La mécanique des réseaux d’actomyosine contractile (poro-)élastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire

Résumé

Dans ce travail, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour étudier la poroélasticité des gels d’actomyosine dans des conditions contrôlées. La dynamique du gel d’actomyosine et du solvant incorporé est quantifiée, grâce à laquelle la poroélasticité du réseau est démontrée. Nous discutons également des défis expérimentaux, des pièges courants et de la pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.

Résumé

Les cellules peuvent changer activement leurs formes et devenir mobiles, une propriété qui dépend de leur capacité à réorganiser activement leur structure interne. Cette caractéristique est attribuée aux propriétés mécaniques et dynamiques du cytosquelette cellulaire, notamment le cytosquelette d’actomyosine, qui est un gel actif de filaments d’actine polaire, de moteurs de myosine et de protéines accessoires qui présentent des propriétés de contraction intrinsèques. L’opinion généralement acceptée est que le cytosquelette se comporte comme un matériau viscoélastique. Cependant, ce modèle ne peut pas toujours expliquer les résultats expérimentaux, qui sont plus cohérents avec une image décrivant le cytosquelette comme une matière active poroélastique - un réseau élastique incorporé avec le cytosol. Les gradients de contractilité générés par les moteurs de myosine entraînent le flux du cytosol à travers les pores du gel, ce qui implique que la mécanique du cytosquelette et du cytosol est étroitement couplée. L’une des principales caractéristiques de la poroélasticité est la relaxation diffusive des contraintes dans le réseau, caractérisée par une constante de diffusion efficace qui dépend du module d’élasticité du gel, de la porosité et de la viscosité du cytosol (solvant). Comme les cellules ont de nombreuses façons de réguler leur structure et leurs propriétés matérielles, notre compréhension actuelle de la façon dont la mécanique du cytosquelette et la dynamique de l’écoulement du cytosol sont couplées reste mal comprise. Ici, une approche de reconstitution in vitro est utilisée pour caractériser les propriétés matérielles des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle pour le cytosquelette cellulaire. La contraction du gel est entraînée par la contractilité motrice de la myosine, ce qui conduit à l’émergence d’un écoulement du solvant pénétrant. L’article décrit comment préparer ces gels et mener des expériences. Nous discutons également de la façon de mesurer et d’analyser le flux de solvant et la contraction du gel à l’échelle locale et mondiale. Les différentes relations d’échelle utilisées pour la quantification des données sont données. Enfin, les défis expérimentaux et les pièges courants sont discutés, y compris leur pertinence pour la mécanique du cytosquelette cellulaire.

Introduction

Les cellules vivantes ont des propriétés mécaniques uniques. Outre la capacité de réagir passivement aux forces appliquées, ils sont également capables de générer activement des forces en réponse à des stimuli externes¹. Ces caractéristiques, essentielles pour une variété de processus cellulaires, notamment lors de la motilité cellulaire, sont principalement attribuées aux propriétés mécaniques et dynamiques du cytosquelette cellulaire, en particulier le cytosquelette d’actomyosine, qui est un gel actif de filaments d’actine polaire, de moteurs moléculaires de myosine et de protéines accessoires. Ces réseaux d’actomyosine présentent des propriétés intrinsèques d’auto-organisation et de contraction entraînées par les protéines motrices de la myosine, qui réticulent les filaments d’actine et génèrent activement des contraintes mécaniques dans le réseau alimentées par l’hydrolyse de l’ATP².

