ميكانيكا شبكات الأكتوميوسين المرنة (البورية) الانقباضية كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي

Summary

في هذا العمل ، تم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لدراسة المرونة المسامية لجل الأكتوميوسين في ظل ظروف خاضعة للرقابة. يتم تحديد ديناميكيات هلام actomyosin والمذيب المضمن ، والتي من خلالها يتم إثبات مرونة الشبكة المسامية. نناقش أيضا التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهميتها لميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

Abstract

يمكن للخلايا تغيير أشكالها بنشاط وتصبح متحركة ، وهي خاصية تعتمد على قدرتها على إعادة تنظيم بنيتها الداخلية بنشاط. تعزى هذه الميزة إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي الخلوي ، ولا سيما الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، ومحركات الميوسين ، والبروتينات الملحقة التي تظهر خصائص الانكماش الجوهري. الرأي المقبول عادة هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجة مرنة. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النموذج دائما تفسير النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع صورة تصف الهيكل الخلوي بأنه مادة نشطة مرنة مسامية - شبكة مرنة مدمجة مع العصارة الخلوية. تدفع تدرجات الانقباض الناتجة عن محركات الميوسين تدفق السيتوسول عبر مسام الجل ، مما يشير إلى أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مرتبطة بإحكام. تتمثل إحدى السمات الرئيسية لمرونة المسام في الاسترخاء المنتشر للضغوط في الشبكة ، والتي تتميز بثابت انتشار فعال يعتمد على معامل مرونة الهلام ، والمسامية ، ولزوجة السيتوسول (المذيبات). نظرا لأن الخلايا لديها العديد من الطرق لتنظيم بنيتها وخواص المواد ، فإن فهمنا الحالي لكيفية اقتران ميكانيكا الهيكل الخلوي وديناميكيات تدفق السيتوسول لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. هنا ، يتم استخدام نهج إعادة التكوين في المختبر لتوصيف الخصائص المادية لجل actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي. الانكماش الهلامي مدفوع بانقباض محرك الميوسين ، مما يؤدي إلى ظهور تدفق المذيب المخترق. تصف الورقة كيفية تحضير هذه المواد الهلامية وإجراء التجارب. نناقش أيضا كيفية قياس وتحليل تدفق المذيبات وتقلص الهلام على المستويين المحلي والعالمي. يتم إعطاء علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة ، بما في ذلك صلتها بميكانيكا الهيكل الخلوي الخلوي.

Introduction

الخلايا الحية لها خصائص ميكانيكية فريدة. إلى جانب القدرة على الاستجابة السلبية للقوى المطبقة ، فهي أيضا قادرة على توليد القوى بنشاط استجابة للمنبهات الخارجية¹. تعزى هذه الخصائص ، الضرورية لمجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، لا سيما أثناء حركة الخلية ، في المقام الأول إلى الخصائص الميكانيكية والديناميكية للهيكل الخلوي للخلية ، وخاصة الهيكل الخلوي actomyosin ، وهو هلام نشط من خيوط الأكتين القطبية ، والمحركات الجزيئية للميوسين ، والبروتينات الملحقة. تظهر شبكات الأكتوميوسين هذه خصائص ذاتية التنظيم والانكماش الجوهرية مدفوعة ببروتينات الميوسين الحركية ، والتي تربط خيوط الأكتين وتولد بنشاط ضغوطا ميكانيكية في الشبكة التي يغذيها التحلل المائي ATP².

