細胞骨格のモデル系としての(ポロ)弾性収縮性アクトミオシンネットワークの機構

要約

この研究では、制御された条件下でのアクトミオシンゲルの多孔弾性を研究するために 、in vitro 再構成アプローチが採用されています。アクトミオシンゲルと包埋溶媒のダイナミクスが定量化され、それを通してネットワークの多孔弾性が実証されます。また、実験上の課題、一般的な落とし穴、および細胞骨格力学との関連性についても説明します。

要約

細胞は活発にその形状を変えて運動性になることができ、これはそれらの内部構造を活発に再編成する能力に依存する特性である。この特徴は、細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシンモーター、および固有の収縮特性を示すアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。通常受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料として振る舞うというものです。しかし、このモデルは、細胞骨格を多孔弾性活物質(細胞質ゾルが埋め込まれた弾性ネットワーク)として記述する図とより一致する実験結果を常に説明できるとは限らない。ミオシンモーターによって生成された収縮性勾配は、ゲル細孔を横切る細胞質ゾルの流れを駆動し、細胞骨格と細胞質ゾルの力学が密接に結合していることを推測します。多孔弾性の主な特徴の1つは、ゲル弾性率、多孔性、および細胞質ゾル(溶媒)粘度に依存する有効拡散定数によって特徴付けられる、ネットワーク内の応力の拡散緩和です。細胞はその構造と材料特性を調節する多くの方法を持っているため、細胞骨格力学と細胞質ゾルの流れのダイナミクスがどのように結合しているかについての現在の理解はよくわかっていません。ここでは、細胞細胞骨格のモデル系としての多孔弾性アクトミオシンゲルの材料特性を特徴付けるために、 in vitro 再構成アプローチが採用されています。ゲル収縮はミオシン運動収縮性によって駆動され、それは浸透溶媒の流れの出現をもたらす。この論文では、これらのゲルを調製し、実験を実行する方法について説明します。また、溶媒の流れとゲルの収縮をローカルスケールとグローバルスケールの両方で測定および分析する方法についても説明します。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が示されています。最後に、細胞骨格力学との関連性を含め、実験上の課題と一般的な落とし穴について説明します。

概要

生細胞は独特の機械的性質を持っています。加えられた力に受動的に反応する能力に加えて、それらはまた、外部刺激に応答して能動的に力を生成することができる¹。これらの特性は、特に細胞運動中のさまざまな細胞プロセスに不可欠であり、主に細胞骨格、特に極性アクチンフィラメント、ミオシン分子モーター、およびアクセサリータンパク質の活性ゲルであるアクトミオシン細胞骨格の機械的および動的特性に起因します。これらのアクトミオシンネットワークは、アクチンフィラメントを架橋し、ATP加水分解によって燃料となるネットワークに機械的ストレスを積極的に生成するミオシンモータータンパク質によって駆動される固有の自己組織化および収縮特性を示します²。

細胞骨格の材料特性を研究するために、数多くの実験的および理論的研究が行われてきた³。一般に受け入れられている見解は、細胞骨格が粘弾性材料⁴として振る舞うというものである。これは、短い時間スケールでは細胞骨格が弾性材料として振る舞い、長い時間スケールでは、架橋タンパク質とミオシンモーターの剥離(および再付着)により粘性流体として振る舞い、ネットワークが動的に回転することを可能にすることを意味します。しかし、多くの場合、粘弾性モデルは実験結果を記述できず、細胞骨格、より一般的には細胞質が多孔弾性活物質として記述されている図とより一致しています^5,6。2つの主な特徴がこれらのタイプの材料を特徴付ける。(i)第¹の主な特徴は、細胞ブレブ7、運動性⁸、細胞形状振動⁹などのプロセスの根底にあるミオシンモーターによって駆動される収縮性勾配によって、ゲル細孔を横切る浸透性細胞ゾル(「溶媒」)の流れの生成です。そのような細胞質流の出現は、ブレブのために局所的であり得るか、または細胞運動性のように局所的であり得る。後者の場合、細胞後部で加えられた収縮応力は、細胞前面に向かって細胞質液の流れを駆動し、それはラメリポディアアセンブリ⁸に必要なタンパク質プールを補充する。(ii)第²の主な特徴は、応力の緩和が拡散性であり、ゲル弾性率、ゲル多孔度、および溶媒粘度に依存する実効拡散定数によって特徴付けられることです5。多孔弾性拡散定数は、加えられた応力に対するシステムの応答速度を決定します。拡散定数が高いほど、応力の再分布が速くなります。これにより、ミオシンモーターによって生成される活発な収縮ストレスなど、外部または内部に適用された機械的ストレスの後に、細胞内細胞質液が細胞内に再分配されるのにかかる時間が決まります。したがって、これらの例は、細胞骨格と細胞質ゾルの機構が緊密に結合しており、別々に扱うことができないことを示しています³。