De nombreuses études expérimentales et théoriques ont été menées pour étudier les propriétés matérielles du cytosquelette³. L’opinion communément acceptée est que le cytosquelette se comporte comme un matériau viscoélastique⁴. Cela signifie que sur de courtes échelles de temps, le cytosquelette se comporte comme un matériau élastique, et sur de longues échelles de temps, il se comporte comme un fluide visqueux en raison des protéines de réticulation et du détachement moteur de la myosine (et du rattachement), ce qui permet au réseau de se renouveler dynamiquement. Dans de nombreuses situations, cependant, le modèle viscoélastique ne peut pas décrire les résultats expérimentaux, qui sont plus cohérents avec une image décrivant le cytosquelette et, plus généralement, le cytoplasme cellulaire décrit comme une matière active poroélastique ^5,6. Deux caractéristiques principales caractérisent ces types de matériaux. (i) La première caractéristique principale est la génération d’un flux du cytosol pénétrant (le « solvant ») à travers les pores du gel par des gradients de contractilité entraînés par les moteurs de myosine, qui sous-tend des processus tels que le blebbing^{cellulaire 7}, la motilité⁸ et les oscillations de forme cellulaire⁹. L’émergence de tels flux cytosoliques peut être locale, pour le blebbing, ou globale, comme dans la motilité cellulaire. Dans ce dernier cas, les contraintes contractiles appliquées à l’arrière de la cellule entraînent le flux du liquide cytosolique vers le front cellulaire, ce qui reconstitue le pool protéique nécessaire à l’assemblage des lamellipodes⁸. (ii) La deuxième caractéristique principale est que la relaxation des contraintes est diffusive et se caractérise par une constante de diffusion effective, qui dépend du module d’élasticité du gel, de la porosité du gel et de la viscosité^{du solvant 5}. La constante de diffusion poroélastique détermine la vitesse à laquelle le système répond à une contrainte appliquée. Des constantes de diffusion plus élevées correspondent à une redistribution des contraintes plus rapide. Ceci, à son tour, détermine combien de temps il faut pour que le liquide cytosolique intracellulaire soit redistribué dans la cellule après une contrainte mécanique appliquée, qu’elle soit externe ou interne, comme les contraintes contractiles actives générées par les moteurs de myosine. Ces exemples démontrent ainsi que la mécanique du cytosquelette et du cytosol sont étroitement couplées et ne peuvent être traitées séparément³.

Comme les cellules peuvent réguler leurs propriétés mécaniques de diverses manières, l’interaction entre la mécanique des réseaux et la dynamique de l’écoulement des fluides reste mal comprise. Une approche alternative puissante consiste à utiliser des systèmes reconstitués in vitro qui permettent un contrôle total des divers constituants microscopiques et des paramètres du système, ce qui rend ces systèmes modèles optimaux pour l’analyse physique^10,11. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l’impact de la composition des protéines et de la géométrie du système sur la motilité à base d’actine 12,13,14,15,16,17,18, la structuration 2D des réseaux d’actomyosine ^19,20,21,22, et l’interaction entre la contractilité du réseau et la dynamique de l’écoulement des fluides des gels d’actomyosine poroélastiques, qui fait l’objet de cet article²³.

Dans ce manuscrit, la préparation de réseaux d’actomyosine élastique contractile de dimensions contrôlables et de propriétés matérielles est discutée sur la base des travaux d’Ideses et ^al.23. La dynamique du gel contractant et du solvant drainé est analysée et quantifiée, à travers laquelle il est démontré que ces gels d’actomyosine peuvent être décrits comme un matériau actif poroélastique. L’étude de l’effet de la viscosité des solvants sur la diffusivité des contraintes confirme encore le caractère poroélastique de ces réseaux. Les différentes relations de mise à l’échelle utilisées pour la quantification des données sont fournies. Enfin, les défis expérimentaux, les pièges courants et la pertinence des résultats expérimentaux pour le cytosquelette cellulaire sont également abordés.

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Protocole

1. Traitement de surface et passivation du verre :

REMARQUE : Cette section comprend trois étapes principales (voir la figure 1) : (i) nettoyage et hydrophilisation, (ii) silanisation et (iii) passivation de surface.

