Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Poroelastizität von Aktomyosingelen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Die Dynamik des Aktomyosingels und des eingebetteten Lösungsmittels wird quantifiziert, wodurch die Netzwerkporoelastizität nachgewiesen wird. Wir diskutieren auch die experimentellen Herausforderungen, häufige Fallstricke und die Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Zusammenfassung

Zellen können aktiv ihre Form verändern und beweglich werden, eine Eigenschaft, die von ihrer Fähigkeit abhängt, ihre innere Struktur aktiv neu zu organisieren. Diese Eigenschaft wird auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosinmotoren und akzessorischen Proteinen ist, die intrinsische Kontraktionseigenschaften aufweisen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält. Dieses Modell kann jedoch nicht immer die experimentellen Ergebnisse erklären, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett als poroelastisches aktives Material beschreibt - ein elastisches Netzwerk, das in Zytosol eingebettet ist. Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren erzeugt werden, treiben den Fluss des Zytosols durch die Gelporen an, was darauf schließen lässt, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind. Ein Hauptmerkmal der Poroelastizität ist die diffusive Relaxation von Spannungen im Netzwerk, die durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität und der Viskosität des Zytosols (Lösungsmittels) abhängt. Da Zellen viele Möglichkeiten haben, ihre Struktur und Materialeigenschaften zu regulieren, ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Mechanik des Zytoskeletts und die Dynamik des Zytosolflusses gekoppelt sind, noch wenig verstanden. Hier wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Materialeigenschaften von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem für das Zellzytoskelett zu charakterisieren. Die Gelkontraktion wird durch die motorische Kontraktilität des Myosins angetrieben, die zur Entstehung eines Flusses des eindringenden Lösungsmittels führt. Der Artikel beschreibt, wie diese Gele hergestellt und Experimente durchgeführt werden. Wir diskutieren auch, wie der Lösungsmittelfluss und die Gelkontraktion sowohl auf lokaler als auch auf globaler Ebene gemessen und analysiert werden können. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden angegeben. Abschließend werden die experimentellen Herausforderungen und häufigen Fallstricke diskutiert, einschließlich ihrer Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Einleitung

Lebende Zellen haben einzigartige mechanische Eigenschaften. Neben der Fähigkeit, passiv auf einwirkende Kräfte zu reagieren, sind sie auch in der Lage, aktiv Kräfte als Reaktion auf äußere Reize zu erzeugen¹. Diese Eigenschaften, die für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, insbesondere während der Zellmotilität, unerlässlich sind, werden in erster Linie auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosin-Molekularmotoren und akzessorischen Proteinen ist. Diese Aktomyosin-Netzwerke weisen intrinsische Selbstorganisations- und Kontraktionseigenschaften auf, die von den Myosin-Motorproteinen angetrieben werden, die die Aktinfilamente vernetzen und aktiv mechanische Spannungen in dem Netzwerk erzeugen, das durch ATP-Hydrolyse angetrieben wird².

