ربط الشريان التاجي الأيسر: نموذج الفئران الجراحي لاحتشاء عضلة القلب

Summary

يظهر هنا إجراء جراحي للربط الدائم للشريان التاجي الأيسر في الفئران. يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية والاستجابة الالتهابية المرتبطة بها بعد احتشاء عضلة القلب.

Abstract

يعد مرض نقص تروية القلب واحتشاء عضلة القلب اللاحق (MI) أحد الأسباب الرئيسية للوفيات في الولايات المتحدة وحول العالم. من أجل استكشاف التغيرات الفيزيولوجية المرضية بعد احتشاء عضلة القلب وتصميم العلاجات المستقبلية ، هناك حاجة إلى نماذج بحثية من MI. يعد الربط الدائم للشريان التاجي الأيسر (LCA) في الفئران نموذجا شائعا للتحقيق في وظيفة القلب وإعادة تشكيل البطين بعد MI. هنا نصف نموذج MI للفأرة الجراحية الأقل توغلا وموثوقية وقابلية للتكرار عن طريق الربط الدائم ل LCA. يتكون نموذجنا الجراحي من تخدير عام يمكن عكسه بسهولة ، والتنبيب الرغامي الذي لا يتطلب بضع القصبة الهوائية ، وبضع الصدر. يجب إجراء تخطيط كهربية القلب وقياس التروبونين لضمان MI. تخطيط صدى القلب في اليوم 28 بعد MI سوف يميز وظائف القلب ومعلمات قصور القلب. يمكن تقييم درجة التليف القلبي من خلال تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان والتصوير بالرنين المغناطيسي للقلب. نموذج MI هذا مفيد لدراسة التغيرات الفيزيولوجية المرضية والمناعية بعد MI.

Introduction

تعد أمراض القلب والأوعية الدموية مصدر قلق كبير للصحة العامة يودي بحياة 17.9 مليون شخص كل عام ، وهو ما يمثل 31 في المائة من الوفيات العالمية¹. النوع الأكثر انتشارا من شذوذ القلب والأوعية الدموية هو مرض القلب التاجي ، واحتشاء عضلة القلب (MI) هو أحد المظاهر الرئيسية لأمراض القلب التاجية². عادة ما يحدث MI بسبب انسداد الشريان التاجي الخثاري بسبب تمزق لوحة ضعيفة³. يسبب نقص التروية الناتج تغيرات أيونية واستقلابية عميقة في عضلة القلب المصابة ، بالإضافة إلى انخفاض سريع في الوظيفة الانقباضي. MI يؤدي إلى وفاة خلايا عضلة القلب ، والتي يمكن أن تؤدي إلى مزيد من ضعف البطين وفشل القلب⁴.

البحث عن MI في المرضى محدود بسبب ندرة الأنسجة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من MI⁵. على هذا النحو ، فإن نماذج الفئران من MI مفيدة في كل من دراسة آليات المرض وكذلك تطوير الأهداف العلاجية المحتملة. تشمل نماذج الفئران المتاحة حاليا من MI نماذج نقص التروية التي لا رجعة فيها (LCA وطرق الاستئصال) ونماذج إعادة التروية (نقص التروية / إعادة التروية ، I / R)⁶. الربط الدائم للشريان التاجي الأيسر (LCA) في الفئران هو الطريقة الأكثر استخداما ، وهو يقلد الفيزيولوجيا المرضية والمناعة في MI في المرضى⁷،^8،9. يمكن أيضا إحداث MI الدائم عن طريق طرق الاجتثاث ، والتي تنطوي على تلف كهربائي أو إصابة بالتبريد. طرق الاجتثاث قادرة على توليد احتشاء موحد الحجم في الموقع الدقيق¹⁰. من ناحية أخرى ، قد يختلف تكوين الندبة ومورفولوجيا الاحتشاء وآليات الإشارات الجزيئية بين طرق الاجتثاث^10,11. طريقة الفئران I / R هي نموذج MI مهم آخر لأنها تمثل السيناريو السريري لعلاج إعادة التروية¹². يرتبط نموذج I / R بتحديات مثل حجم الاحتشاء المتغير ، وصعوبة التمييز بين استجابات الإصابة الأولية ، وإعادة التروية⁶.

