（poro-）弹性收缩肌动球蛋白网络作为细胞骨架模型系统的机制

摘要

本工作采用 体外 重构方法研究动粒肌肽凝胶在受控条件下的多孔弹性。量化了肌动球蛋白凝胶和包埋溶剂的动力学，通过这些动力学证明了网络多孔弹性。我们还讨论了实验挑战，常见陷阱以及与细胞骨架力学的相关性。

摘要

细胞可以主动改变它们的形状并变得运动，这一特性取决于它们主动重组其内部结构的能力。这一特征归因于细胞骨架的机械和动态特性，特别是肌动肌蛋白细胞骨架，它是极性肌动蛋白丝、肌球蛋白马达和辅助蛋白的活性凝胶，具有内在收缩特性。通常接受的观点是细胞骨架表现为粘弹性材料。然而，该模型不能总是解释实验结果，这些结果更符合将细胞骨架描述为多孔弹性活性材料 - 嵌入细胞质的弹性网络的图片。肌球蛋白马达产生的收缩梯度驱动细胞质在凝胶孔中的流动，这推断细胞骨架和细胞质的力学是紧密耦合的。多孔弹性的一个主要特征是网络中应力的扩散松弛，其特征在于有效扩散常数取决于凝胶弹性模量、孔隙率和细胞质（溶剂）粘度。由于细胞有许多方法来调节其结构和材料特性，我们目前对细胞骨架力学和细胞质流动动力学如何耦合的理解仍然知之甚少。在这里，采用 体外 重建方法来表征多孔弹性肌动球蛋白凝胶的材料特性，作为细胞骨架的模型系统。凝胶收缩由肌球蛋白运动收缩性驱动，这导致渗透溶剂流动的出现。本文描述了如何制备这些凝胶并进行实验。我们还讨论了如何在局部和全球范围内测量和分析溶剂流动和凝胶收缩。给出了用于数据量化的各种缩放关系。最后，讨论了实验挑战和常见陷阱，包括它们与细胞骨架力学的相关性。

引言

活细胞具有独特的机械性能。除了被动地对施加的力做出反应的能力外，它们还能够主动产生响应外部刺激的力¹。这些特征对于各种细胞过程（特别是在细胞运动期间）至关重要，主要归因于细胞骨架的机械和动态特性，尤其是肌动肌蛋白细胞骨架，它是极性肌动蛋白丝、肌球蛋白分子马达和辅助蛋白的活性凝胶。这些肌动蛋白网络表现出由肌球蛋白驱动的内在自组织和收缩特性，肌球蛋白运动蛋白交联肌动蛋白丝并在ATP水解2的推动下在网络中积极产生机械^应力。

已经进行了大量的实验和理论研究来研究细胞骨架^的材料性质3。普遍接受的观点是细胞骨架表现为粘弹性材料⁴。这意味着在短时间尺度上，细胞骨架表现为弹性材料，而在长时间尺度上，由于交联蛋白和肌球蛋白运动脱离（和重新附着），它表现为粘性流体，这允许网络动态周转。然而，在许多情况下，粘弹性模型无法描述实验结果，这更符合描述细胞骨架的图片，更一般地说，细胞质被描述为多孔弹性^{活性材料5,6}。这些类型的材料有两个主要特征。（i）第一个主要特征是通过肌球蛋白马达驱动的收缩梯度产生穿透性细胞质（"溶剂"）流过凝胶孔，这是细胞起泡⁷，运动^性8和细胞形状振荡9等过程^的基础。这种胞质流的出现可以是局部的，用于起泡，也可以是全球性的，如细胞运动。在后一种情况下，细胞后部施加的收缩应力驱动细胞溶质液流向细胞前部，从而补充板状^伪足组装所需的蛋白质库8。（ii）第二个主要特征是应力的松弛是扩散的，其特征在于有效扩散常数，这取决于凝胶弹性模量、凝胶孔隙率和溶剂粘度^5。多孔弹性扩散常数决定了系统对施加应力的响应速度。扩散常数越高，应力再分布越快。反过来，这决定了细胞内胞质液在施加机械应力（无论是外部还是内部）后在细胞内重新分布所需的时间，例如肌球蛋白马达产生的主动收缩应力。因此，这些例子表明，细胞骨架和细胞质的力学是紧密耦合的，不能分开处理³。

由于细胞可以通过多种方式调节其机械性能，因此网络力学和流体流动动力学之间的相互作用仍然知之甚少。一种强大的替代方法是使用体外重组系统，该系统允许完全控制各种微观成分和系统参数，这使得这些模型系统最适合物理分析^10,11。该方法已成功用于研究蛋白质组成和系统几何形状对基于肌动蛋白的运动的影响12,13,14,15,16,17,18，肌动肌蛋白网络的2D图案化^19,20,21,22，以及多孔弹性肌动球蛋白凝胶的网络收缩性和流体流动动力学之间的相互作用，这是本文的重点²³。

