המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

Summary

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

Abstract

תאים יכולים לשנות באופן פעיל את צורתם ולהפוך לתנועתיים, תכונה התלויה ביכולתם לארגן מחדש באופן פעיל את המבנה הפנימי שלהם. תכונה זו מיוחסת לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, בעיקר שלד האקטומיוזין (actomyosin cytoskeleton), שהוא ג'ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועי מיוזין וחלבוני עזר בעלי תכונות כיווץ פנימיות. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי. עם זאת, מודל זה אינו יכול תמיד להסביר את תוצאות הניסוי, אשר עקביות יותר עם תמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי כחומר פעיל פורואלסטי - רשת אלסטית המשובצת בציטוזול. שיפועי התכווצות הנוצרים על ידי מנועי המיוזין מניעים את זרימת הציטוזול על פני נקבוביות הג'ל, מה שמסיק שהמכניקה של שלד הציטו-שלד והציטוזול צמודים זה לזה. אחד המאפיינים העיקריים של פורואלסטיות הוא הרפיה דיפוזית של לחצים ברשת, המאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל התלוי במודולוס האלסטי של הג'ל, בנקבוביות ובצמיגות הציטוזול (ממס). מכיוון שלתאים יש דרכים רבות לווסת את המבנה שלהם ואת תכונות החומר שלהם, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו מכניקת השלד הציטו-שלד ודינמיקת זרימת הציטוזול מצומדים עדיין אינה מובנת. כאן, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת כדי לאפיין את התכונות החומריות של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל עבור שלד התא. התכווצות הג'ל מונעת על ידי התכווצות מנוע מיוזין, מה שמוביל להופעת זרימה של הממס החודר. המאמר מתאר כיצד להכין את הג'לים האלה ולערוך ניסויים. כמו כן, אנו דנים כיצד למדוד ולנתח את זרימת הממס והתכווצות הג'ל הן ברמה המקומית והן ברמה העולמית. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים ניתנים. לבסוף, נדונים אתגרי הניסוי והמלכודות הנפוצות, כולל הרלוונטיות שלהם למכניקת השלד התא.

Introduction

לתאים חיים יש תכונות מכניות ייחודיות. מלבד היכולת להגיב באופן פסיבי לכוחות יישומיים, הם מסוגלים גם לייצר כוחות באופן פעיל בתגובה לגירויים חיצוניים¹. מאפיינים אלה, החיוניים למגוון תהליכים תאיים, בעיקר במהלך תנועתיות התא, מיוחסים בעיקר לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, במיוחד שלד התא, שהוא ג'ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועים מולקולריים מיוזין וחלבונים נלווים. רשתות אקטומיוזין אלה מציגות תכונות ארגון עצמי והתכווצות מהותיות המונעות על ידי חלבונים מוטוריים מיוזין, אשר מצליבים את חוטי האקטין ויוצרים באופן פעיל לחצים מכניים ברשת המונעת על ידי הידרוליזה ATP².

מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים רבים נערכו כדי לחקור את התכונות החומריות של שלד^{ציטו-שלד 3}. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי⁴. משמעות הדבר היא כי בטווחי זמן קצרים, שלד הציטו-שלד מתנהג כחומר אלסטי, ובטווחי זמן ארוכים, הוא מתנהג כנוזל צמיגי עקב החלבונים הצולבים והניתוק המוטורי של מיוזין (וחיבור מחדש), המאפשר לרשת להתחלף באופן דינמי. עם זאת, במצבים רבים, המודל הוויסקו-אלסטי אינו יכול לתאר את תוצאות הניסוי, אשר תואמות יותר לתמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי, ובאופן כללי יותר, הציטופלסמה של התא המתוארת כחומר פעיל פורואלסטי ^5,6. שני מאפיינים עיקריים מאפיינים סוגים אלה של חומרים. (i) התכונה העיקרית הראשונה היא יצירת זרימה של הציטוזול החודר ("הממס") על פני נקבוביות הג'ל על ידי שיפועי התכווצות המונעים על ידי מנועי המיוזין, העומדים בבסיס תהליכים כגון בלימת תאים⁷, תנועתיות⁸ ותנודות בצורת תא⁹. הופעתם של זרמים ציטוסוליים כאלה יכולה להיות מקומית, עבור blebbing, או גלובלית, כמו בתנועתיות התא. במקרה האחרון, הלחצים המופעלים על ידי התכווצות בחלק האחורי של התא מניעים את זרימת הנוזל הציטוסולי לכיוון חזית התא, אשר מחדש את מאגר החלבונים הדרוש להרכבת למליפודיה⁸. (ii) התכונה העיקרית השנייה היא שהרפיית הלחצים היא דיפוזית ומאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל, , התלוי במודולוס האלסטי של הג'ל, נקבוביות הג'ל וצמיגות הממס⁵. קבוע הדיפוזיה הפורואלסטי קובע כמה מהר המערכת מגיבה ללחץ מופעל. קבועי דיפוזיה גבוהים יותר מתאימים לחלוקה מחדש מהירה יותר של מתח. זה, בתורו, קובע כמה זמן לוקח לנוזל הציטוסולי התוך-תאי להיות מופץ מחדש בתוך התא בעקבות לחץ מכני מופעל, בין אם הוא חיצוני או פנימי, כגון הלחצים התכווצות הפעילים הנוצרים על ידי מנועי מיוזין. דוגמאות אלה, אם כן, מראות כי המכניקה של השלד והציטוזול מצומדים זה לזה באופן הדוק ולא ניתן לטפל בהם בנפרד³.

מכיוון שתאים יכולים לווסת את התכונות המכניות שלהם במגוון דרכים, יחסי הגומלין בין מכניקת הרשת ודינמיקת זרימת הנוזלים עדיין אינם מובנים. גישה חלופית רבת עוצמה היא להשתמש במערכות משוחזרות במבחנה המאפשרות שליטה מלאה במרכיבים המיקרוסקופיים השונים ובפרמטרים של המערכת, מה שהופך את מערכות המודל הללו לאופטימליות לניתוח פיזיקלי^10,11. גישה זו יושמה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של הרכב חלבונים וגיאומטריה של המערכת על תנועתיות מבוססת אקטין 12,13,14,15,16,17,18, דפוס דו-ממדי של רשתות אקטומיוזין ^19,20,21,22ויחסי הגומלין בין התכווצות הרשת לבין דינמיקת זרימת הנוזלים של ג'לים אקטומיוזינים פורואלסטיים, העומדים במוקד מאמר זה²³.,

בכתב יד זה, הכנת רשתות אקטומיוזין אלסטיות מתכווצות של ממדים ניתנים לשליטה ותכונות חומריות נדונה בהתבסס על עבודתם של Ideses et ^al.23. הדינמיקה של הג'ל המתכווץ והממס המנוקז מנותחים ומכומתים, שבאמצעותם הוכח כי ניתן לתאר ג'לים אקטומיוזינים אלה כחומר פעיל פורואלסטי. חקר ההשפעה של צמיגות ממס על דיפוזיביות מתח מאשר עוד יותר את האופי הפורובלסטי של רשתות אלה. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים מסופקים. לבסוף, נדונים גם אתגרי הניסוי, המלכודות הנפוצות, והרלוונטיות של תוצאות הניסוי לשלד התא.

Protocol

1. טיפול במשטח זכוכית ופסיבציה:

הערה: חלק זה כולל שלושה שלבים עיקריים (ראה איור 1): (i) ניקוי והידרופיליזציה, (ii) סילניזציה, ו-(iii) פסיבציה של פני השטח.