على الرغم من استخدامها على نطاق واسع ، إلا أن طرق ربط LCA ترتبط بمعدلات بقاء منخفضة وألم ما بعد الجراحة¹³. يوضح هذا البروتوكول نموذج MI الجراحي للفئران لربط LCA الذي يتضمن تحضير الفئران وتنبيبها ، وربط LCA ، والرعاية بعد الجراحة ، والتحقق من صحة MI. بدلا من استخدام بضع القصبة الهوائية^{الغازية 14} ، تستخدم هذه الطريقة التنبيب الرغامي. يتم تنبيب الحيوان عن طريق إلقاء الضوء على البلعوم الفموي باستخدام منظار الحنجرة ، مما يجعل الإجراء أسهل وأكثر أمانا وأقل صدمة¹⁵. يتم الاحتفاظ بالماوس على دعم جهاز التنفس الصناعي وتحت تخدير الأيزوفلوران طوال العملية. علاوة على ذلك ، يتم إجراء تخطيط صدى القلب وتلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لتقييم وظائف القلب والتليف القلبي بعد MI ، على التوالي. بشكل عام ، توفر هذه الطريقة نموذجا جراحيا موثوقا به وقابلا للتكرار من MI يمكن استخدامه لدراسة الفيزيولوجيا المرضية والالتهاب بعد MI.

Protocol

تمت مراجعة بروتوكول الدراسة الحالي والموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة بيتسبرغ. تم استخدام ثمانية (sham n = 4 و MI n = 4) إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 1 عاما والتي تزن 24-30 جم لهذه التجارب. نجا ما يقرب من 100 ٪ و 80 ٪ على الأقل من الفئران في أول 24 ساعة و 28 يوما ، على التوالي.

1. إعداد والتنبيب الرغامي للفئران

1. سخن معقم حبة (انظر جدول المواد) إلى 250 درجة مئوية وضع الأدوات الجراحية المعقمة فيه لبضع دقائق.
2. تخدير الفأر في غرفة الحث مع 3٪ إيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة أكسجين لمدة 5 دقائق.
3. تأكد من عمق التخدير في الماوس عن طريق التحقق من الاستجابة لقرصة إصبع القدم الثابتة.
4. وزن الفأر لتقدير جرعة الدواء المسكن قبل الجراحة ، البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم). حقن الدواء داخل الصفاق.
5. تقليم الفراء على الجانب الأيسر من الصدر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
6. تطهير موقع الجراحة مع البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول بعد ذلك ثلاث مرات.
7. ضع الماوس في وضع ضعيف على لوحة مائلة. قم بتأمين رأس وأطراف الماوس باستخدام شريط مطاطي متصل بالقواطع العلوية وشريط لاصق ، على التوالي. ضع مواد تشحيم العيون المعقمة على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
8. افتح الفك واسحب اللسان برفق من تجويف الفم.
9. تحديد فتحة الحنجرة عن طريق إلقاء الضوء على البلعوم الفموي باستخدام منظار الحنجرة (انظر جدول المواد).
10. اقطع حوالي 0.5 سم من إبرة قسطرة 24 جرام وأدخل الإبرة الحادة في الدرع البلاستيكي. توجيه الإبرة الحادة مع الدرع البلاستيكي في القصبة الهوائية. أخرج الإبرة ، واترك الدرع البلاستيكي في القصبة الهوائية.
11. اضبط جهاز التنفس الصناعي (انظر جدول المواد) على معدل تنفس يبلغ 137 نبضة في الدقيقة (محسن للفئران المستخدمة في هذه الدراسة) وحجم المد والجزر 0.18 سم مكعب. قم بتوصيل أنابيب جهاز التنفس بدرع القسطرة وتأكد من التنبيب الصحيح من خلال البحث عن حركة متزامنة للصدر باستخدام جهاز التنفس الصناعي.
12. افصل أنبوب التنفس عن درع القسطرة وضع الحيوان في وضع الاستلقاء على لوحة جراحية مسخنة مسبقا يتم التحكم في درجة حرارتها. أعد توصيل الماوس بجهاز التنفس الصناعي.