在本手稿中，基于Ideses等人的工作，讨论了可控尺寸和材料性质的收缩弹性肌动球蛋白网络的制备²³。分析和量化了收缩凝胶和排出溶剂的动力学，通过这些动力学肌肉蛋白凝胶可以描述为多孔弹性活性材料。研究溶剂粘度对应力扩散率的影响进一步证实了这些网络的多孔弹性性质。提供了用于数据量化的各种缩放关系。最后，讨论了实验挑战、常见陷阱以及实验结果与细胞骨架的相关性。

研究方案

1.玻璃表面处理及钝化:

注意:本节包括三个主要步骤（见 图1）:（i）清洁和亲水，（ii）硅烷化和（iii）表面钝化。

1. 清洗和亲水
   1. 使用食人鱼溶液清洁玻璃表面。
      注意:食人鱼溶液是30%H₂O 2和70%H₂ SO₄（材料表）的混合物。其主要目标是去除盖玻片表面的有机污染物，并暴露玻璃表面上的OH基团。以这种方式，玻璃表面变得亲水。
   2. 将 10-12 #1.5（22 mm x 22 mm）玻璃盖玻片（材料表）放入自制聚四氟乙烯支架（底座面积:5.5 cm x 5.5 cm）中。将聚四氟乙烯支架转移到400mL烧杯中（材料表），并与300mL食人鱼溶液孵育2小时。在冰上和化学罩中执行此步骤。
      注意:拧在支架底座上的聚四氟乙烯杆长 12 厘米，比烧杯长 （11 厘米），允许将支架安全地移入/拉出食人鱼溶液。由于食人鱼溶液仍然具有高反应性和非常热，因此必须停止反应。停止反应的最简单方法是将食人鱼溶液倒入（自来）水中，以达到（至少）50倍的稀释度。然后可以安全地丢弃溶液。切勿将用过的食人鱼溶液放在封闭的玻璃瓶中——这可能会以瓶子爆炸告终。
   3. 将聚四氟乙烯支架转移到装有新鲜双蒸水 （DDW） 的干净烧杯中，以从盖玻片上洗涤多余的食人鱼。
   4. 将烧杯转移到超声浴（材料表）中，并在25°C下以80Hz全功率超声处理10分钟。 使用新的 DDW 再重复此步骤两次。每次使用新鲜的 DDW。
2. 硅烷化
   1. 将支架转移到装有 300 mL 纯甲醇的干净烧杯 （400 mL） 中（材料表），然后放入超声浴（材料表）。在25°C下以全功率以80Hz超声处理30分钟。
   2. 超声处理后，将支架转移到使用 15 mL DDW、3.1 mL 乙酸（材料表）、340 mL 甲醇和 7.6 mL 硅烷（（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷）制备的硅烷溶液中（材料表）。用封口膜密封烧杯，并将其保存在冰箱中4°C过夜。
      注意:硅烷溶液的制备和处理必须在化学罩中进行。硅烷化步骤后，将用过的硅烷溶液（废物）放入化学罩内的专用玻璃瓶中。
   3. 第二天，将支架转移到装有300mL纯甲醇的干净烧杯中15秒。然后，将支架转移到干净的烧杯中，不要在干燥聚四氟乙烯支架底部以除去多余的甲醇。将烧杯转移到烤箱（材料表）中，在120°C下干燥玻璃盖玻片5分钟。
3. 使用惰性聚合物进行表面钝化
   1. 通过用惰性聚合物孵育玻璃盖玻片来实现表面钝化（材料表）。对于每个实验，取两个盖玻片并将它们放入涂有最初用乙醇（EtOH）（DDW / EtOH:30/70体积/体积）清洁的封口膜层的培养皿中（材料表）。
   2. 将每个盖玻片与 1 mL 的 4 mg·mL⁻¹ 5 kDa 分子量甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-mal，M _w = 5 kDa）（材料表）在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（材料表）中孵育 1 小时在 22 °C 下。
      注意:将盖玻片放在疏水封口膜层上会将亲水性PEG聚合物溶液限制在玻璃盖玻片表面。孵育时间对于实现最佳钝化至关重要。使用孵育时间在45分钟至2小时之间。超过此孵育时间，玻璃盖玻片表面会变质，导致蛋白质粘附和透明度损失。
   3. 在孵育过程结束时，用 5 mL DDW 冲洗每个盖玻片，并用 N₂ （气体）流干燥。不要在真空下干燥盖玻片。由于盖玻片在钝化后必须保持湿润，因此立即将 1 mL 的 10 mM Tris 放在聚乙二醇化表面上。在2小时内使用盖玻片。
      注意:各个步骤必须在层流室中进行，以防止玻璃表面污染。

