La meccanica delle reti di actiosina contrattile (poro-)elastica come sistema modello del citoscheletro cellulare

Riepilogo

In questo lavoro, un approccio di ricostituzione in vitro è impiegato per studiare la poroelasticità dei gel di actomiosina in condizioni controllate. Viene quantificata la dinamica del gel di actomiosina e del solvente incorporato, attraverso la quale viene dimostrata la poroelasticità della rete. Discutiamo anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.

Abstract

Le cellule possono cambiare attivamente le loro forme e diventare mobili, una proprietà che dipende dalla loro capacità di riorganizzare attivamente la loro struttura interna. Questa caratteristica è attribuita alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori di miosina e proteine accessorie che presentano proprietà di contrazione intrinseca. La visione solitamente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico. Tuttavia, questo modello non può sempre spiegare i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un'immagine che descrive il citoscheletro come un materiale attivo poroelastico, una rete elastica incorporata con citosol. I gradienti di contrattilità generati dai motori della miosina guidano il flusso del citosol attraverso i pori del gel, che deduce che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati. Una caratteristica principale della poroelasticità è il rilassamento diffusivo delle tensioni nella rete, caratterizzato da un'efficace costante di diffusione che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità e dalla viscosità del citosol (solvente). Poiché le cellule hanno molti modi per regolare la loro struttura e le proprietà dei materiali, la nostra attuale comprensione di come la meccanica del citoscheletro e la dinamica del flusso del citosol sono accoppiate rimane poco compresa. Qui, un approccio di ricostituzione in vitro viene impiegato per caratterizzare le proprietà materiali dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello per il citoscheletro cellulare. La contrazione del gel è guidata dalla contrattilità motoria della miosina, che porta all'emergere di un flusso del solvente penetrante. Il documento descrive come preparare questi gel ed eseguire esperimenti. Discutiamo anche di come misurare e analizzare il flusso di solvente e la contrazione del gel sia su scala locale che globale. Vengono fornite le varie relazioni di scala utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse le sfide sperimentali e le insidie comuni, inclusa la loro rilevanza per la meccanica del citoscheletro cellulare.

Introduzione

Le cellule viventi hanno proprietà meccaniche uniche. Oltre alla capacità di reagire passivamente alle forze applicate, sono anche in grado di generare attivamente forze in risposta a stimoli esterni¹. Queste caratteristiche, che sono essenziali per una varietà di processi cellulari, in particolare durante la motilità cellulare, sono principalmente attribuite alle proprietà meccaniche e dinamiche del citoscheletro cellulare, in particolare il citoscheletro di actomiosina, che è un gel attivo di filamenti di actina polare, motori molecolari della miosina e proteine accessorie. Queste reti di actomiosina mostrano proprietà intrinseche di auto-organizzazione e contrazione guidate dalle proteine motorie della miosina, che reticolano i filamenti di actina e generano attivamente stress meccanici nella rete alimentata dall'idrolisi ATP².

Numerosi studi sperimentali e teorici sono stati condotti per studiare le proprietà materiali del citoscheletro³. L'opinione comunemente accettata è che il citoscheletro si comporta come un materiale viscoelastico⁴. Ciò significa che su brevi scale temporali, il citoscheletro si comporta come un materiale elastico e, su lunghe scale temporali, si comporta come un fluido viscoso a causa delle proteine reticolanti e del distacco motorio della miosina (e del riattaccamento), che consente alla rete di ruotare dinamicamente. In molte situazioni, tuttavia, il modello viscoelastico non può descrivere i risultati sperimentali, che sono più coerenti con un quadro che descrive il citoscheletro e, più in generale, il citoplasma cellulare descritto come un materiale attivo poroelastico ^5,6. Due caratteristiche principali caratterizzano questi tipi di materiali. (i) La prima caratteristica principale è la generazione di un flusso del citosol penetrante (il "solvente") attraverso i pori del gel da gradienti di contrattilità guidati dai motori della miosina, che sono alla base di processi come il blebbing cellulare⁷, la motilità⁸ e le oscillazioni della forma cellulare⁹. L'emergere di tali flussi citosolici può essere locale, per il blebbing, o globale, come nella motilità cellulare. In quest'ultimo caso, le sollecitazioni contrattili applicate nella parte posteriore della cellula guidano il flusso del liquido citosolico verso il fronte cellulare, che reintegra il pool proteico necessario per l'assemblaggio dei lamellipodi⁸. (ii) La seconda caratteristica principale è che il rilassamento delle sollecitazioni è diffusivo ed è caratterizzato da una costante di diffusione efficace, che dipende dal modulo elastico del gel, dalla porosità del gel e dalla viscosità del solvente⁵. La costante di diffusione poroelastica determina la velocità con cui il sistema risponde a una sollecitazione applicata. Costanti di diffusione più elevate corrispondono a una più rapida ridistribuzione dello stress. Questo, a sua volta, determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracellulare a essere ridistribuito all'interno della cellula a seguito di stress meccanico applicato, sia esterno che interno, come le sollecitazioni contrattili attive generate dai motori della miosina. Questi esempi, quindi, dimostrano che la meccanica del citoscheletro e del citosol sono strettamente accoppiati e non possono essere trattati separatamente³.

