Механика (поро-)эластичных сократительных сетей актомиозина как модельная система клеточного цитоскелета

Резюме

В этой работе используется подход восстановления in vitro для изучения пороэластичности гелей актомиозина в контролируемых условиях. Количественно определена динамика геля актомиозина и встроенного растворителя, с помощью которой продемонстрирована сетчатая пороупругость. Мы также обсуждаем экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и отношение к механике клеточного цитоскелета.

Аннотация

Клетки могут активно менять свою форму и становиться подвижными, что зависит от их способности активно реорганизовывать свою внутреннюю структуру. Эта особенность объясняется механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, в частности, цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, миозиновых моторов и вспомогательных белков, которые проявляют внутренние свойства сокращения. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал. Однако эта модель не всегда может объяснить экспериментальные результаты, которые больше согласуются с картиной, описывающей цитоскелет как пороупругий активный материал — эластичную сеть, встроенную в цитозоль. Градиенты сократимости, генерируемые миозиновыми моторами, управляют потоком цитозоля через поры геля, что делает вывод о том, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана. Одной из основных особенностей пороупругости является диффузионная релаксация напряжений в сети, характеризующаяся эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости и вязкости цитозоля (растворителя). Поскольку клетки имеют много способов регулировать свою структуру и свойства материала, наше нынешнее понимание того, как связаны механика цитоскелета и динамика потока цитозолей, остается плохо изученным. Здесь используется подход восстановления in vitro для характеристики свойств материала пороэластичных гелей актомиозина в качестве модельной системы для клеточного цитоскелета. Сокращение геля обусловлено моторной сократимостью миозина, что приводит к возникновению потока проникающего растворителя. В статье описано, как приготовить эти гели и провести эксперименты. Мы также обсудим, как измерять и анализировать поток растворителя и сжатие геля как в локальном, так и в глобальном масштабе. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, обсуждаются экспериментальные проблемы и распространенные ошибки, в том числе их отношение к механике клеточного цитоскелета.

Введение

Живые клетки обладают уникальными механическими свойствами. Помимо способности пассивно реагировать на приложенные силы, они также способны активно генерировать силы в ответ на внешние раздражители¹. Эти характеристики, которые необходимы для различных клеточных процессов, особенно во время подвижности клеток, в первую очередь объясняются механическими и динамическими свойствами клеточного цитоскелета, особенно цитоскелета актомиозина, который представляет собой активный гель полярных актиновых филаментов, молекулярных моторов миозина и вспомогательных белков. Эти актомиозиновые сети проявляют присущие им свойства самоорганизации и сокращения, обусловленные моторными белками миозина, которые сшивают актиновые филаменты и активно генерируют механические напряжения в сети, подпитываемой гидролизом АТФ².

Были проведены многочисленные экспериментальные и теоретические исследования по изучению свойств материала цитоскелета³. Общепринятая точка зрения состоит в том, что цитоскелет ведет себя как вязкоупругий материал⁴. Это означает, что на коротких временных масштабах цитоскелет ведет себя как эластичный материал, а на длительных временных масштабах он ведет себя как вязкая жидкость из-за сшивающих белков и моторной отслойки миозина (и повторного прикрепления), что позволяет сети динамически вращаться. Однако во многих ситуациях вязкоупругая модель не может описать экспериментальные результаты, которые в большей степени согласуются с картиной, описывающей цитоскелет и, в более общем плане, цитоплазму клетки, описываемую как пороупругий активный материал ^5,6. Эти типы материалов характеризуются двумя основными особенностями. (i) Первой основной особенностью является генерация потока проникающего цитозоля («растворителя») через поры геля за счет градиентов сократительной способности, управляемых моторами миозина, что лежит в основе таких процессов, как клеточный блеббинг⁷, подвижность⁸ и колебания формы клетки⁹. Возникновение таких цитозольных потоков может быть локальным, для блеббинга, или глобальным, как при подвижности клеток. В последнем случае сократительные напряжения в задней части клетки направляют поток цитозольной жидкости к передней части клетки, что пополняет белковый пул, необходимый для сборки ламеллиподий⁸. (ii) Вторая основная особенность заключается в том, что релаксация напряжений является диффузионной и характеризуется эффективной константой диффузии, которая зависит от модуля упругости геля, пористости геля и вязкости растворителя⁵. Константа пороупругой диффузии определяет, насколько быстро система реагирует на приложенное напряжение. Более высокие константы диффузии соответствуют более быстрому перераспределению напряжений. Это, в свою очередь, определяет, сколько времени требуется внутриклеточной цитозольной жидкости для перераспределения внутри клетки после приложенного механического напряжения, будь то внешнего или внутреннего, такого как активные сократительные напряжения, генерируемые миозиновыми моторами. Эти примеры, таким образом, демонстрируют, что механика цитоскелета и цитозоля тесно связана и не может рассматриваться отдельно³.