1. ניקוי והידרופיליזציה
   1. השתמש בפתרון Piranha לניקוי משטח זכוכית.
      הערה: תמיסת פיראנה היא תערובת של 30% H 2 O 2 ו- 70% H₂SO₄ (טבלת חומרים). מטרתו העיקרית היא להסיר זיהומים אורגניים ממשטחי החלקה ולחשוף את קבוצות OH על משטח הזכוכית. באופן זה, משטח הזכוכית הופך הידרופילי.
   2. מניחים 10-12 #1.5 (22 מ"מ x 22 מ"מ) כיסויי זכוכית (טבלה של חומרים) במחזיק פוליטטרפלואוראתילן תוצרת בית (שטח בסיס: 5.5 ס"מ x 5.5 ס"מ). מעבירים את מחזיק הפוליטטרה-פלואוראתילן לכוס 400 מ"ל (טבלת חומרים), ודגרים עליו עם 300 מ"ל של תמיסת פיראנה למשך שעתיים. בצע שלב זה על קרח ובמכסה מנוע כימי.
      הערה: מוט הפוליטטרה-פלואוראתילן המוברג לבסיס המחזיק הוא באורך 12 ס"מ, ארוך יותר מהכוס (11 ס"מ), המאפשר העברה/משיכה בטוחה של המחזיק אל תמיסת פיראנה וממנה. מכיוון שתמיסת פיראנה עדיין יכולה להיות תגובתית מאוד וחמה מאוד, חובה לעצור את התגובה. הדרך הקלה ביותר לעצור את התגובה היא לשפוך את תמיסת פיראנה למי (ברז) כדי להשיג דילול פי 50 (לפחות). לאחר מכן ניתן להשליך את הפתרון בבטחה. לעולם אל תשמרו את תמיסת הפיראנה המשומשת בבקבוק זכוכית סגור – זה עלול להסתיים בפיצוץ בקבוק.
   3. מעבירים את מחזיק הפוליטטרה-פלואוראתילן לכוס נקייה מלאה במים טריים בזיקוק כפול (DDW) כדי לשטוף עודפי פיראנה מהכיסויים.
   4. מעבירים את הכד לאמבט סוניקציה (טבלת חומרים), ומסננים בעוצמה מלאה של 80 הרץ למשך 10 דקות ב-25°C. חזור על שלב זה פעמיים נוספות עם DDW טרי. השתמש ב- DDW טרי בכל פעם.
2. סילניזציה
   1. מעבירים את המחזיק לכוס נקייה (400 מ"ל) מלאה ב-300 מ"ל מתנול טהור (טבלת חומרים) ולאחר מכן לאמבט סוניקציה (טבלת חומרים). בצע סוניקציה ב-80Hz בעוצמה מלאה למשך 30 דקות ב-25°C.
   2. לאחר סוניקציה, להעביר את המחזיק לתוך תמיסת סילאן מוכן באמצעות 15 מ"ל של DDW, 3.1 מ"ל של חומצה אצטית (טבלה של חומרים), 340 מ"ל של מתנול, ו 7.6 מ"ל של סילאן ((3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane) (טבלה של חומרים). אוטמים את הכד עם פרפילם, ושומרים אותו במקרר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: ההכנה והטיפול בתמיסת הסילאן חייבים להתבצע במכסה מנוע כימי. לאחר שלב הסילניזציה, הכניסו את תמיסת הסילאן המשומשת (פסולת) לבקבוק זכוכית ייעודי בתוך מכסה המנוע הכימי.
   3. למחרת, להעביר את המחזיק לתוך נקייה מלא 300 מ"ל של מתנול טהור במשך 15 שניות. לאחר מכן, להעביר את המחזיק לתוך כד נקי, לא לפני ייבוש החלק התחתון של מחזיק polytetrafluoroethylene כדי להסיר מתנול עודף. מעבירים את הכד לתנור (טבלת חומרים) לייבוש כיסויי הזכוכית למשך 5 דקות בחום של 120°.
3. פסיבציה של פני השטח עם פולימר אינרטי
   1. השיגו פסיבציה של פני השטח על ידי דגירה של כיסויי הזכוכית בפולימר אינרטי (Table of Materials). עבור כל ניסוי, קחו שתי כיסויים והניחו אותן בצלוחית פטרי המצופה בשכבת פארפילם שנוקתה תחילה באתנול (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (טבלת חומרים).
   2. יש לדגור על כל כיסוי עם 1 מ"ל של 4 מ"ג·מ"ל⁻¹ 5 kDa משקל מולקולרי מתוקסי פוליאתילן גליקול מלימיד (mPEG-mal, M_w = 5 kDa) (טבלת חומרים) במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) (טבלת חומרים) למשך שעה אחת ב-22°C.
      הערה: הנחת החלקות הכיסוי על שכבת פרפילם הידרופובית מגבילה את תמיסת הפולימר PEG ההידרופילית למשטח כיסוי הזכוכית. זמן הדגירה הוא קריטי להשגת פסיבציה אופטימלית. יש להשתמש בזמני הדגירה הנעים בין 45 דקות לשעתיים. מעל זמן הדגירה הזה, משטח כיסוי הזכוכית יכול להתדרדר, מה שמוביל להידבקות חלבונים ולאובדן שקיפות.
   3. בסוף תהליך הדגירה, לשטוף כל כיסוי עם 5 מ"ל של DDW, ולייבש עם זרימה של N₂ (גז). אין לייבש את הכיסויים תחת שואב אבק. מכיוון שהכיסויים חייבים להישמר רטובים לאחר פסיבציה, הניחו מיד 1 מ"ל של 10 מ"ל טריס על המשטחים הפגילטים. יש להשתמש בכיסויים תוך שעתיים.
      הערה: השלבים השונים חייבים להתבצע בתא זרימה למינרי כדי למנוע זיהום משטח זכוכית.

