pertex	Histolab	00801-FR
PAP Pen for immunostaining	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Paraffin Wax tek III, 4 x 2, 5 kg	Sakura	4511
Pasteur Disposable Pipettes	Fisher Scientific	12583237
PBS Buffer 10x, 100 mL	MMF	F/T0020
Reaction Buffer 10x	Roche	5353955001
Ribo Wash 10x	Roche	5266262001
RiboCC1	Roche	5266297001
Secondary antibody anti-mouse	Abcam	ab133469
Secondary antibody OmniMap anti-rabbit HRP	Roche	760-4311
Tissue Embedding center	MMF	EC 350
Xylene (mixture of isomers) ≥98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 L	VWR	28975.360
Zeiss Axio Imager M2 microscope			upright bright-field microscope