Zahlreiche experimentelle und theoretische Studien wurden durchgeführt, um die Materialeigenschaften des Zytoskeletts³ zu untersuchen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält⁴. Das bedeutet, dass sich das Zytoskelett auf kurzen Zeitskalen wie ein elastisches Material verhält und sich auf langen Zeitskalen aufgrund der Vernetzung von Proteinen und der Ablösung (und Wiederanheftung) des Myosinmotors wie eine viskose Flüssigkeit verhält, wodurch sich das Netzwerk dynamisch drehen kann. In vielen Situationen kann das viskoelastische Modell jedoch nicht die experimentellen Ergebnisse beschreiben, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett und allgemeiner das Zellzytoplasma als poroelastisches aktives Material beschreibt ^5,6. Zwei Hauptmerkmale charakterisieren diese Art von Materialien. (i) Das erste Hauptmerkmal ist die Erzeugung eines Flusses des eindringenden Zytosols (des "Lösungsmittels") durch die Gelporen durch Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren angetrieben werden, was Prozessen wie Zellblasen⁷, Motilität⁸ und Zellformoszillationen⁹ zugrunde liegt. Die Entstehung solcher zytosolischen Flüsse kann lokal sein, zum Blebbing, oder global, wie bei der Zellmotilität. Im letzteren Fall treiben die kontraktil aufgebrachten Spannungen an der Zellrückseite den Fluss der zytosolischen Flüssigkeit in Richtung Zellfront an, wodurch der Proteinpool wieder aufgefüllt wird, der für die Lamellipodien-Assemblierung benötigt^{wird 8}. (ii) Das zweite Hauptmerkmal besteht darin, dass die Relaxation von Spannungen diffusiv ist und durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität des Gels und der Viskosität des Lösungsmittels^{abhängt 5}. Die poroelastische Diffusionskonstante bestimmt, wie schnell das System auf eine aufgebrachte Spannung reagiert. Höhere Diffusionskonstanten entsprechen einer schnelleren Spannungsumverteilung. Dies wiederum bestimmt, wie lange es dauert, bis die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit nach mechanischer Belastung, sei es von außen oder von innen, wie z. B. den aktiven kontraktilen Belastungen, die von Myosinmotoren erzeugt werden, innerhalb der Zelle umverteilt wird. Diese Beispiele zeigen somit, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind und nicht getrennt voneinander behandelt werden können³.

Da Zellen ihre mechanischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise regulieren können, ist das Zusammenspiel zwischen Netzwerkmechanik und Strömungsdynamik noch wenig verstanden. Ein leistungsfähiger alternativer Ansatz ist die Verwendung von in vitro rekonstituierten Systemen, die eine vollständige Kontrolle über die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile und die Systemparameter ermöglichen, wodurch diese Modellsysteme optimal für die physikalische Analyse geeignet sind^10,11. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um den Einfluss der Proteinzusammensetzung und der Systemgeometrie auf die Aktin-basierte Motilität 12,13,14,15,16,17,18 und die 2D-Musterung von Aktomyosin-Netzwerken ^19,20,21,22 zu untersuchen und das Zusammenspiel zwischen Netzwerkkontraktilität und Fluidströmungsdynamik poroelastischer Aktomyosingele, das im Mittelpunkt dieser Arbeit^{steht 23}.

In diesem Manuskript wird die Herstellung von kontraktilen elastischen Aktomyosin-Netzwerken mit kontrollierbaren Dimensionen und Materialeigenschaften auf der Grundlage der Arbeiten von Ideses et ^al.23 diskutiert. Die Dynamik des kontrahierenden Gels und des drainierten Lösungsmittels wird analysiert und quantifiziert, wodurch gezeigt wird, dass diese Aktomyosingele als poroelastisches aktives Material beschrieben werden können. Die Untersuchung des Einflusses der Lösungsmittelviskosität auf die Spannungsdiffusionsfähigkeit bestätigt die poroelastische Natur dieser Netzwerke. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden bereitgestellt. Schließlich werden auch die experimentellen Herausforderungen, die häufigsten Fallstricke und die Relevanz der experimentellen Ergebnisse für das Zellzytoskelett diskutiert.

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Protokoll

1. Glasoberflächenbehandlung und Passivierung:

HINWEIS: Dieser Abschnitt umfasst drei Hauptschritte (siehe Abbildung 1): (i) Reinigung und Hydrophilierung, (ii) Silanisierung und (iii) Oberflächenpassivierung.