1. Nettoyage et hydrophilisation
   1. Utilisez la solution Piranha pour le nettoyage des surfaces vitrées.
      NOTE: La solution de piranha est un mélange de 30% H 2 O 2 et 70% H₂ SO₄ (table des matériaux). Son objectif principal est d’éliminer les contaminations organiques des surfaces de revêtement et d’exposer les groupes OH sur la surface du verre. De cette manière, la surface du verre devient hydrophile.
   2. Placer 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) lamelles de verre (Table des matériaux) dans un support en polytétrafluoroéthylène fait maison (surface de base: 5,5 cm x 5,5 cm). Transférer le porte-polytétrafluoroéthylène dans un bécher de 400 mL (Table des matériaux) et l’incuber avec 300 mL de solution de Piranha pendant 2 h. Faites cette étape sur la glace et dans une hotte chimique.
      REMARQUE: Le poteau en polytétrafluoroéthylène vissé à la base du support mesure 12 cm de long, plus long que le bécher (11 cm), ce qui permet le transfert/retrait en toute sécurité du support dans / depuis la solution de piranha. Comme la solution Piranha peut encore être très réactive et très chaude, il est impératif d’arrêter la réaction. Le moyen le plus simple d’arrêter la réaction est de verser la solution de Piranha dans de l’eau (du robinet) pour obtenir une dilution 50x (au moins). La solution peut ensuite être jetée en toute sécurité. Ne conservez jamais la solution de Piranha usagée dans une bouteille en verre fermée – cela pourrait se terminer par une explosion de bouteille.
   3. Transférer le support en polytétrafluoroéthylène dans un bécher propre rempli d’eau fraîche bidistillée (DDW) pour éliminer l’excès de piranha des lamelles de couverture.
   4. Transférer le bécher dans un bain de sonication (Table of Materials) et sonifier à 80 Hz à pleine puissance pendant 10 min à 25 °C. Répétez cette étape deux fois de plus avec un nouveau DDW. Utilisez du DDW frais à chaque fois.
2. Silanisation
   1. Transférer le support dans un bécher propre (400 ml) rempli de 300 ml de méthanol pur (table des matériaux), puis dans un bain de sonication (table des matériaux). Soniquer à 80 Hz à pleine puissance pendant 30 min à 25 °C.
   2. Après la sonication, transférer le support dans une solution de silane préparée avec 15 mL de DDW, 3,1 mL d’acide acétique (Table des matières), 340 mL de méthanol et 7,6 mL de silane ((3-Mercaptopropyl) triméthoxysilane) (Tableau des matériaux). Scellez le bécher avec du parafilm et conservez-le au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
      NOTE: La préparation et la manipulation de la solution de silane doivent être effectuées dans une hotte chimique. Après l’étape de silanisation, mettez la solution de silane utilisée (déchets) dans une bouteille en verre dédiée à l’intérieur de la hotte chimique.
   3. Le lendemain, transférer le support dans un bécher propre rempli de 300 ml de méthanol pur pendant 15 s. Ensuite, transférez le support dans un bécher propre, pas avant d’avoir séché le fond du support en polytétrafluoroéthylène pour éliminer l’excès de méthanol. Transférer le bécher dans le four (table des matières) pour sécher les lamelles de verre pendant 5 min à 120 °C.
3. Passivation de surface avec un polymère inerte
   1. Obtenir une passivation de surface en incubant les lamelles de verre avec un polymère inerte (Table des matériaux). Pour chaque expérience, prenez deux lamelles de couverture et placez-les dans une boîte de Petri recouverte d’une couche de parafilm initialement nettoyée à l’éthanol (EtOH) (DDW/EtOH : 30/70 vol/vol) (Table of Materials).
   2. Incuber chaque lamelle de couverture avec 1 mL d’un maléimide de méthoxy polyéthylèneglycol de poids moléculaire de 4 mg·mL⁻¹ 5 kDa (table des matières) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (table des matériaux) pendant 1 h à 22 °C.
      REMARQUE: Le placement des lamelles de couverture sur une couche de parafilm hydrophobe limite la solution polymère de PEG hydrophile à la surface de la lamelle de couverture en verre. Le temps d’incubation est critique pour obtenir une passivation optimale. Utilisez des temps d’incubation compris entre 45 min et 2 h. Au-delà de ce temps d’incubation, la surface des lamelles de verre peut se détériorer, entraînant une adhérence des protéines et une perte de transparence.
   3. À la fin du processus d’incubation, rincer chaque lamelle de couverture avec 5 ml de DDW et sécher avec un débit de N₂ (gaz). Ne séchez pas les lamelles sous vide. Puisque les lamelles doivent être maintenues humides après la passivation, mettez immédiatement 1 mL de Tris 10 mM sur les surfaces pégylées. Utilisez les bordereaux de couverture dans les 2 heures.
      NOTE: Les différentes étapes doivent être effectuées dans une chambre d’écoulement laminaire pour éviter la contamination de la surface du verre.

