A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

Resumo

Neste trabalho, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para estudar a poroelasticidade de géis de actomiosina sob condições controladas. A dinâmica do gel de actomiosina e do solvente incorporado é quantificada, através da qual a poroelasticidade da rede é demonstrada. Também discutimos os desafios experimentais, armadilhas comuns e relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

Resumo

As células podem mudar ativamente suas formas e se tornar móveis, uma propriedade que depende de sua capacidade de reorganizar ativamente sua estrutura interna. Essa característica é atribuída às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, notadamente o citoesqueleto da actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores de miosina e proteínas acessórias que exibem propriedades de contração intrínsecas. A visão usualmente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico. No entanto, esse modelo nem sempre pode explicar os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto como um material ativo poroelástico - uma rede elástica embebida com citosol. Gradientes de contratilidade gerados pelos motores da miosina conduzem o fluxo do citosol através dos poros do gel, o que infere que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados. Uma das principais características da poroelasticidade é a relaxação difusiva das tensões na rede, caracterizada por uma constante de difusão efetiva que depende do módulo elástico do gel, porosidade e viscosidade do citosol (solvente). Como as células têm muitas maneiras de regular sua estrutura e propriedades materiais, nossa compreensão atual de como a mecânica do citoesqueleto e a dinâmica do fluxo citosol são acopladas permanece pouco compreendida. Aqui, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para caracterizar as propriedades materiais de géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo para o citoesqueleto celular. A contração do gel é impulsionada pela contratilidade motora da miosina, que leva ao surgimento de um fluxo do solvente penetrante. O artigo descreve como preparar esses géis e executar experimentos. Também discutimos como medir e analisar o fluxo de solvente e a contração do gel em escala local e global. As várias relações de escala usadas para quantificação de dados são dadas. Finalmente, os desafios experimentais e as armadilhas comuns são discutidos, incluindo sua relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

Introdução

As células vivas têm propriedades mecânicas únicas. Além da capacidade de reagir passivamente às forças aplicadas, elas também são capazes de gerar ativamente forças em resposta a estímulos externos¹. Essas características, essenciais para uma variedade de processos celulares, notadamente durante a motilidade celular, são primariamente atribuídas às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, especialmente do citoesqueleto de actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina e proteínas acessórias. Essas redes de actomiosinas exibem propriedades intrínsecas de auto-organização e contração impulsionadas pelas proteínas motoras da miosina, que reticulam os filamentos de actina e geram ativamente tensões mecânicas na rede alimentada pela hidrólise de ATP².

Inúmeros estudos experimentais e teóricos têm sido realizados para estudar as propriedades materiais do citoesqueleto³. A visão comumente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico⁴. Isso significa que, em escalas de tempo curtas, o citoesqueleto se comporta como um material elástico e, em longas escalas de tempo, comporta-se como um fluido viscoso devido às proteínas de reticulação e ao descolamento motor (e religação) da miosina, o que permite que a rede se transforme dinamicamente. Em muitas situações, entretanto, o modelo viscoelástico não consegue descrever os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto e, de modo mais geral, o citoplasma da célula sendo descrito como um material ativo poroelástico ^5,6. Duas características principais caracterizam esses tipos de materiais. (i) A primeira característica principal é a geração de um fluxo do citosol penetrante (o "solvente") através dos poros do gel por gradientes de contratilidade impulsionados pelos motores da miosina, que está subjacente a processos como o blebbing celular⁷, a motilidade⁸ e as oscilações da forma celular⁹. O surgimento desses fluxos citosólicos pode ser local, por blebbing, ou global, como na motilidade celular. Neste último caso, as tensões contráteis aplicadas na parte traseira da célula direcionam o fluxo do fluido citosólico em direção à frente celular, o que repõe o pool proteico necessário para a montagem dos lamelípodes⁸. (ii) A segunda característica principal é que a relaxação das tensões é difusiva e é caracterizada por uma constante de difusão efetiva, que depende do módulo elástico do gel, da porosidade do gel e da viscosidade do solvente⁵. A constante de difusão poroelástica determina a rapidez com que o sistema responde a uma tensão aplicada. Constantes de maior difusão correspondem a uma redistribuição mais rápida das tensões. Isso, por sua vez, determina quanto tempo leva para que o líquido citosólico intracelular seja redistribuído dentro da célula após o estresse mecânico aplicado, seja ele externo ou interno, como os estresses contráteis ativos gerados pelos motores da miosina. Esses exemplos, portanto, demonstram que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados e não podem ser tratados separadamente³.