細胞はさまざまな方法で機械的特性を調節できるため、ネットワーク力学と流体力学の相互作用はよくわかっていません。強力な代替アプローチは、さまざまな微視的成分とシステムパラメータの完全な制御を可能にするin vitro再構成システムを使用することであり、これにより、これらのモデルシステムは物理分析に最適です^10,11。このアプローチは、アクチンベースの運動性に対するタンパク質組成とシステム形状の影響を研究するために首尾よく採用されています12、13、14、15、16、^17、18、アクトミオシンネットワークの2Dパターニング¹⁹、²⁰、^21、22、およびこの論文の焦点である多孔弾性アクトミオシンゲルのネットワーク収縮性と流体力学の間の相互作用²³。

この原稿では、制御可能な寸法と材料特性の収縮弾性アクトミオシンネットワークの調製について、Ideses et ^al.23の研究に基づいて議論されています。収縮ゲルと排出溶媒のダイナミクスが分析および定量化され、これらのアクトミオシンゲルが多孔弾性活物質として記述できることが実証されます。応力拡散性に対する溶媒粘度の影響を研究することで、これらのネットワークの多孔弾性特性がさらに確認されます。データの定量化に使用されるさまざまなスケーリング関係が提供されます。最後に、実験上の課題、一般的な落とし穴、および実験結果と細胞骨格との関連性についても説明します。

プロトコル

1.ガラス表面処理と不動態化:

注:このセクションには、(i)洗浄と親水化、(ii)シラン化、および(iii)表面不動態化の3つの主要なステップが含まれています( 図1を参照)。

1. 洗浄と親水化
   1. ガラス表面の洗浄にはピラニア溶液を使用してください。
      注:ピラニア溶液は、30%H 2 O 2と70%H₂SO₄の混合物です(材料表)。その主な目標は、カバーガラス表面から有機汚染を除去し、ガラス表面のOH基を露出させることです。このようにして、ガラス表面は親水性となる。
   2. 10-12 #1.5(22 mm x 22 mm)ガラスカバーガラスカバースリップ(材料表)を自家製のポリテトラフルオロエチレンホルダー(ベース面積:5.5 cm x 5.5 cm)に入れます。ポリテトラフルオロエチレンホルダーを400 mLビーカー(材料表)に移し、300 mLのピラニア溶液で2時間インキュベートします。氷の上と化学フードでこのステップを行います。
      注意: ホルダーベースにねじ込まれたポリテトラフルオロエチレンポールの長さは12 cmで、ビーカー(11 cm)よりも長く、ピラニア溶液へのホルダーの安全な移動/引き出しを可能にします。ピラニア溶液は依然として反応性が高く、非常に高温である可能性があるため、反応を停止することが不可欠です。反応を止める最も簡単な方法は、ピラニア溶液を(水道)水に注ぎ、(少なくとも)50倍に希釈することです。その後、溶液を安全に廃棄できます。使用済みのピラニア溶液を閉じたガラス瓶に入れないでください–これはボトルの爆発で終わる可能性があります。
   3. ポリテトラフルオロエチレンホルダーを新鮮な二重蒸留水(DDW)で満たされた清潔なビーカーに移して、カバーガラスから余分なピラニアを洗い流します。
   4. ビーカーを超音波処理浴(材料表)に移し、25°Cで10分間フルパワーで80Hzで超音波処理する。 新しいDDWでこの手順をさらに2回繰り返します。毎回新鮮な重水素水を使用してください。
2. シラン化
   1. ホルダーを300mLの純粋なメタノール(材料の表)で満たされたきれいなビーカー(400mL)に移し、次いで超音波処理浴(材料の表)に移す。25°Cで30分間フルパワーで80Hzで超音波処理する。
   2. 超音波処理後、15mLの重水素減少水、3.1mLの酢酸(材料表)、340mLのメタノール、および7.6mLのシラン(((3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン)を使用して調製したシラン溶液にホルダーを移す(材料表)。ビーカーをパラフィルムで密封し、4°Cの冷蔵庫で一晩保管します。
      注意: シラン溶液の調製と取り扱いは、化学薬品フード内で行う必要があります。シラン化工程後、使用済みのシラン溶液(廃液)を薬液フード内の専用ガラス瓶に入れます。
   3. 翌日、ホルダーを300 mLの純粋なメタノールで満たされた清潔なビーカーに15秒間移します。次いで、ホルダーを清潔なビーカーに移し、ポリテトラフルオロエチレンホルダーの底部を乾燥させる前ではなく、過剰のメタノールを除去した。ビーカーをオーブンに移し(材料表)、ガラスカバーガラスを120°Cで5分間乾燥させます。
3. 不活性ポリマーによる表面パッシベーション
   1. ガラスカバーガラスを不活性ポリマーでインキュベートすることにより、表面パッシベーションを実現します(材料表)。実験ごとに、2枚のカバーガラスを取り、最初にエタノール(EtOH)で洗浄したパラフィルム層でコーティングされたペトリ皿に入れます(重水素水腫/EtOH:30/70 vol / vol)(材料表)。
   2. 各カバーガラスを1 mLの4 mg·mL⁻¹ 5 kDa分子量メトキシポリエチレングリコールマレイミド(mPEG-mal、M_w = 5 kDa)(材料表)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(材料表)中で22°Cで1時間インキュベートします。
      注意: カバーガラスを疎水性パラフィルム層に置くと、親水性PEGポリマー溶液がガラスカバーガラス表面に閉じ込められます。インキュベーション時間は、最適なパッシベーションを達成するために重要です。45分から2時間の範囲のインキュベーション時間を使用してください。このインキュベーション時間を超えると、ガラスカバースリップの表面が劣化し、タンパク質の接着や透明性の低下につながる可能性があります。
   3. インキュベーションプロセスの最後に、各カバーガラスを5 mLの重水素減少水ですすぎ、N₂ (ガス)の流れで乾燥させます。カバーガラスを真空下で乾燥させないでください。パッシベーション後はカバーガラスを濡らしておく必要があるため、すぐに1 mLの10 mM Trisをペグ化表面に置きます。カバーガラスは2時間以内に使用してください。
      注意: ガラス表面の汚染を防ぐために、さまざまな手順を層流チャンバーで実行する必要があります。

2. タンパク質精製

1. ゲルろ過法²⁴を使用してウサギ骨格筋アセトン粉末からG-アクチンを精製する。
   1. アクチン精製には1週間かかります。精製した G-アクチンを G-バッファー (5 mM Tris pH 7.8, 0.01% NaN₃, 0.1 mM CaCl 2,_0.2 mM ATP, 1 mM DTT) に保存し、氷上で保存します。2週間以内にソリューションを使用してください。
      注意: 数日ごとに氷を交換してください。
   2. アクチンをマレイミド修飾蛍光色素¹⁶ で標識する(材料表)。GST-ファシンを小野らの方法に基づいて精製する²⁵。両方のタンパク質を液体N₂中で瞬間凍結し、−80°Cで保存する。
2. 標準プロトコールを使用して、ウサギ骨格筋からミオシンIIを精製する²⁶。精製されたミオシンII(ダイマー)ストックバッファーには、10 mM Tris pH 7.4、0.5 M KCl、および35% w/vスクロースが含まれています。ミオシンを液体_N2中で急速凍結し、−80°Cで保存する。
   注:高濃度のKClはミオシンモーターを二量体形態に保ち、スクロースの割合が高いため、凍結時にモーターの活動が妨げられないことを保証します。ミオシンIIストック溶液を扱う場合は、粘性流体の取り扱いに専用のピペットを使用してください(材料表)。
   1. ミオシンII二量体を蛍光色素で標識し(材料表)、操作されたシステイン残基のペアで^19,27。そのためにニワトリ砂嚢RLC変異体Aを使用する²⁶.標識したミオシンIIを液体_N2中で急速凍結し、−80°Cで保存する。
      注:この標識手順は、標識されたミオシンが天然のミオシンIIタンパク質として活性であることを保証します。
3. UV-Vis分光光度計(材料表)を使用してストックタンパク質溶液の吸光度を測定し、次の吸光係数を使用してBeer-Lambertの法則でタンパク質濃度を推定します:G-アクチン(ε₂₉₀ = 26,460 M-1・^cm-1)、GST^-ファシン(ε 280 = 99,330 M−1・cm−1)、ミオシンII二量体(ε_{280 = 268,800} M−1・cm⁻¹)、 RLC変異体A(ε₂₈₀ = 3,960 M−1・cm⁻¹)¹⁹。