Poiché le cellule possono regolare le loro proprietà meccaniche in vari modi, l'interazione tra meccanica della rete e dinamica del flusso dei fluidi rimane poco compresa. Un potente approccio alternativo è quello di utilizzare sistemi ricostituiti in vitro che consentono il pieno controllo dei vari costituenti microscopici e dei parametri del sistema, il che rende questi sistemi modello ottimali per l'analisi fisica^10,11. Questo approccio è stato impiegato con successo per studiare l'impatto della composizione proteica e della geometria del sistema sulla motilità basata sull'actina 12,13,14,15,16,17,18, il pattern 2D delle reti di actomiosina ^19,20,21,22, e l'interazione tra contrattilità della rete e fluidodinamica dei gel di actomiosina poroelastici, che è al centro del presente articolo²³.

In questo manoscritto, la preparazione di reti di actomiosina elastica contrattile di dimensioni controllabili e proprietà del materiale è discussa sulla base del lavoro di Ideses et ^al.23. Viene analizzata e quantificata la dinamica del gel contante e del solvente drenato, attraverso la quale viene dimostrato che questi gel di actomiosina possono essere descritti come un materiale attivo poroelastico. Lo studio dell'effetto della viscosità del solvente sulla diffusività dello stress conferma ulteriormente la natura poroelastica di queste reti. Vengono fornite le varie relazioni di ridimensionamento utilizzate per la quantificazione dei dati. Infine, vengono discusse anche le sfide sperimentali, le insidie comuni e la rilevanza dei risultati sperimentali per il citoscheletro cellulare.

Protocollo

1. Trattamento superficiale del vetro e passivazione:

NOTA: Questa sezione include tre fasi principali (vedere la Figura 1): (i) pulizia e idrofilizzazione, (ii) silanizzazione e (iii) passivazione superficiale.