Поскольку ячейки могут регулировать свои механические свойства различными способами, взаимодействие между сетевой механикой и динамикой потока жидкости остается плохо изученным. Мощным альтернативным подходом является использование восстановленных in vitro систем, которые позволяют полностью контролировать различные микроскопические компоненты и параметры системы, что делает эти модельные системы оптимальными для физического анализа^10,11. Этот подход был успешно использован для изучения влияния белкового состава и геометрии системы на актиновую подвижность 12,13,14,15,16,17,18, 2D-паттернирование актомиозиновых сетей 19,20,21,22 , а также взаимодействие между сократимостью сети и динамикой потока жидкости пороэластичных гелей актомиозина, которое находится в центре внимания данной статьи²³.

В этой рукописи обсуждается получение сократительных эластичных сетей актомиозина контролируемых размеров и свойств материала на основе работы Ideses et ^al.23. Проанализирована и количественно определена динамика сжимающегося геля и дренированного растворителя, с помощью которой продемонстрировано, что эти гели актомиозина могут быть описаны как пороупругий активный материал. Изучение влияния вязкости растворителя на диффузию напряжений еще раз подтверждает пороупругую природу этих сетей. Приведены различные соотношения масштабирования, используемые для количественной оценки данных. Наконец, также обсуждаются экспериментальные проблемы, распространенные ошибки и актуальность экспериментальных результатов для клеточного цитоскелета.

протокол

1. Обработка и пассивация поверхности стекла:

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел включает три основных этапа (см. рис. 1): (i) очистка и гидрофилизация, (ii) силанизация и (iii) пассивация поверхности.

1. Очистка и гидрофилизация
   1. Используйте раствор Piranha для очистки поверхности стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор пираньи представляет собой смесь 30% Н2О2 и 70%_Н2СО4 (Таблица материалов). Его основная цель - удалить органические загрязнения с поверхностей покровного стекла и обнажить группы ОН на поверхности стекла. Таким образом, поверхность стекла становится гидрофильной.
   2. Поместите 10-12 #1,5 (22 мм x 22 мм) стеклянные покровные стекла (Таблица материалов) в самодельный держатель из политетрафторэтилена (площадь основания: 5,5 см x 5,5 см). Переложите держатель политетрафторэтилена в стакан объемом 400 мл (таблица материалов) и инкубируйте его с 300 мл раствора пираньи в течение 2 часов. Проделайте этот шаг на льду и в химическом колпаке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полюс из политетрафторэтилена, привинченный к основанию держателя, имеет длину 12 см, что длиннее, чем стакан (11 см), что позволяет безопасно переносить/вытаскивать держатель в/из раствора Piranha. Поскольку раствор Пираньи все еще может быть высокореакционноспособным и очень горячим, необходимо обязательно остановить реакцию. Самый простой способ остановить реакцию - это залить раствор Пираньи в (водопроводную) воду, чтобы добиться 50-кратного разбавления (как минимум). После этого раствор можно смело выбросить. Никогда не храните использованный раствор Piranha в закрытой стеклянной бутылке - это может закончиться взрывом бутылки.
   3. Переложите держатель политетрафторэтилена в чистый стакан, наполненный свежей двойной дистиллированной водой (DDW), чтобы смыть излишки пираньи с покровных стекол.
   4. Перенесите стакан в ванну для обработки ультразвуком (Таблица материалов) и обработайте ультразвуком на частоте 80 Гц на полной мощности в течение 10 минут при 25 °C. Повторите этот шаг еще два раза со свежим DDW. Используйте свежий DDW каждый раз.
2. Силанизация
   1. Перенесите держатель в чистый стакан (400 мл), заполненный 300 мл чистого метанола (Таблица материалов), а затем в ванну для обработки ультразвуком (Таблица материалов). Обработка ультразвуком при 80 Гц на полной мощности в течение 30 минут при 25 °C.
   2. После обработки ультразвуком переведите держатель в силановый раствор, приготовленный с использованием 15 мл DDW, 3,1 мл уксусной кислоты (таблица материалов), 340 мл метанола и 7,6 мл силана ((3-меркаптопропил) триметоксисилана) (таблица материалов). Запечатайте стакан парапленкой и храните его в холодильнике при температуре 4 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление и обработка раствора силана должны выполняться в химическом колпаке. После этапа силанизации поместите использованный раствор силана (отходы) в специальную стеклянную бутылку в химическом колпаке.
   3. На следующий день переложите держатель в чистый стакан, наполненный 300 мл чистого метанола на 15 с. Затем переложите держатель в чистый стакан, не раньше, чем высушите дно держателя из политетрафторэтилена, чтобы удалить излишки метанола. Перенесите стакан в духовку (Таблица материалов), чтобы высушить стеклянные покровные стекла в течение 5 минут при температуре 120 °C.
3. Пассивация поверхности инертным полимером
   1. Добейтесь пассивации поверхности путем инкубации стеклянных покровных стекол с инертным полимером (Таблица материалов). Для каждого эксперимента возьмите два покровных стекла и поместите их в чашку Петри, покрытую слоем парапленки, первоначально очищенным этанолом (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 об./об.) (Таблица материалов).
   2. Инкубируйте каждое покровное стекло с 1 мл метоксиполиэтиленгликоля малеимида с молекулярной массой 4 мг·мл-1 5 кДа (^mPEG-mal , M_w = 5 кДа) (таблица материалов) в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) (таблица материалов) в течение 1 ч при 22 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение покровных стекол на гидрофобном слое парапленки ограничивает гидрофильный полимерный раствор ПЭГ поверхностью стеклянного покровного стекла. Время инкубации имеет решающее значение для достижения оптимальной пассивации. Используйте время инкубации от 45 минут до 2 часов. По истечении этого времени инкубации поверхность стеклянных покровных стекол может испортиться, что приведет к адгезии белка и потере прозрачности.
   3. В конце процесса инкубации промойте каждое покровное стекло 5 мл DDW и высушите с потоком N₂ (газ). Не сушите покровные стекла под пылесосом. Поскольку покровные стекла должны оставаться влажными после пассивации, немедленно нанесите 1 мл 10 мМ Tris на пегилированные поверхности. Используйте покровные стекла в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные этапы должны выполняться в камере с ламинарным потоком, чтобы предотвратить загрязнение поверхности стекла.