2. טיהור חלבון

1. לטהר G-actin מאבקת אצטון שריר השלד ארנב באמצעות שיטת סינון ג'ל²⁴.
   1. טיהור אקטין לוקח שבוע אחד. שמור את G-actin מטוהר במאגר G (5 mM Tris pH 7.8, 0.01% NaN₃, 0.1 mM CaCl 2,_0.2 mM ATP ו- 1 mM DTT), ואחסן אותו על קרח. השתמש בפתרון תוך שבועיים.
      הערה: החליפו את הקרח כל כמה ימים.
   2. תייגו את האקטין בצבע פלואורסצנטי¹⁶ (טבלת חומרים). לטהר את GST-fascin מבוסס על השיטה של אונו et ^al.25. יש להקפיא במהירות הבזק את שני החלבונים בנוזל N₂, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
2. השתמש בפרוטוקול סטנדרטי כדי לטהר מיוזין II משריר השלד של ארנב²⁶. מאגר המניות של מיוזין II (דימרים) מטוהר כולל 10 mM Tris pH 7.4, 0.5 M KCl ו-35% w/v סוכרוז. הקפיאו במהירות הבזק את המיוזין בנוזל N₂, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
   הערה: הריכוז הגבוה של KCl שומר על מנועי המיוזין בצורה דימרית, בעוד שהאחוז הגבוה של סוכרוז מבטיח שפעילות המנועים לא תיפגע בעת הקפאה. השתמש פיפטה ייעודית לטיפול בנוזל צמיג בעת עבודה עם תמיסות מלאי מיוזין II (רשימת חומרים).
   1. תייגו את דימרים מיוזין II בצבע פלואורסצנטי (טבלה של חומרים) בזוגות של שאריות ציסטאין מהונדסות^19,27. השתמש במוטנט RLC RLC עוף למטרה זו²⁶. יש להקפיא במהירות הבזק את המיוזין II המסומן בנוזל N₂, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: הליך תיוג זה מבטיח שהמיוזין המסומן פעיל כחלבון מיוזין II הטבעי.
3. השתמש בספקטרופוטומטר UV-Vis (טבלת חומרים) כדי למדוד את ספיגת תמיסות החלבון, ולהסיק את ריכוזי החלבונים באמצעות חוק באר-למברט באמצעות מקדמי ההכחדה הבאים: G-actin (ε₂₉₀ = 26,460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1·cm−1), מיוזין II dimer (ε_{280 = 268,800} M−1·cm⁻¹), ומוטנט RLC A (ε₂₈₀ = 3,960 M−1·cm⁻¹)¹⁹.

3. הכנת מדגם

הערה: פילמרי מונומרים אקטין בנוכחות אגרגטים גדולים של מנועי מיוזין II ואת crosslinker פסיבי חזק fascin כדי לייצר רשתות אקטומיוזין אלסטי מכווץ מקרוסקופי^19,23. הוספת חרוזים פלואורסצנטיים לתמיסה מאפשרת מעקב אחר זרימת הממס במהלך התכווצות הג'ל.