1. Pulizia e idrofilizzazione
   1. Utilizzare la soluzione Piranha per la pulizia della superficie del vetro.
      NOTA: La soluzione di Piranha è una miscela di 30% H 2 O 2 e 70% H₂SO₄ (Tabella dei materiali). Il suo obiettivo principale è quello di rimuovere le contaminazioni organiche dalle superfici di copertura ed esporre i gruppi OH sulla superficie del vetro. In questo modo, la superficie del vetro diventa idrofila.
   2. Posizionare 10-12 #1.5 (22 mm x 22 mm) vetrini di vetro (Table of Materials) in un supporto in politetrafluoroetilene fatto in casa (area di base: 5,5 cm x 5,5 cm). Trasferire il supporto in politetrafluoroetilene in un becher da 400 ml (tabella dei materiali) e incubarlo con 300 ml di soluzione di Piranha per 2 ore. Fai questo passaggio sul ghiaccio e in una cappa chimica.
      NOTA: Il palo in politetrafluoroetilene avvitato alla base del supporto è lungo 12 cm, più lungo del becher (11 cm), il che consente il trasferimento/estrazione sicuro del supporto da/verso la soluzione di Piranha. Poiché la soluzione di Piranha può ancora essere altamente reattiva e molto calda, è imperativo interrompere la reazione. Il modo più semplice per fermare la reazione è versare la soluzione di Piranha in acqua (di rubinetto) per ottenere una diluizione 50x (almeno). La soluzione può quindi essere scartata in modo sicuro. Non conservare mai la soluzione Piranha usata in una bottiglia di vetro chiusa - questo potrebbe finire in un'esplosione della bottiglia.
   3. Trasferire il supporto in politetrafluoroetilene in un becher pulito riempito con acqua fresca bidistillata (DDW) per lavare il Piranha in eccesso dai vetrini di copertura.
   4. Trasferire il becher in un bagno di sonicazione (Table of Materials) e sonicare a 80 Hz a piena potenza per 10 minuti a 25 °C. Ripeti questo passaggio altre due volte con DDW fresco. Usa DDW fresco in ogni momento.
2. Silanizzazione
   1. Trasferire il supporto in un becher pulito (400 ml) riempito con 300 ml di metanolo puro (Table of Materials) e quindi in un bagno di sonicazione (Table of Materials). Sonicare a 80 Hz a piena potenza per 30 minuti a 25 °C.
   2. Dopo la sonicazione, trasferire il supporto in una soluzione silana preparata utilizzando 15 ml di DDW, 3,1 ml di acido acetico (Tabella dei materiali), 340 ml di metanolo e 7,6 ml di silano ((3-Mercaptopropil) trimetossisilano) (Tabella dei materiali). Sigillare il becher con parafilm e conservarlo in frigorifero a 4 °C per una notte.
      NOTA: La preparazione e la manipolazione della soluzione silana devono essere eseguite in una cappa chimica. Dopo la fase di silanizzazione, mettere la soluzione silana usata (rifiuti) in una bottiglia di vetro dedicata all'interno della cappa chimica.
   3. Il giorno successivo, trasferire il supporto in un becher pulito riempito con 300 ml di metanolo puro per 15 s. Quindi, trasferire il supporto in un becher pulito, non prima di aver asciugato il fondo del supporto in politetrafluoroetilene per rimuovere il metanolo in eccesso. Trasferire il becher nel forno (Table of Materials) per asciugare i vetrini per 5 minuti a 120 °C.
3. Passivazione superficiale con un polimero inerte
   1. Ottenere la passivazione superficiale incubando i vetrini di copertura con un polimero inerte (Table of Materials). Per ogni esperimento, prendere due vetrini e metterli in una capsula di Petri rivestita con uno strato di parafilm inizialmente pulito con etanolo (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (Tabella dei materiali).
   2. Incubare ciascun foglietto di copertura con 1 mL di un 4 mg·mL⁻¹ 5 kDa peso molecolare metossipolietilenglicole maleimmide (mPEG-mal, M_w = 5 kDa) (Tabella dei materiali) in 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (Tabella dei materiali) per 1 ora a 22 °C.
      NOTA: il posizionamento dei vetrini su uno strato di parafilm idrofobo confina la soluzione polimerica di PEG idrofilo alla superficie del vetrino. Il tempo di incubazione è fondamentale per ottenere una passivazione ottimale. Utilizzare tempi di incubazione compresi tra 45 min e 2 h. Al di sopra di questo tempo di incubazione, la superficie dei vetrini di copertura può deteriorarsi, portando all'adesione delle proteine e alla perdita di trasparenza.
   3. Al termine del processo di incubazione, sciacquare ogni coprivetrino con 5 ml di DDW e asciugare con un flusso di N₂ (gas). Non asciugare i vetrini sotto vuoto. Poiché i vetrini devono essere tenuti bagnati dopo la passivazione, posizionare immediatamente 1 mL di 10 mM Tris sulle superfici pegilate. Utilizzare i coprivetrini entro 2 ore.
      NOTA: I vari passaggi devono essere eseguiti in una camera a flusso laminare per evitare la contaminazione della superficie del vetro.

2. Purificazione delle proteine

1. Purificare la G-actina dalla polvere di acetone del muscolo scheletrico di coniglio utilizzando il metodo di filtrazione del gel²⁴.
   1. La purificazione dell'actina richiede 1 settimana. Conservare la G-actina purificata in G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN₃, 0,1 mM CaCl 2,_0,2 mM ATP e 1 mM DTT) e conservarla su ghiaccio. Utilizzare la soluzione entro 2 settimane.
      NOTA: Sostituire il ghiaccio ogni due giorni.
   2. Etichettare l'actina con un colorante fluorescente modificato con maleimmide¹⁶ (Tabella dei materiali). Purificare la GST-fascina secondo il metodo di Ono et ^al.25. Flash-freeze di entrambe le proteine nel liquido N₂ e conservarle a -80 °C.
2. Utilizzare un protocollo standard per purificare la miosina II dal muscolo scheletrico del coniglio²⁶. Il tampone purificato per miosina II (dimeri) comprende 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl e 35% p/v di saccarosio. Congelare la miosina nel liquido N₂ e conservare a -80 °C.
   NOTA: L'alta concentrazione di KCl mantiene i motori della miosina in forma dimerica, mentre l'alta percentuale di saccarosio assicura che l'attività dei motori non sia ostacolata dal congelamento. Utilizzare una pipetta dedicata per la gestione dei fluidi viscosi quando si lavora con soluzioni madre di miosina II (Tabella dei materiali).
   1. Etichettare i dimeri di miosina II con un colorante fluorescente (Table of Materials) a coppie di residui di cisteina ingegnerizzati^19,27. Utilizzare un mutante RLC di ventriglio di pollo A a tale scopo²⁶. Congelare la miosina II marcata nel liquido N₂ e conservare a -80 °C.
      NOTA: Questa procedura di etichettatura assicura che la miosina marcata sia attiva come proteina nativa della miosina II.
3. Utilizzare uno spettrofotometro UV-Vis (Table of Materials) per misurare l'assorbanza delle soluzioni proteiche stock e dedurre le concentrazioni proteiche con la legge di Beer-Lambert utilizzando i seguenti coefficienti di estinzione: G-actina (ε₂₉₀ = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascina (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), dimero della miosina II (ε_{280 = 268.800} M−1·cm⁻¹), e il mutante RLC A (ε₂₈₀ = 3.960 M−1·cm⁻¹)¹⁹.