2. Очистка белка

1. Очистите G-актин из порошка ацетона скелетных мышц кролика, используя метод^{гель-фильтрации 24}.
   1. Очищение актина занимает 1 неделю. Храните очищенный G-актин в G-буфере (5 мМ Tris pH 7,8, 0,01% NaN₃, 0,1 мМ CaCl2,_0,2 мМ АТФ и 1 мМ DTT) и храните его на льду. Используйте раствор в течение 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте лед каждые пару дней.
   2. Пометьте актин флуоресцентным красителем, модифицированным малеимидом¹⁶ (Таблица материалов). Очистите GST-фашин по методу Ono et ^al.25. Заморозьте оба белка в жидкости N₂ и храните при температуре -80 °C.
2. Используйте стандартный протокол для очистки миозина II из скелетных мышц кролика²⁶. Буфер с очищенным запасом миозина II (димеры) включает 10 мМ Tris pH 7,4, 0,5 М KCl и 35% сахарозы. Миозин заморозить во время вспышки в жидкости N₂ и хранить при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая концентрация KCl удерживает моторы миозина в димерной форме, в то время как высокий процент сахарозы гарантирует, что активность двигателей не снижается при замерзании. Используйте специальную пипетку для работы с вязкими жидкостями при работе со стоковыми растворами миозина II (таблица материалов).
   1. Маркируйте димеры миозина II флуоресцентным красителем (Таблица материалов) по парам сконструированных остатков цистеина^19,27. Используйте для этой цели мутант RLC A^{куриного желудка 26}. Заморозьте меченый миозин II в жидкости N₂ и храните при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура маркировки гарантирует, что меченый миозин активен как нативный белок миозина II.
3. Используйте УФ-ВИД спектрофотометр (таблица материалов) для измерения поглощения исходных белковых растворов и выведите концентрации белка с помощью закона Бера-Ламберта, используя следующие коэффициенты экстинкции: G-актин (ε₂₉₀ = 26 460 М-1 · см -1), GST-фасин (ε 280 = 99 330 М-1 · ^см-1), димер миозина II (ε_{280 = 268 800} М-1 · ^см-1), и мутант RLC A (ε₂₈₀ = 3,960 M−1·cm⁻¹)¹⁹.

3. Пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Полимеризуйте актиновые мономеры в присутствии больших агрегатов моторов миозина II и сильного пассивного сшивающего фасина для получения макроскопически сократительных эластичных сетей актомиозина^19,23. Добавление флуоресцентных шариков в раствор позволяет отслеживать поток растворителя во время сжатия геля.

1. Раствор белка («актомиозина»)
   1. За исключением G-актина, храните белки при -80 ° C в небольших аликвотах и размораживайте их при 37 ° C перед использованием. Общий объем раствора актомиозина составляет 40 мкл.
   2. Приготовьте раствор путем смешивания 10 мМ Tris pH 7,4, 2 мМ MgCl₂, 25 мМ KCl, 1 мМ АТФ, регенерирующей системы АТФ (0,5 мг·мл-1 креатинкиназы и 5 мМ креатинфосфата), 200 мкМ EGTA (хелаты ионов Ca2⁺), антиотбеливающего раствора (0,1 мг·мл-1 глюкозооксидазы, 0,018 мг·мл-1 каталазы и 5 мг·^мл-1 глюкозы), 5 мкМ G-актин, 280 нМ GST-фасин и 1,67 нМ миозин II. Процент меченого G-актина составляет 5% (молярный процент).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкий процент меченого G-актина, чтобы избежать насыщения флуоресцентного сигнала на поздних стадиях сжатия геля.
2. Приготовление моторных агрегатов миозина II
   1. Добавьте миозиновые моторы в белковый раствор в виде агрегатов. Чтобы сформировать большие агрегаты миозина (150 димеров миозина / агрегат), разбавьте исходный раствор миозина 10 мМ Tris pH 7,4 до достижения конечной концентрации 25 мМ KCl.
   2. Держите разбавленный раствор миозина в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), а затем переложите его на лед до использования. Двигатели полностью активны до 2 часов.
3. Измерение расхода растворителя
   1. Чтобы отследить течение растворителя через поры геля, добавьте флуоресцентные шарики в раствор актомиозина. Уменьшите взаимодействие между шариками и актомиозиновой сетью, пассивируя шарики. Практически, инкубируют 1 мкл шариков (Таблица материалов) с 5 мкМ G-актином в течение 20 мин при RT, а затем удаляют избыток G-актина центрифугированием (Таблица материалов) (условия: 6000 x g в течение 5 мин при 4 °C).
   2. Повторите этот шаг с 10 мг · мл ^{- 1} бычьего сывороточного альбумина (BSA) (таблица материалов), чтобы заблокировать (возможно) оставшуюся поверхность без покрытия. Используйте бусины при окончательном разведении 1:10 000 об./об. в экспериментах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно адаптировать диаметр шариков к размеру пор геля таким образом, чтобы соотношение шариков и пор составляло <1 на всех этапах.
4. Влияние вязкости раствора
   1. Контролируйте вязкость раствора, добавляя глицерин (Таблица материалов) к раствору актомиозина. Добавление глицерина в весовом проценте в диапазоне от 0% до 34% вызывает соответствующее увеличение вязкости раствора с η Ом до 2,76 η _Ом, где η _ω - вязкость воды при 20 °C²⁸.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с глицерином необходимо использовать специальную пипетку для работы с вязкими жидкостями (Таблица материалов).

4. Проведение эксперимента

1. Самодельное обращение с держателем образца
   1. Возьмите одно из ПЭГ-пассивированных покровных стекол, поместите поверх него смазанную прокладкой для парапленки и поместите ее в держатель образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прокладку парапленки можно заменить на любую проставку.
2. Приготовление раствора актомиозина
   1. Приготовьте раствор актомиозина на льду в микроцентрифужной пробирке, включив различные микроскопические компоненты, добавив моторные агрегаты миозина II и добавив EGTA в последнюю очередь. Хорошо перемешайте раствор. Добавление EGTA инициирует полимеризацию актомиозиновой сети, которая устанавливает время начала эксперимента.
3. Нанесите 1,1 мкл этого раствора на защитное стекло, установленное на держателе, и поместите второе покровное стекло сверху. Закрутите держатель, чтобы запечатать образец. Этот процесс слегка сжимает каплю, которая принимает дискообразную форму. Диаметр капли колеблется от 2 800 до 3 000 мкм.
4. Поместите держатель образца на микроскоп и начните сбор. Подготовьте микроскоп заранее, чтобы сократить время первоначального сбора. Обычно после смешивания требуется 1-2 минуты, чтобы начать визуализацию образца.