2. 蛋白质纯化

1. 使用凝胶过滤方法²⁴从兔骨骼肌丙酮粉末中纯化G-肌动蛋白。
   1. 肌动蛋白纯化需要 1 周。将纯化的G-肌动蛋白保存在G缓冲液（5 mM Tris pH 7.8,0.01% NaN 3,0.1 mM CaCl 2,0.2 mM ATP和1 mM DTT）中，并将其储存在冰上。在 2 周内使用该解决方案。
      注意:每隔几天更换一次冰块。
   2. 用马来酰亚胺修饰的荧光染料¹⁶标记肌动蛋白（材料表）。根据小野等人的方法纯化GST-fascin25。在液体_{N 2}中快速冷冻两种蛋白质，并储存在-80°C。
2. 使用标准方案从兔骨骼肌中纯化肌球蛋白 II²⁶。纯化的肌球蛋白II（二聚体）储备缓冲液包括10 mM Tris pH 7.4、0.5 M KCl和35% w/v蔗糖。将肌球蛋白快速冷冻在液体N₂中，并储存在-80°C。
   注意:高浓度的KCl使肌球蛋白马达保持二聚体形式，而高百分比的蔗糖确保马达的活性在冷冻时不会受到阻碍。使用肌球蛋白II储备溶液时，使用专用移液器进行粘性流体处理（材料表）。
   1. 用荧光染料标记肌球蛋白II二聚体（材料表）在成对的工程半胱氨酸残基^19,27处。为此目的使用鸡胗RLC突变体A²⁶。将标记的肌球蛋白II在液体_{N 2}中快速冷冻，并储存在-80°C。
      注意:此标记程序可确保标记的肌球蛋白作为天然肌球蛋白II蛋白具有活性。
3. 使用紫外-可见分光光度计（材料表）测量原量蛋白质溶液的吸光度，并使用以下消光系数使用比尔-朗伯定律推断蛋白质浓度:G-肌动蛋白 （_{ε 290} = 26,460 M−1·cm−1）， GST-fascin （ε 280 = 99,330 M−1·cm−1）， 肌球蛋白 II 二聚体 （ε_{280 = 268,800} M−1·cm⁻¹）， 和 RLC 突变体 A （_{ε 280} = 3,960 M−1·cm⁻¹）¹⁹。

3. 样品制备

注意:在肌球蛋白II马达的大聚集体和强钝化交联剂法西斯存在下聚合肌动蛋白单体，以产生宏观收缩弹性肌动球蛋白网络^19,23。向溶液中添加荧光珠可以跟踪凝胶收缩期间的溶剂流动。

1. 蛋白质（"肌动肌激素"）溶液
   1. 除G-肌动蛋白外，将蛋白质以小等分试样保持在-80°C，并在使用前在37°C下解冻。肌动球蛋白溶液的总体积为 40 μL。
   2. 通过混合10 mM Tris pH 7.4,2 mM MgCl_2,25 mM KCl，1 mM ATP，ATP再生系统（0.5 mg·mL−1肌酸激酶和5 mM磷酸肌酸），200 μM EGTA（螯合物^{Ca 2+}离子），抗漂白溶液（0.1 mg·mL−1葡萄糖氧化酶，0.018 mg·mL−1过氧化氢酶和5 mg·mL⁻¹葡萄糖）制备溶液， 5 μM G-肌动蛋白、280 nM GST 筋膜和 1.67 nM 肌球蛋白 II。标记的G-肌动蛋白的百分比为5%（摩尔百分比）。
      注意:使用低百分比的标记G-肌动蛋白以避免凝胶收缩晚期荧光信号饱和。
2. 制备肌球蛋白II运动聚集体
   1. 将肌球蛋白马达以聚集体的形式添加到蛋白质溶液中。为了形成大的肌球蛋白聚集体（150 肌球蛋白二聚体/聚集体），用 10 mM Tris pH 7.4 稀释肌球蛋白储备溶液，以达到 25 mM KCl 的终浓度。
   2. 将稀释的肌球蛋白溶液在室温（RT）下保持10分钟，然后将其转移到冰上直至使用。电机完全启动长达 2 小时。
3. 测量溶剂流量
   1. 为了跟踪溶剂流过凝胶孔，将荧光珠添加到肌动球蛋白溶液中。通过钝化磁珠来减少磁珠与肌动肌肽网络之间的相互作用。实际上，将1μL珠子（材料表）与5μM G-肌动蛋白在室温下孵育20分钟，然后通过离心除去多余的G-肌动蛋白（材料表）（条件:6,000× g 在4°C下5分钟）。
   2. 用10 mg·mL⁻¹ 牛血清白蛋白（BSA）（材料表）重复此步骤，以阻止（可能）剩余的未涂层表面。在实验中使用最终稀释度为1:10,000体积/体积的磁珠。
      注意:重要的是使磁珠的直径适应凝胶孔径，以使磁珠/孔径比在所有阶段都为<1。
4. 溶液粘度的影响
   1. 通过在肌动肌蛋白溶液中添加甘油（材料表）来控制溶液的粘度。以0%至34%的重量百分比添加甘油可诱导溶液粘度从ηω相应增加到2.76 η_ω，其中η_ω是20°C时水的粘度²⁸。
      注意:在使用甘油时，必须使用专用移液器进行粘性流体处理（材料表）。