2. Purification des protéines

1. Purifier la G-actine de la poudre d’acétone des muscles squelettiques de lapin en utilisant la méthode de filtration^{sur gel 24}.
   1. La purification de l’actine prend 1 semaine. Conservez la G-actine purifiée dans un tampon G (5 mM Tris pH 7,8, 0,01%_NaN3, 0,1 mM CaCl 2,_0,2 mM ATP et 1 mM DTT) et stockez-la sur de la glace. Utilisez la solution dans les 2 semaines.
      REMARQUE : Remplacez la glace tous les deux jours.
   2. Étiqueter l’actine avec un colorant fluorescent modifié par le maléimide¹⁶ (Table des matériaux). Purifier la fascine GST basée sur la méthode d’Ono et ^al.25. Flash-congeler les deux protéines dans le liquide N₂ et conserver à −80 °C.
2. Utiliser un protocole standard pour purifier la myosine II du muscle squelettique du lapin²⁶. Le tampon de base de myosine II (dimères) purifié comprend 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl et 35 % p/v de saccharose. Congeler la myosine dans le liquide_N2 et la conserver à −80 °C.
   REMARQUE: La concentration élevée de KCl maintient les moteurs de myosine sous une forme dimérique, tandis que le pourcentage élevé de saccharose assure que l’activité des moteurs n’est pas entravée lors de la congélation. Utilisez une pipette dédiée à la manipulation des fluides visqueux lorsque vous travaillez avec des solutions mères de myosine II (Tableau des matériaux).
   1. Étiqueter les dimères de myosine II avec un colorant fluorescent (Tableau des matériaux) à des paires de résidus de cystéine modifiés^19,27. Utilisez un mutant RLC RLC à cet effet²⁶. Congeler la myosine II marquée dans le liquide N₂ et la conserver à −80 °C.
      REMARQUE: Cette procédure de marquage garantit que la myosine marquée est active en tant que protéine native de myosine II.
3. Utiliser un spectrophotomètre UV-Vis (Table of Materials) pour mesurer l’absorbance des solutions protéiques mères et déduire les concentrations de protéines avec la loi de Beer-Lambert en utilisant les coefficients d’extinction suivants: G-actine (ε₂₉₀ = 26 460 M−1·cm−1), GST-fascine (ε 280 = 99 330 M−1·cm−1), myosine II dimère (ε₂₈₀ =₂₆₈ 800 M−1·cm⁻¹), et le mutant RLC A (ε₂₈₀ = 3 960 M−1·cm⁻¹)¹⁹.

3. Préparation des échantillons

NOTE: Polymériser les monomères d’actine en présence de gros agrégats de moteurs myosine II et de la forte fascine de réticulation passive pour produire macroscopiquement des réseaux d’actomyosine élastique contractile^19,23. L’ajout de billes fluorescentes à la solution permet de suivre l’écoulement du solvant pendant la contraction du gel.

1. Solution protéique (« actomyosine »)
   1. À l’exception de la G-actine, conserver les protéines à −80 °C dans de petites aliquotes et les décongeler à 37 °C avant utilisation. Le volume total de la solution d’actomyosine est de 40 μL.
   2. Préparer la solution en mélangeant 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, un système régénérant ATP (0,5 mg·mL−1 créatine kinase et 5 mM créatine phosphate), 200 μM EGTA (chélates Ca²⁺ ions), une solution antiblanchissante (0,1 mg·mL−1 glucose oxydase, 0,018 mg·mL−1 catalase et 5 mg·mL⁻¹ glucose), 5 μM de G-actine, 280 nM de GST-fascine et 1,67 nM de myosine II. Le pourcentage de G-actine marquée est de 5% (pourcentage molaire).
      REMARQUE: Utilisez un faible pourcentage de G-actine marquée pour éviter la saturation du signal fluorescent aux stades avancés de la contraction du gel.
2. Préparation des agrégats moteurs de myosine II
   1. Ajouter les moteurs de myosine à la solution protéique sous forme d’agrégats. Pour former de gros agrégats de myosine (150 dimères de myosine/agrégat), diluer la solution mère de myosine avec 10 mM Tris pH 7,4 pour atteindre une concentration finale de 25 mM KCl.
   2. Conservez la solution de myosine diluée pendant 10 minutes à température ambiante (RT), puis transférez-la sur de la glace jusqu’à utilisation. Les moteurs sont pleinement actifs jusqu’à 2 h.
3. Mesure du débit de solvant
   1. Pour suivre l’écoulement du solvant à travers les pores du gel, ajoutez les billes fluorescentes à la solution d’actomyosine. Réduire l’interaction entre les billes et le réseau d’actomyosine en passivant les perles. Pratiquement, incuber 1 μL de billes (Table des matériaux) avec 5 μM de G-actine pendant 20 min à TA, puis éliminer l’excès de G-actine par centrifugation (Tableau des matériaux) (conditions : 6 000 x g pendant 5 min à 4 °C).
   2. Répétez cette étape avec 10 mg·mL⁻¹ d’albumine sérique bovine (BSA) (Table of Materials) pour bloquer (éventuellement) la surface non enduite restante. Utiliser les billes à une dilution finale de 1:10 000 vol/vol dans les expériences.
      NOTE: Il est important d’adapter le diamètre des billes à la taille des pores du gel de sorte que le rapport de taille des billes / pores soit <1 à toutes les étapes.
4. Effet de la viscosité de la solution
   1. Contrôler la viscosité de la solution en ajoutant du glycérol (table des matières) à la solution d’actomyosine. L’ajout de glycérol à un pourcentage en poids compris entre 0% et 34% induit une augmentation correspondante de la viscosité de la solution de η ω à 2,76 η ω, où η _ω est la viscosité de l’eau à 20 °C²⁸.
      REMARQUE: Il est essentiel d’utiliser une pipette dédiée à la manipulation des fluides visqueux lorsque vous travaillez avec du glycérol (Tableau des matériaux).