3. サンプル調製

注:ミオシンIIモーターと強力な受動架橋剤ファシンの大きな凝集体の存在下でアクチンモノマーを重合して、巨視的に収縮する弾性アクトミオシンネットワーク^{を生成します19,23}。蛍光ビーズを溶液に添加することで、ゲル収縮中の溶媒の流れを追跡できます。

1. タンパク質(「アクトミオシン」)溶液
   1. G-アクチンを除き、少量のアリコートで-80°Cに保ち、37°Cで解凍してから使用してください。アクトミオシン溶液の総容量は40μLです。
   2. 10 mM Tris pH 7.4、2 mM MgCl₂、25 mM KCl、1 mM ATP、ATP再生系(0.5 mg·mL-1クレアチンキナーゼおよび5 mMクレアチンリン酸)、200 μM EGTA (キレート^Ca2+イオン)、漂白防止溶液(0.1 mg·^mL-1グルコースオキシダーゼ、0.018 mg·mL-1カタラーゼ、および5 mg·^mL-1グルコース)を混合して溶液を調製します。 5 μM G-アクチン、280 nM GSTファスチン、および1.67 nM ミオシンII。標識G-アクチンの割合は5%(モル百分率)である。
      注:ゲル収縮の進行段階での蛍光シグナルの飽和を避けるために、標識されたG-アクチンの割合を低くしてください。
2. ミオシンIIモーター凝集体の調製
   1. ミオシンモーターを凝集体の形でタンパク質溶液に加える。大きなミオシン凝集体(150ミオシン二量体/凝集体)を形成するには、ミオシンストック溶液を10 mM Tris pH 7.4で希釈して、最終濃度25 mM KClにします。
   2. 希釈したミオシン溶液を室温(RT)で10分間保持し、使用するまで氷に移します。モーターは最大2時間完全にアクティブです。
3. 溶媒流量の測定
   1. ゲル細孔を横切る溶媒の流れを追跡するには、蛍光ビーズをアクトミオシン溶液に加えます。ビーズを不動態化することにより、ビーズとアクトミオシンネットワークとの間の相互作用を減少させる。実際には、1 μLのビーズ(材料表)を5 μM G-アクチンとともにRTで20分間インキュベートした後、遠心分離(材料表)によって余分なG-アクチンを除去します(条件:6,000 x g 、4°Cで5分間)。
   2. 10 mg·mL⁻¹ ウシ血清アルブミン(BSA)(材料表)でこの手順を繰り返し、残りのコーティングされていない表面を(おそらく)ブロックします。実験では、1:10,000 vol/volの最終希釈でビーズを使用します。
      注:ビーズ/ポアサイズ比がすべての段階で<1になるように、ビーズの直径をゲルの細孔サイズに適合させることが重要です。
4. 溶液粘度の影響
   1. アクトミオシン溶液にグリセロール(材料表)を添加して溶液の粘度を制御します。0%〜34%の範囲の重量パーセントでグリセロールを添加すると、溶液粘度が η_ωから2.76 η_ωに上昇し、 ここでη_ωは20°Cでの水の粘度である²⁸。
      注意: グリセロールを扱う場合、粘性流体の取り扱いには専用のピペットを使用することが不可欠です(材料表)。