Como as células podem regular suas propriedades mecânicas de várias maneiras, a interação entre a mecânica da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos permanece pouco compreendida. Uma abordagem alternativa poderosa é a utilização de sistemas reconstituídos in vitro que permitam o controle total dos vários constituintes microscópicos e dos parâmetros do sistema, o que torna esses sistemas-modelo ótimos para análises físicas^10,11. Esta abordagem tem sido empregada com sucesso para estudar o impacto da composição proteica e da geometria do sistema na motilidade baseada em actina 12,13,14,15,16,17,18, na padronização 2D de redes de actomiosinas ^19,20,21,22, e a interação entre a contratilidade da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos de géis de actomiosina poroelásticos, que é o foco deste artigo²³.

Neste manuscrito, a preparação de redes de actomiosina elástica contrátil de dimensões controláveis e propriedades do material é discutida com base no trabalho de Ideses et ^al.23. A dinâmica do gel de contração e do solvente drenado é analisada e quantificada, através da qual é demonstrado que estes géis de actomiosina podem ser descritos como um material ativo poroelástico. O estudo do efeito da viscosidade do solvente na difusividade de tensões confirma ainda mais a natureza poroelástica dessas redes. As várias relações de dimensionamento usadas para quantificação de dados são fornecidas. Finalmente, os desafios experimentais, as armadilhas comuns e a relevância dos resultados experimentais para o citoesqueleto celular também são discutidos.

Protocolo

1. Tratamento da superfície do vidro e passivação:

NOTA: Esta seção inclui três etapas principais (consulte a Figura 1): (i) limpeza e hidrofilização, (ii) silanização e (iii) passivação superficial.