1. תמיסת חלבון ("actomyosin")
   1. למעט G-actin, יש לשמור את החלבונים בטמפרטורה של -80°C באליציטוטים קטנים, ולהפשיר אותם בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. הנפח הכולל של תמיסת האקטומיוזין הוא 40 μL.
   2. הכן את התמיסה על ידי ערבוב 10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 1 mM ATP, מערכת התחדשות ATP (0.5 מ"ג·מ"ל−1 קריאטין קינאז ו-5 מ"מ קריאטין פוספט), 200 מיקרומטר EGTA (כלטים Ca²⁺ יונים), תמיסה נגד הלבנה (0.1 מ"ג·מ"ל−1 גלוקוז אוקסידאז, 0.018 מ"ג·מ"ל−1 קטלאז, ו-5 מ"ג·מ"ל⁻¹ גלוקוז), 5 מיקרומטר G-אקטין , 280 ננומטר GST-fascin ו-1.67 ננומטר מיוזין II. אחוז G-actin המסומן הוא 5% (אחוז מולרי).
      הערה: השתמש באחוז נמוך של G-actin המסומן כדי למנוע את הרוויה של האות הפלואורסצנטי בשלבים מתקדמים של התכווצות הג'ל.
2. הכנת אגרגטים מוטוריים של מיוזין II
   1. הוסף את מנועי המיוזין לתמיסת החלבון בצורה של אגרגטים. כדי ליצור אגרגטים גדולים של מיוזין (150 דימרים מיוזין / אגרגטים), דלל את תמיסת מלאי המיוזין עם 10 mM Tris pH 7.4 כדי להגיע לריכוז סופי של 25 mM KCl.
   2. שמור את תמיסת המיוזין המדוללת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן העבר אותה לקרח עד לשימוש. המנועים פעילים באופן מלא עד שעתיים.
3. מדידת זרימת הממס
   1. כדי לעקוב אחר זרימת הממס על פני נקבוביות הג'ל, הוסף את החרוזים הפלואורסצנטיים לתמיסת האקטומיוזין. להפחית את האינטראקציה בין החרוזים לבין רשת actomyosin על ידי פסיבציה של החרוזים. מעשית, לדגור 1 μL של חרוזים (טבלה של חומרים) עם 5 מיקרומטר G-actin במשך 20 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר עודף G-actin על ידי צנטריפוגה (טבלה של חומרים) (תנאים: 6,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C).
   2. חזור על שלב זה עם 10 מ"ג·מ"ל⁻¹ אלבומין בסרום בקר (BSA) (רשימת חומרים) כדי לחסום (אולי) את המשטח הלא מצופה שנותר. השתמש בחרוזים בדילול סופי של 1:10,000 vol/vol בניסויים.
      הערה: חשוב להתאים את קוטר החרוזים לגודל נקבוביות הג'ל כך שיחס גודל החרוז/נקבוביות יהיה <1 בכל השלבים.
4. השפעת צמיגות הפתרון
   1. שלוט בצמיגות התמיסה על ידי הוספת גליצרול (רשימת חומרים) לתמיסת האקטומיוזין. הוספת גליצרול באחוז משקל הנע בין 0% ל -34% גורמת לעלייה מקבילה בצמיגות התמיסה מ η ω ל 2.76 η ω, כאשר η _ω הוא צמיגות המים ב 20 ° C²⁸.
      הערה: חיוני להשתמש פיפטה ייעודית לטיפול בנוזל צמיג בעת עבודה עם גליצרול (טבלה של חומרים).

4. הפעלת ניסוי

1. טיפול במחזיק מדגם תוצרת בית
   1. קחו את אחד הכיסויים הפסיביים של PEG, הניחו עליו ספייסר פרפילם משומן והניחו אותו במחזיק הדגימה.
      הערה: ניתן להחליף את הספייסר הפרפילם בכל ספייסר.
2. הכנת פתרון actomyosin
   1. הכן את תמיסת האקטומיוזין על קרח בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי שילוב המרכיבים המיקרוסקופיים השונים, הוספת אגרגטים מוטוריים של מיוזין II והוספת EGTA אחרון. מערבבים היטב את התמיסה . התוספת של EGTA יוזמת פילמור רשת אקטומיוזין, אשר קובע את זמן תחילת הניסוי.
3. שים 1.1 μL של תמיסה זו על הכיסוי המותקן על המחזיק, והנח את הכיסוי השני על גבי. הברג את המחזיק כדי לאטום את הדגימה. תהליך זה לוחץ מעט את הטיפה, המאמצת צורה דמוית דיסק. קוטר הנפילה נע בין 2,800-3,000 מיקרומטר.
4. הניחו את מחזיק הדגימה על המיקרוסקופ, והתחילו את הרכישה. הכינו את המיקרוסקופ מראש כדי לקצר את זמן הרכישה הראשוני. זה בדרך כלל לוקח 1-2 דקות לאחר ערבוב כדי להתחיל את הדמיה דגימה.