1. Reinigung und Hydrophilierung
   1. Verwenden Sie Piranha-Lösung für die Reinigung von Glasoberflächen.
      HINWEIS: Die Piranha-Lösung ist ein Gemisch aus 30 % H2 O2 und 70 %_{H2 SO4} (Materialtabelle). Sein Hauptziel ist es, organische Verunreinigungen von Deckglasoberflächen zu entfernen und die OH-Gruppen auf der Glasoberfläche freizulegen. Auf diese Weise wird die Glasoberfläche hydrophil.
   2. Legen Sie 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) Glasdeckgläser (Materialtabelle) in einen selbstgebauten Polytetrafluorethylenhalter (Grundfläche: 5,5 cm x 5,5 cm). Übertragen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein 400-ml-Becherglas (Materialtabelle) und inkubieren Sie ihn 2 h lang mit 300 ml Piranha-Lösung. Führen Sie diesen Schritt auf Eis und in einer chemischen Haube durch.
      Anmerkungen: Die an der Halterbasis verschraubte Polytetrafluorethylenstange ist 12 cm lang und damit länger als der Becher (11 cm), was ein sicheres Umsetzen/Herausziehen des Halters in/aus der Piranha-Lösung ermöglicht. Da die Piranha-Lösung immer noch sehr reaktiv und sehr heiß sein kann, ist es unbedingt erforderlich, die Reaktion zu stoppen. Der einfachste Weg, die Reaktion zu stoppen, besteht darin, die Piranha-Lösung in (Leitungs-)Wasser zu gießen, um eine 50-fache Verdünnung (mindestens) zu erreichen. Die Lösung kann dann bedenkenlos entsorgt werden. Bewahren Sie die gebrauchte Piranha-Lösung niemals in einer geschlossenen Glasflasche auf – dies könnte zu einer Flaschenexplosion führen.
   3. Füllen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein sauberes Becherglas, das mit frischem doppelt destilliertem Wasser (DDW) gefüllt ist, um überschüssigen Piranha von den Deckgläsern zu waschen.
   4. Füllen Sie das Becherglas in ein Beschallungsbad (Materialtabelle) und beschallen Sie es 10 Minuten lang bei 80 Hz bei voller Leistung bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male mit frischem DDW. Verwenden Sie jedes Mal frisches DDW.
2. Silanisierung
   1. Füllen Sie den Halter in ein sauberes Becherglas (400 ml), das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist (Materialtabelle) und dann in ein Beschallungsbad (Materialtabelle). Beschallung bei 80 Hz bei voller Leistung für 30 min bei 25 °C.
   2. Nach der Beschallung wird der Halter in eine Silanlösung überführt, die mit 15 ml DDW, 3,1 ml Essigsäure (Materialtabelle), 340 ml Methanol und 7,6 ml Silan ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan) hergestellt wurde (Materialtabelle). Den Becher mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren.
      Anmerkungen: Die Herstellung und Handhabung der Silanlösung muss in einer chemischen Haube erfolgen. Geben Sie nach dem Silanisierungsschritt die verbrauchte Silanlösung (Abfall) in eine spezielle Glasflasche in der Chemikalienhaube.
   3. Am nächsten Tag wird der Halter für 15 s in ein sauberes Becherglas gefüllt, das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist. Setzen Sie dann den Halter in ein sauberes Becherglas ein, nicht bevor Sie den Boden des Polytetrafluorethylenhalters getrocknet haben, um überschüssiges Methanol zu entfernen. Stellen Sie das Becherglas in den Ofen (Materialtabelle), um die Glasdeckgläser 5 min bei 120 °C zu trocknen.
3. Oberflächenpassivierung mit einem inerten Polymer
   1. Erreichen Sie eine Oberflächenpassivierung, indem Sie die Glasdeckgläser mit einem inerten Polymer inkubieren (Materialtabelle). Nehmen Sie für jedes Experiment zwei Deckgläser und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit einer Parafilmschicht beschichtet ist, die zunächst mit Ethanol (EtOH) gereinigt wurde (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (Materialtabelle).
   2. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit 1 ml eines 4 mg·ml⁻¹ 5 kDa molekularen Methoxy-Polyethylenglykolmaleimid (mPEG-mal, M_w = 5 kDa) (Materialtabelle) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Materialtabelle) für 1 h bei 22 °C.
      Anmerkungen: Durch das Platzieren der Deckgläser auf einer hydrophoben Parafilmschicht wird die hydrophile PEG-Polymerlösung auf die Oberfläche des Glasdeckglases beschränkt. Die Inkubationszeit ist entscheidend für eine optimale Passivierung. Verwenden Sie die Inkubationszeiten zwischen 45 min und 2 h. Oberhalb dieser Inkubationszeit kann sich die Oberfläche der Glasdeckgläser verschlechtern, was zu Proteinadhäsion und Transparenzverlust führt.
   3. Spülen Sie am Ende des Inkubationsprozesses jedes Deckglas mit 5 ml DDW aus und trocknen Sie es mit einem Fluss von_N2 (Gas). Trocknen Sie die Deckgläser nicht unter Vakuum. Da die Deckgläser nach der Passivierung feucht gehalten werden müssen, geben Sie sofort 1 ml 10 mM Tris auf die pegylierten Oberflächen. Verwenden Sie die Deckgläser innerhalb von 2 Stunden.
      Anmerkungen: Die verschiedenen Schritte müssen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden, um eine Kontamination der Glasoberfläche zu vermeiden.