3. Preparazione del campione

NOTA: Polimerizzare i monomeri di actina in presenza di grandi aggregati di motori di miosina II e del forte reticolante passivo fascin per produrre reti di actomiosina elastiche macroscopicamente contrattili^19,23. L'aggiunta di sfere fluorescenti alla soluzione consente di tracciare il flusso di solvente durante la contrazione del gel.

1. Soluzione proteica ("actomyosin")
   1. Ad eccezione della G-actina, mantenere le proteine a -80°C in piccole aliquote e scongelarle a 37 °C prima dell'uso. Il volume totale della soluzione di actomiosina è di 40 μL.
   2. Preparare la soluzione miscelando 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 1 mM ATP, un sistema rigenerante ATP (0,5 mg·mL−1 creatinchinasi e 5 mM creatina fosfato), 200 μM EGTA (chelati ioni Ca²⁺), una soluzione anti-sbiancamento (0,1 mg·mL−1 glucosio ossidasi, 0,018 mg·mL−1 catalasi e 5 mg·mL⁻¹ glucosio), 5 μM di G-actina, 280 nM GST-fascina e 1,67 nM di miosina II. La percentuale di G-actina marcata è del 5% (percentuale molare).
      NOTA: Utilizzare una bassa percentuale di G-actina marcata per evitare la saturazione del segnale fluorescente nelle fasi avanzate della contrazione del gel.
2. Preparazione degli aggregati motori della miosina II
   1. Aggiungere i motori della miosina alla soluzione proteica sotto forma di aggregati. Per formare grandi aggregati di miosina (150 dimeri di miosina/aggregato), diluire la soluzione madre di miosina con 10 mM Tris pH 7,4 per raggiungere una concentrazione finale di 25 mM KCl.
   2. Mantenere la soluzione di miosina diluita per 10 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi trasferirla sul ghiaccio fino all'uso. I motori sono completamente attivi fino a 2 ore.
3. Misurazione del flusso di solvente
   1. Per monitorare il flusso di solvente attraverso i pori del gel, aggiungere le sfere fluorescenti alla soluzione di actomiosina. Ridurre l'interazione tra le perle e la rete di actomiosina passivando le perle. In pratica, incubare 1 μL di perline (Table of Materials) con 5 μM di G-actina per 20 minuti a RT, quindi rimuovere l'eccesso di G-actina mediante centrifugazione (Table of Materials) (condizioni: 6.000 x g per 5 min a 4 °C).
   2. Ripetere questo passaggio con 10 mg·mL⁻¹ di albumina sierica bovina (BSA) (tabella dei materiali) per bloccare (eventualmente) la superficie rimanente non rivestita. Utilizzare le perle ad una diluizione finale di 1:10.000 vol/vol negli esperimenti.
      NOTA: È importante adattare il diametro delle perle alla dimensione dei pori del gel in modo tale che il rapporto granulometria/poro sia <1 in tutte le fasi.
4. Effetto della viscosità della soluzione
   1. Controllare la viscosità della soluzione aggiungendo glicerolo (tabella dei materiali) alla soluzione di actomiosina. L'aggiunta di glicerolo in una percentuale di peso compresa tra 0% e 34% induce un corrispondente aumento della viscosità della soluzione da η ω a 2,76 η ω, dove η _ω è la viscosità dell'acqua a 20 °C²⁸.
      NOTA: È essenziale utilizzare una pipetta dedicata per la gestione dei fluidi viscosi quando si lavora con glicerolo (Table of Materials).