5. Методы микроскопии

1. Изображение образцов с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Таблица материалов), управляемого специальным программным обеспечением (Таблица материалов).
   1. Используйте малые увеличения объектива Plan-NEOFLUAR 2,5x/0,075 (таблица материалов), чтобы визуализировать всю область геля и проследить ее макроскопическое сокращение со временем.
   2. Используйте цель 10x/0,3 Ph1 UPlanFL (таблица материалов), чтобы охарактеризовать пористость и структуру сети, а также проследить самоорганизацию и сжатие сети с течением времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта цель также полезна для локализации моторных агрегатов миозина II в сети и отслеживания движения флуоресцентных шариков через поры геля. Более высокие увеличения можно использовать за счет уменьшенного поля зрения, что еще более существенно в режиме двухцветной визуализации (Таблица материалов).
2. Возбуждайте образцы при длине волны 488 нм (актин/флуоресцентные шарики) и 561 нм (моторные агрегаты миозина/флуоресцентные шарики). Получайте изображения со скоростью 100 мс на кадр с помощью специального программного обеспечения (Таблица материалов) в потоковом режиме с камерой с устройством умножения заряда на электрон (EMCCD) (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность люминесцентной лампы (таблица материалов) должна поддерживаться на минимально возможном значении, чтобы избежать насыщения сигнала во время сжатия сети.
3. Одновременная двухцветная визуализация
   1. Используйте этот режим для двух целей: (i) обнаружение локализации моторных агрегатов миозина в актиновой сети и (i) характеристика потока растворителя наружу внутри и снаружи во время сжатия сети.
   2. Возбуждайте моторы актина и миозина II на длине волны 488 нм и 561 нм соответственно и одновременно записывайте изображения на камеру EMCCD (таблица материалов) с помощью устройства с двойным излучением (таблица материалов). Используйте одну и ту же систему визуализации для одновременного изображения актинового геля (488 нм) и флуоресцентных шариков (561 нм).

Результаты

Для эксперимента используются два стеклянных покровных стекла. Покровные стекла очищаются и пассивируются полимерами ПЭГ. Пассивация необходима для предотвращения прилипания солюбилизированных белков к стеклянным поверхностям на ранних экспериментальных стадиях и для минимизации...

Обсуждение

Здесь используется подход in vitro для характеристики механики пороэластичных гелей актомиозина как модельной системы клеточного цитоскелета и, в более общем плане, цитоплазмы клетки, которая, как было показано, ведет себя как пороэластический материал ^3,5

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane	Sigma-Aldrich Company	175617	Stored under Argon atmosphere at 4 °C
Acetic acid	Bio-Lab ltd	1070521
Alexa-Fluor 488	Invitrogene	A10254	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
Alexa-Fluor 647	Invitrogene	A20347	Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C
BSA	Sigma -Aldrich Company	A3059	Stored at 4 °C
Catalase	Sigma -Aldrich Company	C9322	The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips	Mezel-glaser	CG2222-1.5	Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase	Roche Life Science Products	10736988001	Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate	Roche Life Science Products	10621714001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT	Roche Life Science Products	10708984001	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System	Photometrics	DV2-CUBE
EGTA	MP Biomedicals	195174
EM-CCD Camera	Andor Technology Ltd	DV 887
EM-CCD Camera	Photometrics	Evolve Delta
Ethanol	Bio-Lab ltd	525050300
Flourescence Lamp	Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres	Polysciences	17151-10	200 nm diameter
Glucose	ICN Biomedicals Inc	194024	When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich Company	G7141	Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol	ICN Biomedicals Inc	800687
Glycine	MP Biomedicals	808822
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich Company	216763	Stored at 4 °C
KCl	EMD Millipore Corp.	529552
Methanol	Bio-Lab ltd	1368052100
MgCl2	EMD Millipore Corp.	442615
Microscope	Leica Microsystems	DMI3000
mPEG-mal	Nanocs	PG1-ML-5k	Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres	Spherotech	FP-2056-2	2300 nm diameter
Objective (10x)	Leica Germany	HC PL AP0	UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x)	Leica Germany	506304	Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven	WTC Binder
Parafilm	Amcor	PM-996
PBS Buffer	Sigma-Aldrich Company	P4417
Shutter Driver	Vincet Associates	VMM D1
Silica gel	Merck	1.01907.5000
Sonicator	Elma	Elmasonic P
Sulfuric acid	Carlo Erba reagents	410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System	Photometrics
TRIS	MP Biomedicals	819620
UV-VIS Spectrophotometer	Pharmacia	Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E	Gilson	FD10001	1–10 uL
MATLAB R2017b	MathWorks		Data quantification
MetaMorph	Molecular devices		Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)