4. Exécution d’une expérience

1. Manipulation de porte-échantillons maison
   1. Prenez l’une des lamelles de couverture passivées au PEG, placez une entretoise de parafilm graissée dessus et placez-la dans le porte-échantillon.
      REMARQUE: On peut remplacer l’entretoise parafilm par n’importe quelle entretoise.
2. Préparation de la solution d’actomyosine
   1. Préparer la solution d’actomyosine sur glace dans un tube microcentrifuge en incorporant les différents constituants microscopiques, en ajoutant les agrégats moteurs de myosine II et en ajoutant EGTA en dernier. Bien mélanger la solution. L’ajout d’EGTA initie la polymérisation du réseau d’actomyosine, qui fixe l’heure de début de l’expérience.
3. Placez 1,1 μL de cette solution sur la glissière de couverture montée sur support et placez la deuxième lamelle de couverture sur le dessus. Vissez le support pour sceller l’échantillon. Ce processus comprime légèrement la goutte, qui adopte une forme de disque. Les diamètres de goutte varient entre 2 800 et 3 000 μm.
4. Placez le porte-échantillon sur le microscope et commencez l’acquisition. Préparez le microscope à l’avance pour réduire le temps d’acquisition initial. Il faut généralement 1 à 2 minutes après le mixage pour démarrer l’imagerie de l’échantillon.

5. Techniques de microscopie

1. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope fluorescent inversé (Table of Materials) contrôlé par un logiciel dédié (Table of Materials).
   1. Utilisez de faibles grossissements de 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR objectif (Table des matériaux) pour visualiser toute la zone de gel et suivre sa contraction macroscopique avec le temps.
   2. Utiliser un objectif UPlanFL 10x/0.3 Ph1 (Table of Materials) pour caractériser la porosité et la structure du réseau et suivre l’auto-organisation et la contraction du réseau avec le temps.
      REMARQUE: Cet objectif est également utile pour localiser les agrégats moteurs de myosine II dans le réseau et suivre le mouvement des billes fluorescentes à travers les pores du gel. Des grossissements plus élevés peuvent être utilisés au détriment d’un champ de vision réduit, ce qui est encore plus important en mode d’imagerie bicolore (Table of Materials).
2. Exciter les échantillons à 488 nm (billes d’actine/fluorescentes) et 561 nm (agrégats moteurs de myosine/billes fluorescentes). Acquérir les images à 100 ms par image avec un logiciel dédié (Table of Materials) en mode streaming avec une caméra EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) (Table of Materials).
   REMARQUE : L’intensité de la lampe fluorescente (tableau des matériaux) doit être maintenue à la valeur la plus faible possible pour éviter la saturation du signal pendant la contraction du réseau.
3. Imagerie bicolore simultanée
   1. Utilisez ce mode à deux fins: (i) détecter la localisation des agrégats moteurs de myosine dans le réseau d’actine, et (i) caractériser le flux de solvant vers l’extérieur à l’intérieur et à l’extérieur pendant la contraction du réseau.
   2. Excitez les moteurs d’actine et de myosine II à 488 nm et 561 nm, respectivement, et enregistrez les images simultanément sur une caméra EMCCD (Table of Materials) à l’aide d’un appareil à double émission (Table of Materials). Utilisez le même système d’imagerie pour imager simultanément le gel d’actine (488 nm) et les billes fluorescentes (561 nm).

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Résultats

Deux lamelles de verre sont utilisées par expérience. Les lamelles de couverture en verre sont nettoyées et passivées avec des polymères PEG. La passivation est essentielle pour empêcher les protéines solubilisées d’adhérer aux surfaces vitrées aux premiers stades expérimentaux et pour minimiser l’interaction du réseau de contraction avec les parois vitreuses. L’échec d’une bonne passivation peut entraîner une contraction inefficace et, dans des cas extrêmes, peut même inhiber la formation du rés...

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Discussion

Ici, une approche in vitro est utilisée pour caractériser la mécanique des gels d’actomyosine poroélastique en tant que système modèle du cytosquelette cellulaire et, plus généralement, du cytoplasme cellulaire, dont il a été démontré qu’il se comporte comme un matériau poroélastique ^3,5. La rhéologie du cytosquelette cellulaire (cytoplasme) a été caractérisée par une constante de diffusion poroélastique, qui dicte combien de temp...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)