أجريت العديد من الدراسات التجريبية والنظرية لدراسة الخصائص المادية للهيكل الخلوي³. الرأي المقبول عموما هو أن الهيكل الخلوي يتصرف كمادة لزجة^{مرنة 4}. هذا يعني أنه على نطاقات زمنية قصيرة ، يتصرف الهيكل الخلوي كمادة مرنة ، وعلى فترات زمنية طويلة ، يتصرف كسائل لزج بسبب البروتينات المتشابكة وانفصال محرك الميوسين (وإعادة الارتباط) ، مما يسمح للشبكة بالدوران ديناميكيا. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، لا يمكن للنموذج اللزج المرن وصف النتائج التجريبية ، والتي تكون أكثر اتساقا مع الصورة التي تصف الهيكل الخلوي ، وبشكل عام ، سيتوبلازم الخلية الذي يوصف بأنه مادة فعالة مسامية^{مرنة 5,6}. ميزتان رئيسيتان تميزان هذه الأنواع من المواد. (ط) السمة الرئيسية الأولى هي توليد تدفق السيتوسول المخترق ("المذيب") عبر مسام الهلام عن طريق تدرجات انقباضية مدفوعة بمحركات الميوسين ، والتي تكمن وراء عمليات مثل تفجير الخلية⁷ ، والحركة⁸ ، وتذبذبات شكل الخلية⁹. يمكن أن يكون ظهور مثل هذه التدفقات الخلوية محليا ، أو للنفخ ، أو عالميا ، كما هو الحال في حركة الخلية. في الحالة الأخيرة ، تدفع الضغوط المطبقة بالانقباض في مؤخرة الخلية تدفق السائل الخلوي نحو مقدمة الخلية ، والتي تغذي تجمع البروتين اللازم لتجميع الصفيحة⁸. (ii) الميزة الرئيسية الثانية هي أن استرخاء الإجهادات منتشر ويتميز بثابت انتشار فعال ، والذي يعتمد على معامل مرونة الهلام ، ومسامية الهلام ، ولزوجة المذيب⁵. يحدد ثابت الانتشار المسامي المرن مدى سرعة استجابة النظام للإجهاد المطبق. تتوافق ثوابت الانتشار الأعلى مع إعادة توزيع الإجهاد بشكل أسرع. وهذا بدوره يحدد المدة التي يستغرقها السائل الخلوي داخل الخلايا لإعادة توزيعه داخل الخلية بعد الضغط الميكانيكي المطبق، سواء كان خارجيا أو داخليا، مثل الضغوط الانقباضية النشطة الناتجة عن محركات الميوسين. وبالتالي ، توضح هذه الأمثلة أن ميكانيكا الهيكل الخلوي والسيتوسول مقترنة بإحكام ولا يمكن معالجتها بشكل منفصل³.

نظرا لأن الخلايا يمكنها تنظيم خواصها الميكانيكية بعدة طرق ، فإن التفاعل بين ميكانيكا الشبكة وديناميكيات تدفق السوائل لا يزال غير مفهوم بشكل جيد. يتمثل النهج البديل القوي في استخدام الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تسمح بالتحكم الكامل في المكونات المجهرية المختلفة ومعلمات النظام ، مما يجعل هذه الأنظمة النموذجية مثالية للتحليل المادي^10,11. تم استخدام هذا النهج بنجاح لدراسة تأثير تركيب البروتين وهندسة النظام على الحركة القائمة على الأكتين 12،13،14،¹⁵،16،17،18 ، والنمط ثنائي الأبعاد لشبكات الأكتوميوسين ¹⁹،²⁰،^21،22، والتفاعل بين انقباض الشبكة وديناميات تدفق السوائل لجل الأكتوميوسين المرن ، وهو محور هذه الورقة²³.

في هذه المخطوطة ، تمت مناقشة إعداد شبكات الأكتوميوسين المرنة المقلصة ذات الأبعاد التي يمكن التحكم فيها وخصائص المواد بناء على عمل Ideses et ^al.23. يتم تحليل ديناميكيات الجل المتعاقد والمذيب المصفى وقياسها ، والتي من خلالها يتم إثبات أن هذه المواد الهلامية actomyosin يمكن وصفها بأنها مادة فعالة poroelastic. تؤكد دراسة تأثير لزوجة المذيبات على انتشار الإجهاد الطبيعة المسامية لهذه الشبكات. يتم توفير علاقات القياس المختلفة المستخدمة لقياس كمية البيانات. أخيرا ، تتم مناقشة التحديات التجريبية والمزالق الشائعة وأهمية النتائج التجريبية للهيكل الخلوي الخلوي.

Protocol

1. معالجة سطح الزجاج والتخميل:

ملاحظة: يتضمن هذا القسم ثلاث خطوات رئيسية (انظر الشكل 1): (i) التنظيف والتجفيف المائي ، (ii) silanization ، و (iii) التخميل السطحي.