2. Protein-Reinigung

1. Reinigen Sie G-Aktin aus Acetonpulver der Skelettmuskulatur von Kaninchen mit der Gelfiltrationsmethode²⁴.
   1. Die Aktinreinigung dauert 1 Woche. Bewahren Sie das gereinigte G-Aktin in G-Puffer auf (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN₃, 0,1 mM CaCl 2,_0,2 mM ATP und 1 mM DTT) und lagern Sie es auf Eis. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 2 Wochen.
      Anmerkungen: Ersetzen Sie das Eis alle paar Tage.
   2. Markierung des Aktins mit einem maleimidmodifizierten Fluoreszenzfarbstoff¹⁶ (Materialtabelle). Reinigen Sie das GST-Fascin nach der Methode von Ono et ^al.25. Beide Proteine werden in flüssigem N₂ schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
2. Verwenden Sie ein Standardprotokoll zur Aufreinigung von Myosin II aus dem Skelettmuskel²⁶ des Kaninchens. Der gereinigte Myosin-II-Puffer (Dimere) enthält 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl und 35 % w/v Saccharose. Das Myosin wird in Flüssigkeit_N2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
   Anmerkungen: Die hohe Konzentration von KCl hält die Myosinmotoren in einer dimeren Form, während der hohe Anteil an Saccharose sicherstellt, dass die Aktivität der Motoren beim Einfrieren nicht beeinträchtigt wird. Verwenden Sie eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten, wenn Sie mit Myosin II-Stammlösungen arbeiten (Materialtabelle).
   1. Markierung der Myosin-II-Dimere mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Materialtabelle) an Paaren von technisch hergestellten Cysteinresten^19,27. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine Hühnermagen-RLC-Mutante A²⁶. Das markierte Myosin II wird in Flüssigkeit_N2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
      HINWEIS: Dieses Markierungsverfahren stellt sicher, dass das markierte Myosin als natives Myosin II-Protein aktiv ist.
3. Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektralphotometer (Materialtabelle), um die Absorption der Stammproteinlösungen zu messen, und leiten Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Beer-Lambert-Gesetz unter Verwendung der folgenden Extinktionskoeffizienten ab: G-Aktin (ε₂₉₀ = 26.460 M⁻1·cm−1), GST-Fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), Myosin-II-Dimer (ε_{280 = 268.800} M−1·cm⁻¹), und RLC-Mutante A (ε₂₈₀ = 3.960 M−1·cm⁻¹)¹⁹.

3. Probenvorbereitung

HINWEIS: Polymerisieren Sie die Aktinmonomere in Gegenwart großer Aggregate von Myosin-II-Motoren und dem starken passiven Vernetzer Fascin zur Herstellung makroskopisch kontraktiler elastischer Aktomyosin-Netzwerke^19,23. Die Zugabe von fluoreszierenden Kügelchen zur Lösung ermöglicht es, den Lösungsmittelfluss während der Gelkontraktion zu verfolgen.