1. Limpeza e hidrofilização
   1. Use solução de Piranha para limpeza de superfícies de vidro.
      OBS: Solução de piranha é uma mistura de 30% H 2 O 2 e 70% H₂SO₄ (Tabela de Materiais). Seu principal objetivo é remover contaminações orgânicas de superfícies de deslizamento de cobertura e expor os grupos OH na superfície de vidro. Desta forma, a superfície de vidro torna-se hidrofílica.
   2. Coloque 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) tampas de vidro (Tabela de Materiais) em um suporte de politetrafluoretileno caseiro (área da base: 5,5 cm x 5,5 cm). Transferir o suporte de politetrafluoretileno para um copo de 400 mL (Tabela de Materiais) e incubá-lo com 300 mL de solução de Piranha por 2 h. Faça este passo no gelo e em uma capa química.
      NOTA: O polo de politetrafluoretileno parafusado à base do suporte tem 12 cm de comprimento, mais longo que o copo (11 cm), o que permite a transferência/arrancamento seguro do suporte de/para a solução de Piranha. Como a solução de piranha ainda pode ser altamente reativa e muito quente, é imperativo parar a reação. A maneira mais fácil de parar a reação é despejar a solução de piranha em água (torneira) para obter uma diluição de 50x (pelo menos). A solução pode então ser descartada com segurança. Nunca guarde a solução de piranha usada em uma garrafa de vidro fechada – isso pode terminar em uma explosão de garrafa.
   3. Transfira o suporte de politetrafluoretileno para um copo limpo preenchido com água fresca bidestilada (DDW) para lavar o excesso de piranha das lamínulas.
   4. Transfira o copo para um banho de sonicação (Tabela de Materiais) e sonice a 80 Hz na potência máxima por 10 min a 25 °C. Repita esta etapa mais duas vezes com DDW novo. Use DDW fresco a cada vez.
2. Silanização
   1. Transfira o suporte para um copo limpo (400 mL) preenchido com 300 mL de metanol puro (Tabela de Materiais) e, em seguida, para um banho de sonicação (Tabela de Materiais). Sonicate a 80 Hz na potência máxima durante 30 min a 25 °C.
   2. Após a sonicação, transferir o suporte para uma solução de silano preparada com 15 mL de DDW, 3,1 mL de ácido acético (Tabela de Materiais), 340 mL de metanol e 7,6 mL de silano ((3-Mercaptopropil) trimetoxissilano) (Tabela de Materiais). Sele o copo com parafilme e mantenha-o no frigorífico a 4 °C durante a noite.
      NOTA: A preparação e o manuseamento da solução de silano devem ser efectuados numa capela química. Após a etapa de silanização, coloque a solução de silano usada (resíduo) em uma garrafa de vidro dedicada dentro da coifa química.
   3. No dia seguinte, transfira o suporte para um copo limpo preenchido com 300 mL de metanol puro por 15 s. Em seguida, transfira o suporte para um copo limpo, não antes de secar o fundo do suporte de politetrafluoretileno para remover o excesso de metanol. Transfira o copo para o forno (Tabela de Materiais) para secar as lamínulas de vidro por 5 min a 120 °C.
3. Passivação superficial com polímero inerte
   1. Consiga a passivação da superfície incubando as lamínulas de vidro com um polímero inerte (Tabela de Materiais). Para cada experimento, pegue duas lamínulas e coloque-as em uma placa de Petri revestida com uma camada de parafilme inicialmente limpa com etanol (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (Tabela de Materiais).
   2. Incubar cada lamínula com 1 ml de uma maleimida de metoxi-polietilenoglicol de peso molecular de 4 mg·mL⁻¹ 5 kDa (mPEG-mal, M_w = 5 kDa) (Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Tabela de Materiais) por 1 h a 22 °C.
      NOTA: A colocação das lamínulas sobre uma camada de parafilme hidrofóbico confina a solução de polímero de PEG hidrofílico à superfície de lamínula de vidro. O tempo de incubação é crítico para alcançar a passivação ideal. Use tempos de incubação que variam entre 45 min e 2 h. Acima desse tempo de incubação, a superfície da tampa de vidro pode se deteriorar, levando à adesão de proteínas e à perda de transparência.
   3. Ao final do processo de incubação, enxaguar cada lamínula com 5 mL de DDW e secar com fluxo de N₂ (gás). Não seque as lamínulas sob vácuo. Como as lamínulas devem ser mantidas molhadas após a passivação, coloque imediatamente 1 mL de Tris 10 mM nas superfícies peguiladas. Use as tampas dentro de 2 h.
      NOTA: As várias etapas devem ser executadas em uma câmara de fluxo laminar para evitar a contaminação da superfície do vidro.

2. Purificação de proteínas

1. Purificar a G-actina do pó de acetona do músculo esquelético de coelhos utilizando o método de filtração em gel²⁴.
   1. A purificação da actina leva 1 semana. Manter a G-actina purificada em tampão G (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN₃, 0,1 mM CaCl 2,_0,2 mM ATP e 1 mM TDT) e armazená-la no gelo. Use a solução dentro de 2 semanas.
      NOTA: Substitua o gelo a cada dois dias.
   2. Rotular a actina com um corante fluorescente modificado por maleimida¹⁶ (Tabela de Materiais). Purificar o GST-fascin com base no método de Ono et ^al.25. Congelar ambas as proteínas em N líquido₂ e armazenar a -80 °C.
2. Utilizar um protocolo padrão para purificar a miosina II do músculo esquelético de^{coelhos 26}. O tampão de estoque de miosina II purificada (dímeros) inclui 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl e 35% p/v de sacarose. Congelar a miosina em N líquido₂ e armazenar a -80 °C.
   NOTA: A alta concentração de KCl mantém os motores de miosina em uma forma dimérica, enquanto a alta porcentagem de sacarose garante que a atividade dos motores não seja prejudicada após o congelamento. Use uma pipeta dedicada para manuseio de fluidos viscosos ao trabalhar com soluções estoque de miosina II (Tabela de Materiais).
   1. Marcar os dímeros de miosina II com um corante fluorescente (Tabela de Materiais) em pares de resíduos de cisteína projetados^19,27. Use uma moela de frango RLC mutante A para esse fim²⁶. Congelar a miosina II marcada em N líquido₂ e armazenar a -80 °C.
      NOTA: Este procedimento de marcação garante que a miosina marcada é ativa como a proteína nativa da miosina II.
3. Use um espectrofotômetro UV-Vis (Tabela de Materiais) para medir a absorbância das soluções proteicas estoque e deduzir as concentrações de proteínas com a lei de Beer-Lambert usando os seguintes coeficientes de extinção: G-actina (ε₂₉₀ = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), dímero de miosina II (ε_{280 = 268.800} M−1·cm⁻¹), e o mutante RLC A (ε₂₈₀ = 3.960 M−1·cm⁻¹)¹⁹.