1. التنظيف والتجفيد المائي
   1. استخدم محلول سمكة البيرانا لتنظيف الأسطح الزجاجية.
      ملاحظة: محلول سمكة البيرانا عبارة عن خليط من 30٪ H 2 O 2 و 70٪ H₂SO₄ (جدول المواد). هدفها الرئيسي هو إزالة الملوثات العضوية من أسطح الغطاء وفضح مجموعات OH على السطح الزجاجي. بهذه الطريقة ، يصبح السطح الزجاجي محبا للماء.
   2. ضع 10-12 # 1.5 (22 مم × 22 مم) أغطية زجاجية (جدول المواد) في حامل بولي تترافلورو إيثيلين محلي الصنع (مساحة القاعدة: 5.5 سم × 5.5 سم). انقل حامل البولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق سعة 400 مل (جدول المواد) ، واحتضانه ب 300 مل من محلول سمكة البيرانا لمدة 2 ساعة. قم بهذه الخطوة على الجليد وفي غطاء كيميائي.
      ملاحظة: يبلغ طول عمود البولي تترافلورو إيثيلين الملولب بقاعدة الحامل 12 سم ، وهو أطول من الدورق (11 سم) ، مما يسمح بالنقل / السحب الآمن للحامل من / إلى محلول سمكة البيرانا. نظرا لأن محلول سمكة البيرانا لا يزال شديد التفاعل وساخنا جدا ، فمن الضروري إيقاف التفاعل. أسهل طريقة لإيقاف التفاعل هي صب محلول سمكة البيرانا في ماء (صنبور) لتحقيق تخفيف 50x (على الأقل). يمكن بعد ذلك التخلص من المحلول بأمان. لا تحتفظ أبدا بمحلول سمكة البيرانا المستخدم في زجاجة زجاجية مغلقة - فقد ينتهي ذلك بانفجار زجاجة.
   3. انقل حامل البولي تترافلورو إيثيلين إلى دورق نظيف مملوء بالماء المقطر المزدوج الطازج (DDW) لغسل سمكة البيرانا الزائدة من أغطية الغطاء.
   4. انقل الدورق إلى حمام صوتنة (جدول المواد) ، وقم بصوتنة عند 80 هرتز بكامل طاقتها لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين مع DDW جديد. استخدم DDW جديدا في كل مرة.
2. التثليق
   1. انقل الحامل إلى دورق نظيف (400 مل) مملوء ب 300 مل من الميثانول النقي (جدول المواد) ثم إلى حمام صوتنة (جدول المواد). Sonicate عند 80 هرتز بكامل طاقتها لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
   2. بعد الصوتنة ، انقل الحامل إلى محلول silane محضر باستخدام 15 مل من DDW ، و 3.1 مل من حمض الأسيتيك (جدول المواد) ، و 340 مل من الميثانول ، و 7.6 مل من السيلان ((3-Mercaptopropyl) تريميثوكسيسيلان) (جدول المواد). أغلق الدورق بالبارافيلم ، واحتفظ به في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: يجب أن يتم تحضير محلول السيلان والتعامل معه في غطاء كيميائي. بعد خطوة silanization ، ضع محلول silane المستخدم (النفايات) في زجاجة زجاجية مخصصة داخل الغطاء الكيميائي.
   3. في اليوم التالي، انقل الحامل إلى كأس زجاجية نظيفة مملوءة ب 300 mL من الميثانول النقي لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، انقل الحامل إلى دورق نظيف ، وليس قبل تجفيف الجزء السفلي من حامل polytetrafluoroethylene لإزالة الميثانول الزائد. انقلي الدورق إلى الفرن (جدول المواد) لتجفيف أغطية الزجاج لمدة 5 دقائق على حرارة 120 درجة مئوية.
3. التخميل السطحي باستخدام بوليمر خامل
   1. تحقيق التخميل السطحي عن طريق احتضان أغطية الزجاج ببوليمر خامل (جدول المواد). لكل تجربة ، خذ اثنين من أغطية الغطاء وضعهما في طبق بتري مغطى بطبقة بارافيلم تم تنظيفها في البداية بالإيثانول (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (جدول المواد).
   2. احتضان كل غطاء مع 1 مل من 4 ملغ · مل ^{− 1} 5 كيلو دالتون الوزن الجزيئي ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول ماليميد (mPEG-mal ، M_w = 5 كيلو دالتون) (جدول المواد) في 1x محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) (جدول المواد) لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية.
      ملاحظة: يؤدي وضع أغطية الغطاء على طبقة بارافيلم كارهة للماء إلى حصر محلول بوليمر PEG المحب للماء على سطح الغطاء الزجاجي. وقت الحضانة أمر بالغ الأهمية لتحقيق التخميل الأمثل. استخدم أوقات الحضانة التي تتراوح بين 45 دقيقة و 2 ساعة. فوق وقت الحضانة هذا ، يمكن أن يتدهور سطح الغطاء الزجاجي ، مما يؤدي إلى التصاق البروتين وفقدان الشفافية.
   3. في نهاية عملية الحضانة ، شطف كل غطاء مع 5 مل من DDW ، وجفف مع تدفق N₂ (الغاز). لا تجفف أغطية الأغطية تحت الفراغ. نظرا لأنه يجب أن تبقى أغطية الغطاء مبللة بعد التخميل ، ضع على الفور 1 مل من 10 mM Tris على الأسطح pegylated. استخدم أغطية الغطاء في غضون 2 ساعة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات المختلفة في غرفة التدفق الصفحي لمنع تلوث سطح الزجاج.