1. Proteinlösung ("Aktomyosin")
   1. Mit Ausnahme von G-Aktin sollten die Proteine in kleinen Aliquoten bei −80 °C aufbewahrt und vor der Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden. Das Gesamtvolumen der Aktomyosinlösung beträgt 40 μl.
   2. Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM_MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ein ATP-Regeneriersystem (0,5 mg·ml−1 Kreatinkinase und 5 mM Kreatinphosphat), 200 μM EGTA (Chelate Ca²⁺ -Ionen), eine Anti-Bleichlösung (0,1 mg·ml−1 Glukoseoxidase, 0,018 mg·ml−1 Katalase und 5 mg·ml⁻¹ Glukose), 5 μM G-Aktin, 280 nM GST-Faschin und 1,67 nM Myosin II. Der prozentuale Anteil an markiertem G-Aktin beträgt 5% (molare Prozentzahl).
      Anmerkungen: Verwenden Sie einen geringen Prozentsatz an markiertem G-Aktin, um die Sättigung des Fluoreszenzsignals in den fortgeschrittenen Stadien der Gelkontraktion zu vermeiden.
2. Herstellung von Myosin-II-Motoraggregaten
   1. Fügen Sie der Proteinlösung die Myosinmotoren in Form von Aggregaten hinzu. Um große Myosin-Aggregate (150 Myosin-Dimere/Aggregat) zu bilden, wird die Myosin-Stammlösung mit 10 mM Tris pH 7,4 verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 mM KCl zu erreichen.
   2. Bewahren Sie die verdünnte Myosinlösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf und geben Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Die Motoren sind bis zu 2 h voll aktiv.
3. Messung des Lösemittelflusses
   1. Um den Lösungsmittelfluss durch die Gelporen zu verfolgen, fügen Sie die fluoreszierenden Kügelchen der Aktomyosinlösung hinzu. Reduzieren Sie die Wechselwirkung zwischen den Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk, indem Sie die Beads passivieren. In der Praxis inkubieren Sie 1 μl Kügelchen (Materialtabelle) mit 5 μM G-Aktin für 20 min bei RT und entfernen dann überschüssiges G-Aktin durch Zentrifugation (Materialtabelle) (Bedingungen: 6.000 x g für 5 min bei 4 °C).
   2. Wiederholen Sie diesen Schritt mit 10 mg·ml⁻¹ Rinderserumalbumin (BSA) (Materialtabelle), um (möglicherweise) die verbleibende unbeschichtete Oberfläche zu blockieren. Verwenden Sie die Kügelchen in einer Endverdünnung von 1:10.000 vol/vol in den Experimenten.
      Anmerkungen: Es ist wichtig, den Durchmesser der Perlen so an die Gelporengröße anzupassen, dass das Verhältnis von Perle zu Porengröße in allen Phasen <1 beträgt.
4. Einfluss der Viskosität der Lösung
   1. Kontrollieren Sie die Viskosität der Lösung, indem Sie der Aktomyosinlösung Glycerin (Materialtabelle) hinzufügen. Die Zugabe von Glycerin in einem Gewichtsprozentbereich von 0 % bis 34 % induziert eine entsprechende Erhöhung der Lösungsviskosität von η ω auf 2,76 η ω, wobei η _ω die Viskosität von Wasser bei 20 °C²⁸ ist.
      HINWEIS: Bei der Arbeit mit Glycerin ist es wichtig, eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten zu verwenden (Materialtabelle).

4. Durchführen eines Experiments

1. Hausgemachtes Probenhalter-Handling
   1. Nehmen Sie eines der PEG-passivierten Deckgläser, legen Sie einen gefetteten Parafilm-Abstandshalter darauf und legen Sie es in den Probenhalter.
      Anmerkungen: Man kann den Parafilm-Abstandshalter durch einen beliebigen Abstandshalter ersetzen.
2. Herstellung der Aktomyosinlösung
   1. Bereiten Sie die Aktomyosinlösung auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu, indem Sie die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile einbauen, die Myosin-II-Motoraggregate hinzufügen und zuletzt EGTA hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gut. Die Zugabe von EGTA initiiert die Polymerisation des Aktomyosin-Netzwerks, die den Startzeitpunkt des Experiments festlegt.
3. Geben Sie 1,1 μl dieser Lösung auf das am Halter befestigte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf. Schrauben Sie den Halter fest, um die Probe zu versiegeln. Bei diesem Vorgang wird der Tropfen leicht zusammengedrückt, der eine scheibenartige Form annimmt. Die Tropfendurchmesser liegen zwischen 2.800 und 3.000 μm.
4. Setzen Sie den Probenhalter auf das Mikroskop und starten Sie die Aufnahme. Bereiten Sie das Mikroskop im Voraus vor, um die anfängliche Erfassungszeit zu verkürzen. Es dauert in der Regel 1-2 Minuten nach dem Mischen, um mit der Probenbildgebung zu beginnen.