4. テストの実行

1. 自家製サンプルホルダーの取り扱い
   1. PEG不動態化カバースリップの1つを取り、その上にグリースを塗ったパラフィルムスペーサーを置き、サンプルホルダーに入れます。
      注意: パラフィルムスペーサーは任意のスペーサーと交換できます。
2. アクトミオシン溶液の調製
   1. さまざまな微視的成分を組み込み、ミオシンIIモーター凝集体を添加し、最後にEGTAを添加することにより、マイクロ遠心チューブ内の氷上でアクトミオシン溶液を調製します。溶液をよく混ぜる。EGTAの添加により、アクトミオシンネットワーク重合が開始され、実験の開始時間が設定されます。
3. その溶液1.1 μLをホルダーに取り付けられたカバーガラスに置き、2番目のカバーガラスを上に置きます。ホルダーをねじ込んでサンプルを密封します。このプロセスは、円盤状の形状を採用したドロップをわずかに絞ります。落下直径は2,800〜3,000μmの範囲です。
4. サンプルホルダーを顕微鏡に置き、取得を開始します。初期取得時間を短縮するために、事前に顕微鏡を準備してください。通常、混合後、サンプルイメージングを開始するのに1〜2分かかります。

5.顕微鏡技術

1. 専用ソフトウェア(材料表)で制御する倒立蛍光顕微鏡(材料表)を用いて試料を画像化します。
   1. 2.5倍/0.075倍の低倍率のPlan-NEOFLUAR対物レンズ(材料表)を使用して、ゲル領域全体を視覚化し、その巨視的な収縮を経時的に追跡します。
   2. 10x/0.3 Ph1 UPlanFL対物レンズ(材料表)を使用して、ネットワークの多孔性と構造を特徴付け、ネットワークの自己組織化と収縮を経時的に追跡します。
      注:この目的は、ネットワーク内のミオシンIIモーター凝集体を局在化し、ゲル細孔を横切る蛍光ビーズの動きを追跡するのにも役立ちます。より高い倍率を使用することができ、これは視野の減少を犠牲にして、デュアルカラーイメージングモードでさらに重要です(材料表)。
2. サンプルを488 nm(アクチン/蛍光ビーズ)および561 nm(ミオシンモーター凝集体/蛍光ビーズ)で励起します。電子増倍型電荷結合素子(EMCCD)カメラ(材料表)でストリーミングモードで専用ソフトウェア(材料表)で1フレームあたり100msの画像を取得します。
   注意: 蛍光灯(材料表)の強度は、ネットワークの収縮中の信号飽和を避けるために、可能な限り低い値に保つ必要があります。
3. 同時2色イメージング
   1. このモードは、(i)アクチンネットワーク内のミオシンモーター凝集体の局在を検出すること、および(i)ネットワーク収縮中の内外の外向きの溶媒の流れを特徴付けることの2つの目的で使用します。
   2. アクチンモーターとミオシンIIモーターをそれぞれ488 nmと561 nmで励起し、デュアルエミッション装置(材料表)を使用してEMCCDカメラ(材料表)に同時に画像を記録します。同じイメージングシステムを使用して、アクチンゲル(488 nm)と蛍光ビーズ(561 nm)を同時にイメージングします。

結果

実験ごとに2枚のガラスカバースリップが使用されます。ガラスカバーガラスは、PEGポリマーで洗浄および不動態化されています。パッシベーションは、可溶化タンパク質が実験の初期段階でガラス表面に付着するのを防ぎ、収縮ネットワークとガラス壁との相互作用を最小限に抑えるために不可欠です。良好な不動態化を達成できないと、非効率的な収縮につながる可能性があり、極端な場...

ディスカッション

ここでは、多孔弾性アクトミオシンゲルの力学を細胞骨格のモデル系として特徴付けるためにin vitroアプローチが採用されており、より一般的には、多孔^{弾性材料として}振る舞うことが示されている細胞質のモデルシステムとして^3,5。細胞骨格(細胞質)のレオロジーは、多孔弾性拡散定数によって特徴付けられており、これは、加えられた機?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)