2. تنقية البروتين

1. تنقية G-actin من مسحوق الأسيتون العضلي الهيكلي للأرنب باستخدام طريقة ترشيح الجل²⁴.
   1. تنقية الأكتين يستغرق 1 أسبوع. احتفظ ب G-actin المنقى في G-buffer (5 mM Tris pH 7.8 ، 0.01٪ NaN₃ ، 0.1 mM CaCl 2 ،_0.2 mM ATP ، و 1 mM DTT) ، وقم بتخزينه على الجليد. استخدام الحل في غضون 2 أسابيع.
      ملاحظة: استبدل الثلج كل يومين.
   2. قم بتسمية الأكتين بصبغة فلورية معدلة بالماليميد¹⁶ (جدول المواد). تنقية GST-fascin على أساس طريقة Ono et ^al.25. قم بتجميد كلا البروتينين في السائل N₂ ، وخزنه في -80 درجة مئوية.
2. استخدم بروتوكولا قياسيا لتنقية الميوسين II من العضلات الهيكلية للأرنب²⁶. يشتمل مخزن الميوسين II المنقى (dimers) على 10 mM Tris pH 7.4 و 0.5 M KCl و 35٪ w / v السكروز. قم بتجميد الميوسين في السائل N₂ ، واحفظه في -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: يحافظ التركيز العالي ل KCl على محركات الميوسين في شكل ثنائي ، بينما تضمن النسبة العالية من السكروز عدم إعاقة نشاط المحركات عند التجميد. استخدم ماصة مخصصة لمعالجة السوائل اللزجة عند العمل مع محاليل مخزون الميوسين II (جدول المواد).
   1. قم بتسمية dimers myosin II بصبغة فلورية (جدول المواد) في أزواج من بقايا السيستين المهندسة^19,27. استخدم قوانص الدجاج RLC الطافرة A لهذا الغرض²⁶. قم بتجميد الميوسين II المسمى في السائل N₂ ، وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يضمن إجراء وضع العلامات هذا أن الميوسين المسمى نشط كبروتين الميوسين II الأصلي.
3. استخدم مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية (جدول المواد) لقياس امتصاص محاليل بروتين المخزون ، واستنتاج تركيزات البروتين باستخدام قانون بير لامبرت باستخدام معاملات الانقراض التالية: G-actin (ε₂₉₀ = 26,460 M−1 · cm−1) ، GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1 · cm−1) ، الميوسين II dimer (ε_{280 = 268,800} M−1 · cm⁻¹) ، و RLC الطافر A (ε₂₈₀ = 3,960 M⁻¹ · سم ^{− 1) 19}.

3. إعداد عينة

ملاحظة: بلمرة مونومرات الأكتين في وجود مجاميع كبيرة من محركات الميوسين II و fascin المتشابك السلبي القوي لإنتاج شبكات أكتوميوسين مرنة مقلصة مجهريا^19,23. تسمح إضافة حبات الفلورسنت إلى المحلول بتتبع تدفق المذيبات أثناء تقلص الهلام.