4. 运行实验

1. 自制样品架处理
   1. 取一个PEG钝化盖玻片，在其顶部放置涂有油脂的封口膜垫片，然后将其放入样品架中。
      注意:可以用任何垫片替换封口膜垫片。
2. 制备肌动肌肽溶液
   1. 通过掺入各种微观成分，加入肌球蛋白II运动聚集体，最后加入EGTA，在微量离心管中的冰上制备肌动球蛋白溶液。将溶液充分混合。EGTA的加入启动肌动球蛋白网络聚合，从而设定实验的开始时间。
3. 将该溶液的 1.1 μL 放在支架安装的盖玻片上，然后将第二张盖玻片放在顶部。拧紧支架以密封样品。这个过程稍微挤压液滴，采用圆盘状形状。液滴直径范围在 2,800-3,000 μm 之间。
4. 将样品架放在显微镜上，然后开始采集。提前准备显微镜以减少初始采集时间。混合后通常需要1-2分钟才能开始样品成像。

5. 显微镜技术

1. 使用由专用软件控制的倒置荧光显微镜（材料表）对样品进行成像（材料表）。
   1. 使用2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR物镜（材料表）的低放大倍率可视化整个凝胶区域，并随时间跟踪其宏观收缩。
   2. 使用10x/0.3 Ph1 UPlanFL物镜（材料表）表征网络孔隙度和结构，并跟踪网络自组织和随时间收缩。
      注意:该物镜也可用于定位网络中的肌球蛋白II运动聚集体，并跟踪荧光珠在凝胶孔中的运动。更高的放大倍率可以以缩小视场为代价，这在双色成像模式下更为重要（材料表）。
2. 在 488 nm（肌动蛋白/荧光珠）和 561 nm（肌球蛋白运动聚集体/荧光珠）激发样品。使用专用软件（材料表）在流模式下使用电子倍增电荷耦合器件 （EMCCD） 相机（材料表）以每帧 100 毫秒的速度采集图像。
   注意:荧光灯（材料表）强度应保持在尽可能低的值，以避免网络收缩期间信号饱和。
3. 同步双色成像
   1. 使用此模式有两个目的:（i）检测肌动蛋白网络内肌球蛋白运动聚集体的定位，以及（i）表征网络收缩期间内部和外部向外的溶剂流动。
   2. 分别在488nm和561nm处激发肌动蛋白和肌球蛋白II马达，并使用双发射设备（材料表）在EMCCD相机（材料表）上同时记录图像。使用相同的成像系统同时对肌动蛋白凝胶（488 nm）和荧光珠（561 nm）进行成像。

结果

每个实验使用两个玻璃盖玻片。玻璃盖玻片经过清洁并用PEG聚合物钝化。钝化对于防止溶解的蛋白质在早期实验阶段粘附在玻璃表面上以及最大限度地减少收缩网络与玻璃壁的相互作用至关重要。未能实现良好的钝化会导致低效收缩，在极端情况下，甚至会抑制肌动蛋白网络的形成。

图1描述了表面处理程序的三个主要步骤。这些步骤包括以下内容:（i?...

讨论

在这里，采用体外方法来表征多孔弹性肌动肌肽凝胶的力学，作为细胞骨架的模型系统，更一般地说，细胞质的模型系统，其已被证明表现为多孔弹性材料^3,5。细胞骨架（细胞质）的流变学特征在于多孔弹性扩散常数，该常数决定了细胞内胞质液在施加机械应力后在细胞内重新分布所需的时间。已经提出细胞使用这种机制来调节它们的形状

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)