細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

要約

この研究では、制御された条件下でのアクトミオシンゲルの多孔弾性を研究するために 、in vitro 再構成アプローチが採用されています。アクトミオシンゲルと包埋溶媒のダイナミクスが定量化され、それを通してネットワークの多孔弾性が実証されます。また、実験上の課題、一般的な落とし穴、および細胞骨格力学との関連性についても説明します。

要約

細胞は活発にその形状を変えて運動性になることができ、これはそれらの内部構造を活発に再編成する能力に依存する特性である。この特徴は、細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシンモーター、および固有の収縮特性を示すアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。通常受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料として振る舞うというものです。しかし、このモデルは、細胞骨格を多孔弾性活物質(細胞質ゾルが埋め込まれた弾性ネットワーク)として記述する図とより一致する実験結果を常に説明できるとは限らない。ミオシンモーターによって生成された収縮性勾配は、ゲル細孔を横切る細胞質ゾルの流れを駆動し、細胞骨格と細胞質ゾルの力学が密接に結合していることを推測します。多孔弾性の主な特徴の1つは、ゲル弾性率、多孔性、および細胞質ゾル(溶媒)粘度に依存する有効拡散定数によって特徴付けられる、ネットワーク内の応力の拡散緩和です。細胞はその構造と材料特性を調節する多くの方法を持っているため、細胞骨格力学と細胞質ゾルの流れのダイナミクスがどのように結合しているかについての現在の理解はよくわかっていません。ここでは、細胞細胞骨格のモデル系としての多孔弾性アクトミオシンゲルの材料特性を特徴付けるために、 in vitro 再構成アプローチが採用されています。ゲル収縮はミオシン運動収縮性によって駆動され、それは浸透溶媒の流れの出現をもたらす。この論文では、これらのゲルを調製し、実験を実行する方法について説明します。また、溶媒の流れとゲルの収縮をローカルスケールとグローバルスケールの両方で測定および分析する方法についても説明します。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が示されています。最後に、細胞骨格力学との関連性を含め、実験上の課題と一般的な落とし穴について説明します。

概要

生細胞は独特の機械的性質を持っています。加えられた力に受動的に反応する能力に加えて、それらはまた、外部刺激に応答して能動的に力を生成することができる¹。これらの特性は、特に細胞運動中のさまざまな細胞プロセスに不可欠であり、主に細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシン分子モーター、およびアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。これらのアクトミオシンネットワークは、アクチンフィラメントを架橋し、ATP加水分解によって燃料となるネットワークに機械的ストレスを積極的に生成するミオシンモータータンパク質によって駆動される固有の自己組織化および収縮特性を示します²。

細胞骨格の材料特性を研究するために、数多くの実験的および理論的研究が行われてきた³。一般に受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料⁴として振る舞うというものである。これは、短い時間スケールでは細胞骨格が弾性材料として振る舞い、長い時間スケールでは、架橋タンパク質とミオシンモーターの剥離(および再付着)により粘性流体として振る舞い、ネットワークが動的に回転することを可能にすることを意味します。しかし、多くの場合、粘弾性モデルは実験結果を記述できず、細胞骨格、より一般的に....

プロトコル

1.ガラス表面処理と不動態化:

注:このセクションには、(i)洗浄と親水化、(ii)シラン化、および(iii)表面不動態化の3つの主要なステップが含まれています( 図1を参照)。

1. 洗浄と親水化
   1. ガラス表面の洗浄にはピラニア溶液を使用してください。
      注:ピラニア溶液は、30%H 2 O 2と70%H₂SO₄の混合物です(材料表)。その主な目標は、カバーガラス表面から有機汚染を除去し、ガラス表面のOH基を露出させることです。このようにして、ガラス表面は親水性となる。
   2. 10-12 #1.5(22 mm x 22 mm)ガラスカバーガラスカバースリップ(材料表)を自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダー(ベース面積:5.5 cm x 5.5 cm)に入れます。ポリテトラフルオロエチレンホルダーを400 mLビーカー(材料表)に移し、300 mLのピラニア溶液で2時間インキュベートします。氷の上と化学フードでこのステップを行います。
      注意: ホルダーベースにねじ込まれたポリテトラフルオロエチレンポールの長さは12 cmで、ビーカー(11 cm)よりも長く、ピラニア溶液への....

結果

実験ごとに2枚のガラスカバースリップが使用されます。ガラスカバーガラスは、PEGポリマーで洗浄および不動態化されています。パッシベーションは、可溶化タンパク質が実験の初期段階でガラス表面に付着するのを防ぎ、収縮ネットワークとガラス壁との相互作用を最小限に抑えるために不可欠です。良好な不動態化を達成できないと、非効率的な収縮につながる可能性があり、極端な場.......

ディスカッション

ここでは、多孔弾性アクトミオシンゲルの力学を細胞骨格のモデル系として特徴付けるためにin vitroアプローチが採用されており、より一般的には、多孔^{弾性材料として}振る舞うことが示されている細胞質のモデルシステムとして^3,5。細胞骨格(細胞質)のレオロジーは、多孔弾性拡散定数によって特徴付けられており、これは、加えられた機?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)