1. محلول البروتين ("أكتوميوسين")
   1. باستثناء G-actin ، احتفظ بالبروتينات عند -80 درجة مئوية في قسومات صغيرة ، وقم بإذابتها عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. الحجم الكلي لمحلول الأكتوميوسين هو 40 ميكرولتر.
   2. تحضير المحلول عن طريق خلط 10 mM Tris pH 7.4 ، 2 mM MgCl₂ ، 25 mM KCl ، 1 mM ATP ، نظام تجديد ATP (0.5 mg · mL −1 الكرياتين كيناز و 5 mM فوسفات الكرياتين) ، 200 μM EGTA (مخلبات Ca²⁺ أيونات) ، محلول مضاد للتبييض (0.1 مجم · مل −1 أوكسيديز الجلوكوز ، 0.018 مجم · مل −1 كاتلاز ، و 5 مجم · مل ⁻¹ جلوكوز) ، 5 ميكرومتر G-actin ، 280 نانومتر GST-fascin ، و 1.67 نانومتر ميوسين II. النسبة المئوية لل G-actin المسمى هي 5٪ (النسبة المولية).
      ملاحظة: استخدم نسبة منخفضة من G-actin المسمى لتجنب تشبع إشارة الفلورسنت في المراحل المتقدمة من تقلص الهلام.
2. تحضير الركام الحركي للميوسين II
   1. أضف محركات الميوسين إلى محلول البروتين في صورة مجاميع. لتكوين مجاميع الميوسين الكبيرة (150 ميوسين دايمرات / ركم) ، قم بتخفيف محلول مخزون الميوسين ب 10 mM Tris pH 7.4 للوصول إلى تركيز نهائي قدره 25 mM KCl.
   2. احتفظ بمحلول الميوسين المخفف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم انقله إلى الثلج حتى الاستخدام. المحركات نشطة بالكامل لمدة تصل إلى 2 ساعة.
3. قياس تدفق المذيبات
   1. لتتبع تدفق المذيب عبر مسام الجل ، أضف حبات الفلورسنت إلى محلول الأكتوميوسين. تقليل التفاعل بين الخرز وشبكة الأكتوميوسين عن طريق تخميل الخرزات. عمليا ، احتضان 1 ميكرولتر من الخرز (جدول المواد) مع 5 ميكرومتر G-actin لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم قم بإزالة G-actin الزائد عن طريق الطرد المركزي (جدول المواد) (الشروط: 6000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية).
   2. كرر هذه الخطوة مع 10 ملغ · مل ^{− 1} ألبومين مصل البقر (BSA) (جدول المواد) لمنع (ربما) السطح غير المطلي المتبقي. استخدم الخرزات بتخفيف نهائي قدره 1: 10,000 مجلد / مجلد في التجارب.
      ملاحظة: من المهم تكييف قطر الخرز مع حجم مسام الجل بحيث تكون نسبة حجم الخرزة / المسام <1 في جميع المراحل.
4. تأثير لزوجة المحلول
   1. تحكم في لزوجة المحلول بإضافة الجلسرين (جدول المواد) إلى محلول الأكتوميوسين. تؤدي إضافة الجلسرين بنسبة وزن تتراوح من 0٪ إلى 34٪ إلى زيادة مقابلة في لزوجة المحلول من η ω إلى 2.76 η ω ، حيث η _ω هي لزوجة الماء عند 20 درجة مئوية²⁸.
      ملاحظة: من الضروري استخدام ماصة مخصصة لمعالجة السوائل اللزجة عند العمل مع الجلسرين (جدول المواد).