3. Preparo da amostra

OBS: Polimerizar os monômeros de actina na presença de grandes agregados de motores de miosina II e a forte fascina passiva reticulante para produzir macroscopicamente redes de actomiosina elástica^{contráteis 19,23}. A adição de esferas fluorescentes à solução permite rastrear o fluxo de solvente durante a contração do gel.

1. Solução proteica ("actomiosina")
   1. Com exceção da G-actina, mantenha as proteínas a -80°C em pequenas alíquotas e descongele-as a 37 °C antes do uso. O volume total da solução de actomiosina é de 40 μL.
   2. Preparar a solução misturando 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl₂, 25 mM KCl, 1 mM ATP, um sistema regenerador de ATP (0,5 mg·mL−1 creatina quinase e 5 mM creatina fosfato), 200 μM EGTA (quelatos Ca²⁺ íons), uma solução antibranqueadora (0,1 mg·mL⁻1 glicose oxidase, 0,018 mg·mL−1 catalase e 5 mg·mL⁻¹ glicose), 5 μM G-actina, 280 nM GST-facina e 1,67 nM miosina II. A porcentagem de G-actina marcada é de 5% (porcentagem molar).
      NOTA: Use uma baixa porcentagem de G-actina marcada para evitar a saturação do sinal fluorescente nos estágios avançados de contração do gel.
2. Preparo de agregados motores de miosina II
   1. Adicione os motores de miosina à solução proteica sob a forma de agregados. Para formar grandes agregados de miosina (150 dímeros de miosina/agregado), diluir a solução estoque de miosina com Tris 10 mM pH 7,4 para atingir uma concentração final de 25 mM KCl.
   2. Manter a solução de miosina diluída durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR) e, em seguida, transferi-la para o gelo até à utilização. Os motores ficam totalmente ativos por até 2 h.
3. Medição do fluxo de solventes
   1. Para rastrear o fluxo de solvente através dos poros do gel, adicione as esferas fluorescentes à solução de actomiosina. Reduza a interação entre as contas e a rede de actomiosina, passivando as contas. Praticamente, incubar 1 μL de contas (Tabela de Materiais) com 5 μM de G-actina por 20 min no TR e, em seguida, remover o excesso de G-actina por centrifugação (Tabela de Materiais) (condições: 6.000 x g por 5 min a 4 °C).
   2. Repita esta etapa com 10 mg·mL⁻¹ de albumina de soro bovino (BSA) (Tabela de Materiais) para bloquear (possivelmente) a superfície restante não revestida. Utilizar as esferas em uma diluição final de 1:10.000 vol/vol nos experimentos.
      NOTA: É importante adaptar o diâmetro das contas ao tamanho dos poros do gel de modo que a relação entre o tamanho do talão e dos poros seja de <1 em todas as fases.
4. Efeito da viscosidade da solução
   1. Controle a viscosidade da solução adicionando glicerol (Tabela de Materiais) à solução de actomiosina. A adição de glicerol a uma percentagem ponderal que varia entre 0% e 34% induz um aumento correspondente na viscosidade da solução de η ω para 2,76 η ω, onde η _ω é a viscosidade da água a 20 °C²⁸.
      NOTA: É essencial usar uma pipeta dedicada para o manuseio de fluidos viscosos ao trabalhar com glicerol (Tabela de Materiais).