4. Esecuzione di un esperimento

1. Manipolazione del portacampioni fatta in casa
   1. Prendere uno dei vetrini di copertura passivati PEG, posizionare un distanziatore parafilm ingrassato sopra di esso e posizionarlo nel portacampioni.
      NOTA: È possibile sostituire il distanziatore del parafilm con qualsiasi distanziatore.
2. Preparazione della soluzione di actomiosina
   1. Preparare la soluzione di actomiosina su ghiaccio in una provetta da microcentrifuga incorporando i vari costituenti microscopici, aggiungendo gli aggregati motori della miosina II e aggiungendo EGTA per ultimo. Mescolare bene la soluzione. L'aggiunta di EGTA avvia la polimerizzazione della rete di actomomisina, che stabilisce l'ora di inizio dell'esperimento.
3. Mettere 1,1 μL di quella soluzione sul coprislip montato sul supporto e posizionare il secondo coprivetrino sulla parte superiore. Avvitare il supporto per sigillare il campione. Questo processo schiaccia leggermente la goccia, che adotta una forma simile a un disco. I diametri delle gocce variano tra 2.800-3.000 μm.
4. Posizionare il portacampioni sul microscopio e avviare l'acquisizione. Preparare il microscopio in anticipo per ridurre il tempo di acquisizione iniziale. In genere sono necessari 1-2 minuti dopo la miscelazione per avviare l'imaging del campione.

5. Tecniche di microscopia

1. Immagini dei campioni utilizzando un microscopio fluorescente invertito (Table of Materials) controllato da un software dedicato (Table of Materials).
   1. Utilizzare bassi ingrandimenti dell'obiettivo Plan-NEOFLUAR 2.5x/0.075 (Table of Materials) per visualizzare l'intera area del gel e seguire la sua contrazione macroscopica nel tempo.
   2. Utilizzare un obiettivo UPlanFL 10x/0.3 Ph1 (Table of Materials) per caratterizzare la porosità e la struttura della rete e per seguire l'auto-organizzazione e la contrazione della rete nel tempo.
      NOTA: Questo obiettivo è utile anche per localizzare gli aggregati motori della miosina II all'interno della rete e seguire il movimento delle sfere fluorescenti attraverso i pori del gel. Ingrandimenti più elevati possono essere utilizzati a scapito di un campo visivo ridotto, che è ancora più significativo nella modalità di imaging a due colori (Table of Materials).
2. Eccitare i campioni a 488 nm (actina / sfere fluorescenti) e 561 nm (aggregati motori di miosina / sfere fluorescenti). Acquisisci le immagini a 100 ms per fotogramma con software dedicato (Table of Materials) in modalità streaming con una telecamera EMCCD (Electron Multiplying Charge-coupled Device) (Table of Materials).
   NOTA: l'intensità della lampada fluorescente (Table of Materials) deve essere mantenuta al valore più basso possibile per evitare la saturazione del segnale durante la contrazione della rete.
3. Imaging simultaneo a due colori
   1. Utilizzare questa modalità per due scopi: (i) rilevare la localizzazione degli aggregati motori di miosina all'interno della rete di actina e (i) caratterizzare il flusso di solvente verso l'esterno all'interno e all'esterno durante la contrazione della rete.
   2. Eccitare i motori actina e miosina II rispettivamente a 488 nm e 561 nm e registrare le immagini simultaneamente su una telecamera EMCCD (Table of Materials) utilizzando un apparato a doppia emissione (Table of Materials). Utilizzare lo stesso sistema di imaging per visualizzare simultaneamente il gel di actina (488 nm) e le sfere fluorescenti (561 nm).

Risultati

Per esperimento vengono utilizzati due vetrini di vetro. I vetrini vengono puliti e passivati con polimeri PEG. La passivazione è essenziale per evitare che le proteine solubilizzate aderiscano alle superfici vetrate nelle prime fasi sperimentali e per minimizzare l'interazione della rete di contrazione con le pareti vetrate. L'incapacità di ottenere una buona passivazione può portare a una contrazione inefficiente e, in casi estremi, può persino inibire la formazione di reti di actina.

Discussione

Qui, un approccio in vitro è impiegato per caratterizzare la meccanica dei gel di actomiosina poroelastici come sistema modello del citoscheletro cellulare e, più in generale, del citoplasma cellulare, che ha dimostrato di comportarsi come un materiale poroelastico ^3,5. La reologia del citoscheletro cellulare (citoplasma) è stata caratterizzata da una costante di diffusione poroelastica, che determina quanto tempo impiega il fluido citosolico intracel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)