4. تشغيل تجربة

1. التعامل مع حامل عينة محلية الصنع
   1. خذ إحدى قسائم الغطاء المخملة ب PEG ، وضع فاصل بارافيلم مدهون فوقها ، وضعها في حامل العينة.
      ملاحظة: يمكن للمرء استبدال فاصل parafilm مع أي فاصل.
2. تحضير محلول أكتوميوسين
   1. تحضير محلول الأكتوميوسين على الجليد في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق دمج المكونات المجهرية المختلفة ، وإضافة مجاميع محرك الميوسين II ، وإضافة EGTA أخيرا. خلط الحل جيدا. تؤدي إضافة EGTA إلى بدء بلمرة شبكة الأكتوميوسين ، والتي تحدد وقت بدء التجربة.
3. ضع 1.1 ميكرولتر من هذا المحلول على شريحة الغطاء المثبتة على الحامل ، وضع غطاء الغطاء الثاني في الأعلى. المسمار حامل لختم العينة. تضغط هذه العملية قليلا على القطرة ، والتي تعتمد شكلا يشبه القرص. تتراوح أقطار السقوط بين 2800-3000 ميكرومتر.
4. ضع حامل العينة على المجهر ، وابدأ عملية الاستحواذ. تحضير المجهر مقدما لتقليل وقت الاستحواذ الأولي. عادة ما يستغرق 1-2 دقيقة بعد الخلط لبدء تصوير العينة.

5. تقنيات الفحص المجهري

1. قم بتصوير العينات باستخدام مجهر فلوري مقلوب (جدول المواد) يتم التحكم فيه بواسطة برنامج مخصص (جدول المواد).
   1. استخدم تكبيرات منخفضة تبلغ 2.5x / 0.075 Plan-NEOFLUAR (جدول المواد) لتصور منطقة الهلام بأكملها ومتابعة تقلصها العياني مع مرور الوقت.
   2. استخدم هدف 10x / 0.3 Ph1 UPlanFL (جدول المواد) لتوصيف مسامية الشبكة وهيكلها ومتابعة التنظيم الذاتي للشبكة وانكماشها مع مرور الوقت.
      ملاحظة: هذا الهدف مفيد أيضا لتوطين الركام الحركي للميوسين II داخل الشبكة ومتابعة حركة حبات الفلورسنت عبر مسام الهلام. يمكن استخدام التكبيرات الأعلى على حساب مجال رؤية منخفض ، وهو أكثر أهمية في وضع التصوير ثنائي اللون (جدول المواد).
2. قم بإثارة العينات عند 488 نانومتر (حبات الأكتين / الفلورسنت) و 561 نانومتر (مجاميع محرك الميوسين / حبات الفلورسنت). احصل على الصور بسرعة 100 مللي ثانية لكل إطار باستخدام برنامج مخصص (جدول المواد) في وضع البث باستخدام كاميرا جهاز مضاعفة الشحنة الإلكترونية (EMCCD) (جدول المواد).
   ملاحظة: يجب الحفاظ على شدة مصباح الفلورسنت (جدول المواد) عند أدنى قيمة ممكنة لتجنب تشبع الإشارة أثناء تقلص الشبكة.
3. تصوير متزامن بلونين
   1. استخدم هذا الوضع لغرضين: (i) الكشف عن توطين مجاميع محرك الميوسين داخل شبكة الأكتين ، و (i) توصيف تدفق المذيب الخارجي داخل وخارج أثناء تقلص الشبكة.
   2. قم بإثارة محركات الأكتين والميوسين II عند 488 نانومتر و 561 نانومتر ، على التوالي ، وسجل الصور في وقت واحد على كاميرا EMCCD (جدول المواد) باستخدام جهاز ثنائي الانبعاثات (جدول المواد). استخدم نفس نظام التصوير لتصوير جل الأكتين (488 نانومتر) وحبات الفلورسنت (561 نانومتر) في وقت واحد.

النتائج

يتم استخدام اثنين من أغطية الزجاج لكل تجربة. يتم تنظيف أغطية الزجاج وتخميلها باستخدام بوليمرات PEG. التخميل ضروري لمنع البروتينات القابلة للذوبان من الالتصاق بالأسطح الزجاجية في المراحل التجريبية المبكرة ولتقليل تفاعل شبكة التعاقد مع الجدران الزجاجية. يمكن أن يؤدي الفشل في تحقيق التخميل ...

Discussion

هنا ، يتم استخدام نهج في المختبر لتوصيف ميكانيكا المواد الهلامية actomyosin poroelastic كنظام نموذجي للهيكل الخلوي الخلوي ، وبشكل أعم ، من السيتوبلازم الخلوي ، الذي ثبت أنه يتصرف كمادة مسامية^{مرنة 3,5}. تتميز ريولوجيا الهيكل الخلوي الخلوي (السيتوبلازم) بثابت انتشا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)