4. Executando um experimento

1. Manuseio caseiro do porta-amostras
   1. Pegue uma das lamínulas passivadas por PEG, coloque um espaçador de parafilme untado sobre ela e coloque-a no suporte da amostra.
      NOTA: Pode-se substituir o espaçador de parafilme por qualquer espaçador.
2. Preparação da solução de actomiosina
   1. Preparar a solução de actomiosina sobre gelo em um tubo de microcentrífuga incorporando os vários constituintes microscópicos, adicionando os agregados motores de miosina II e adicionando EGTA por último. Misture bem a solução. A adição de EGTA inicia a polimerização da rede de actomiosina, que define o tempo de início do experimento.
3. Colocar 1,1 μL dessa solução na lamínula montada no suporte e colocar a segunda lamínula por cima. Rosqueie o suporte para selar a amostra. Esse processo aperta levemente a gota, que adota uma forma de disco. Os diâmetros de queda variam entre 2.800-3.000 μm.
4. Coloque o porta-amostras no microscópio e inicie a aquisição. Preparar o microscópio com antecedência para reduzir o tempo de aquisição inicial. Normalmente, leva 1-2 minutos após a mistura para iniciar a imagem da amostra.

5. Técnicas de microscopia

1. Imageie as amostras usando um microscópio fluorescente invertido (Tabela de Materiais) controlado por software dedicado (Tabela de Materiais).
   1. Utilizar aumentos baixos de 2,5x/0,075 objetiva Plan-NEOFLUAR (Tabela de Materiais) para visualizar toda a área do gel e acompanhar sua contração macroscópica com o tempo.
   2. Use uma objetiva UPlanFL de 10x/0,3 Ph1 (Tabela de Materiais) para caracterizar a porosidade e a estrutura da rede e acompanhar a auto-organização e contração da rede com o tempo.
      NOTA: Este objetivo também é útil para localizar os agregados motores de miosina II dentro da rede e acompanhar o movimento de esferas fluorescentes através dos poros do gel. Ampliações mais altas podem ser usadas às custas de um campo de visão reduzido, o que é ainda mais significativo no modo de imagem de duas cores (Tabela de Materiais).
2. Excitar as amostras a 488 nm (actina/esferas fluorescentes) e 561 nm (agregados motores de miosina/esferas fluorescentes). Adquira as imagens a 100 ms por quadro com software dedicado (Tabela de Materiais) no modo de streaming com uma câmera EMCCD (Dispositivo de Carga Acoplada à Multiplicação de Elétrons) (Tabela de Materiais).
   NOTA: A intensidade da lâmpada fluorescente (Tabela de Materiais) deve ser mantida no menor valor possível para evitar a saturação do sinal durante a contração da rede.
3. Imagem bicolor simultânea
   1. Use este modo para dois propósitos: (i) detectar a localização dos agregados motores de miosina dentro da rede de actina e (i) caracterizar o fluxo de solvente para fora dentro e fora durante a contração da rede.
   2. Excitar os motores de actina e miosina II a 488 nm e 561 nm, respectivamente, e gravar as imagens simultaneamente em uma câmera EMCCD (Tabela de Materiais) usando um aparelho de dupla emissão (Tabela de Materiais). Use o mesmo sistema de imagem para obter imagens simultâneas do gel de actina (488 nm) e das esferas fluorescentes (561 nm).

Resultados

Duas lamínulas de vidro são usadas por experimento. As lamínulas de vidro são limpas e passivadas com polímeros PEG. A passivação é essencial para impedir que as proteínas solubilizadas aderam às superfícies de vidro nos estágios experimentais iniciais e para minimizar a interação da rede de contração com as paredes de vidro. A falha em alcançar uma boa passivação pode levar a uma contração ineficiente e, em casos extremos, pode até inibir a formação da rede de actina.

...

Discussão

Aqui, uma abordagem in vitro é empregada para caracterizar a mecânica dos géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo do citoesqueleto celular e, mais geralmente, do citoplasma celular, que tem demonstrado se comportar como um material poroelástico ^3,5. A reologia do citoesqueleto celular (citoplasma) tem sido caracterizada por uma constante de difusão poroelástica, que determina quanto tempo leva para o líquido citosólico intracelu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)