5. טכניקות מיקרוסקופיה

1. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (Table of Materials) הנשלט על ידי תוכנה ייעודית (Table of Materials).
   1. השתמש בהגדלות נמוכות של 2.5x/0.075 מטרת Plan-NEOFLUAR (טבלה של חומרים) כדי להמחיש את כל אזור הג'ל ולעקוב אחר ההתכווצות המקרוסקופית שלו עם הזמן.
   2. השתמש במטרה 10x/0.3 Ph1 UPlanFL (טבלה של חומרים) כדי לאפיין את נקבוביות הרשת ומבנהה, ולעקוב אחר הארגון העצמי של הרשת והתכווצות עם הזמן.
      הערה: מטרה זו שימושית גם למיקום אגרגטים של מנוע מיוזין II בתוך הרשת ומעקב אחר תנועת חרוזים פלואורסצנטיים על פני נקבוביות הג'ל. ניתן להשתמש בהגדלות גבוהות יותר על חשבון שדה ראייה מופחת, שהוא משמעותי עוד יותר במצב הדמיה של צבע כפול (רשימת חומרים).
2. להלהיב את הדגימות ב 488 ננומטר (חרוזי אקטין / פלואורסצנטי) ו 561 ננומטר (אגרגטים מוטוריים מיוזין / חרוזים פלואורסצנטיים). קבל את התמונות במהירות של 100 אלפיות השנייה לפריים באמצעות תוכנה ייעודית (Table of Materials) במצב הזרמה באמצעות מצלמת EMCCD (ראשי תיבות של Electron Multipifying charge-coupled device) (Table of Materials).
   הערה: עוצמת המנורה הפלואורסצנטית (טבלת חומרים) צריכה להישמר בערך הנמוך ביותר האפשרי כדי למנוע רוויית אות במהלך התכווצות הרשת.
3. הדמיה סימולטנית של שני צבעים
   1. השתמש במצב זה לשתי מטרות: (i) זיהוי לוקליזציה של אגרגטים מוטוריים מיוזין בתוך רשת האקטין ו-(i) אפיון זרימת הממס החוצה פנימה והחוצה במהלך התכווצות הרשת.
   2. הרגש את מנועי האקטין והמיוזין II ב- 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, בהתאמה, והקלט את התמונות בו זמנית במצלמת EMCCD (רשימת חומרים) באמצעות מנגנון פליטה כפולה (רשימת חומרים). השתמש באותה מערכת הדמיה כדי לצלם בו-זמנית את ג'ל האקטין (488 ננומטר) ואת החרוזים הפלואורסצנטיים (561 ננומטר).

תוצאות

בכל ניסוי נעשה שימוש בשני כיסויי זכוכית. כיסויי הזכוכית מנוקים ועוברים פסיבציה עם פולימרי PEG. פסיבציה חיונית למניעת היצמדות החלבונים המסיסים למשטחי הזכוכית בשלבי הניסוי המוקדמים ולמזעור האינטראקציה של הרשת המתכווצת עם דפנות הזכוכית. כישלון להשיג פסיבציה טובה יכול להוביל להתכווצות לא יע...

Discussion

כאן, גישה במבחנה משמשת כדי לאפיין את המכניקה של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל של שלד התא, ובאופן כללי יותר, של הציטופלסמה של התא, אשר הוכח להתנהג כחומר פורואלסטי ^3,5. הריאולוגיה של שלד התא (ציטופלסמה) מאופיינת בקבוע דיפוזיה פורואלסטי, המכתיב כמה זמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)