5. Mikroskopie-Techniken

1. Bilden Sie die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Materialtabelle) ab, das von einer speziellen Software (Materialtabelle) gesteuert wird.
   1. Verwenden Sie niedrige Vergrößerungen von 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR Objektiv (Materialtabelle), um den gesamten Gelbereich zu visualisieren und seine makroskopische Kontraktion mit der Zeit zu verfolgen.
   2. Verwenden Sie ein 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-Objektiv (Table of Materials), um die Porosität und Struktur des Netzwerks zu charakterisieren und die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks mit der Zeit zu verfolgen.
      HINWEIS: Dieses Objektiv ist auch nützlich, um die Myosin-II-Motoraggregate innerhalb des Netzwerks zu lokalisieren und die Bewegung fluoreszierender Kügelchen durch die Gelporen zu verfolgen. Höhere Vergrößerungen können auf Kosten eines reduzierten Sichtfelds verwendet werden, was im zweifarbigen Bildmodus noch wichtiger ist (Materialtabelle).
2. Die Proben werden bei 488 nm (Aktin/Fluoreszenz-Beads) und 561 nm (Myosin-Motoraggregate/Fluoreszenz-Beads) angeregt. Erfassen Sie die Bilder mit einer Geschwindigkeit von 100 ms pro Bild mit einer speziellen Software (Table of Materials) im Streaming-Modus mit einer EMCCD-Kamera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (Table of Materials).
   HINWEIS: Die Intensität der Leuchtstofflampe (Materialtabelle) sollte auf dem niedrigstmöglichen Wert gehalten werden, um eine Signalsättigung während der Netzwerkkontraktion zu vermeiden.
3. Simultane zweifarbige Bildgebung
   1. Verwenden Sie diesen Modus für zwei Zwecke: (i) Detektion der Lokalisation der Myosinmotoraggregate innerhalb des Aktinnetzwerks und (i) Charakterisierung des nach außen gerichteten Lösungsmittelflusses innerhalb und außerhalb während der Netzwerkkontraktion.
   2. Die Aktin- und Myosin-II-Motoren werden bei 488 nm bzw. 561 nm angeregt und die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera (Materialtabelle) mit einer Dual-Emission-Apparatur (Materialtabelle) aufgenommen. Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktingel (488 nm) und die fluoreszierenden Kügelchen (561 nm) abzubilden.

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Ergebnisse

Pro Versuch werden zwei Glasdeckgläser verwendet. Die Glasdeckgläser werden mit PEG-Polymeren gereinigt und passiviert. Die Passivierung ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die gelösten Proteine bereits in frühen Versuchsstadien an den Glasoberflächen haften und um die Wechselwirkung des kontrahierenden Netzwerks mit den Glaswänden zu minimieren. Gelingt es nicht, eine gute Passivierung zu erreichen, kann dies zu einer ineffizienten Kontraktion führen und im Extremfall sogar die Bildung von Aktinnetzwerken h...

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Diskussion

Hier wird ein in vitro Ansatz verwendet, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zellzytoplasmas zu charakterisieren, das sich nachweislich als poroelastisches Material verhält ^3,5. Die Rheologie des Zellzytoskeletts (Zytoplasma) wurde durch eine poroelastische Diffusionskonstante charakterisiert, die bestimmt, wie lange es dauert, bis sich die intrazelluläre zytosolische Flüssigkei...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)