2. الربط الدائم للشريان التاجي الأيسر

1. تطهير موقع الجراحة مع البوفيدون اليود والكحول 70 ٪. ضع ستارة معقمة بها ثقب ربع الحجم في المنتصف لتأمين موقع الجراحة. ارفع الجلد برفق باستخدام ملقط وقم بعمل شق عرضي جلدي صغير (1.5-2 سم) على طول الخط الفاصل بين عضلات الصدر اليسرى الكبرى والصغرى باستخدام مقص جراحي.
   ملاحظة: تم استخدام المقص لعمل الشق لأنه يوفر التحكم المطلوب في عمق واتجاه القطع.
2. افصل عضلات الصدر الأساسية بالملقط ومقص التشريح. تم فصل العضلات باستخدام مبعدات متصلة بأشرطة مرنة.
3. قم بعمل شق في الفضاء الوربي الثالث باستخدام مقص صغير يتبع الزاوية الطبيعية للقفص الصدري. في هذه المرحلة ، يجب توخي الحذر الشديد لمنع إصابة القلب والرئتين.
4. قم بتمديد الضلوع برفق باستخدام المبعدات لكشف البطين الأيسر. حرك دهون التامور جانبا وحدد موقع LCA ، الذي يمتد من حافة الأذين الأيسر نحو قمة القلب.
5. تمرير 8-0 خياطة النايلون تحت LCA بمساعدة حامل إبرة. اربط LCA بعقدة مزدوجة متبوعة بعقدة ثانية (عقدة جراح معدلة).
   ملاحظة: يؤكد ابيضاض البطين الأيسر السفلي نجاح ربط LCA. بالإضافة إلى ذلك ، ينصح أيضا بقياس التروبونين ، ومراقبة تخطيط القلب (ارتفاع ST) ، والتصوير بالرنين المغناطيسي بالصدى / في الجسم الحي ، أو صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة لتأكيد آفات MI المماثلة.
6. قم بإزالة المبعدات وأدخل إبرة قسطرة 22 G في تجويف الصدر. إزالة الإبرة ، وترك طرف الدرع البلاستيكي في التجويف الصدري. أغلق القفص الصدري باستخدام خياطة نايلون 4-0.
7. قم بتوصيل حقنة بالدرع البلاستيكي 22 G وقم بإزالة الهواء الزائد المحاصر في التجويف الصدري ببطء عن طريق الضغط برفق على الصدر لإنشاء ضغط هواء سلبي. قم بإزالة الدرع البلاستيكي.
8. أغلق الجلد بخياطة من النايلون 4-0.
9. قم بإيقاف تشغيل إمداد الأيزوفلوران. في هذه المرحلة ، يكون الماوس على جهاز التنفس الصناعي الذي يوفر الأكسجين.

3. رعاية ما بعد الجراحة

1. قم بإيقاف تشغيل جهاز التنفس الصناعي بمجرد بدء التنفس التلقائي.
   ملاحظة: تستغرق العملية حوالي 30-35 دقيقة لكل من تحضير الفئران حتى هذه الخطوة.
2. احتفظ بالماوس تحت مصباح حراري وراقبه حتى يستيقظ. لا ينبغي ترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
3. بعد الجراحة ، ضع الحيوان في قفص منفصل وأعده إلى القفص الأصلي مع الحيوانات الأخرى فقط بعد أن يتعافى تماما.
4. راقب الماوس يوميا بحثا عن أي علامة على الألم أو الانزعاج.
5. يجب الاستمرار في حقن البوبرينورفين داخل الصفاق (0.1 ملغ/كغ) كل 6-8 ساعات لمدة يومين إضافيين بعد الجراحة.

4. تقييم تخطيط صدى القلب

ملاحظة: تم إجراء تخطيط صدى القلب لتقييم معلمات قصور القلب في اليوم 28 بعد MI.

1. بعد 28 يوما بعد الجراحة ، قم بتخدير الفئران بنسبة 3٪ إيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة أكسجين ، وتطبيق مواد تشحيم معقمة للعين على العينين ، وإزالة شعر الصدر باستخدام كريم إزالة الشعر. تطهير منطقة الصدر مع البوفيدون اليود و 70 ٪ من الإيثانول ثلاث مرات.
2. قم بتأمين الفئران المخدرة فوق منصة التصوير (انظر جدول المواد) في وضع الاستلقاء والحفاظ على مستوى ثابت من التخدير طوال العملية باستخدام مخروط أنف متصل بنظام التخدير (1٪ -2٪ إيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة أكسجين).
3. قم بلصق الكفوف الأربعة على أقطاب ECG باستخدام هلام القطب (انظر جدول المواد). مراقبة درجة حرارة الحيوان عن طريق إدخال مسبار المستقيم (انظر جدول المواد).
4. ضع جل المسح (انظر جدول المواد) على الصدر ، ضع محول الطاقة عموديا ، وقم بخفضه إلى خط parasternal (مواز للصدر) ، وقم بتدوير 35 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة للحصول على عرض المحور الطويل شبه القصي للبطين الأيسر.
5. اضغط على زر التصوير في الوضع B في برنامج التصوير (انظر جدول المواد) للحصول على عرض كامل للمحور الطويل للقلب. اضبط حجم البوابة وسطوعها واحفظ الصور باستخدام Save Clip أو Save Frame لإجراء قياسات لاحقة¹⁶.
6. قم بالتبديل إلى الوضع M (وضع الحركة) وضع محور الوضع M على مستوى العضلات الحليمية. اضبط حجم البوابة واضغط على زر بدء الوضع M. احفظ الصور باستخدام حفظ مقطع أو حفظ الإطار^16,17.
7. نظرا لأن عملية الحصول على الصور في وضع 4D مؤتمتة ، تحقق من أن إشارات تخطيط القلب والتنفس نشطة (الشكل 1) قبل الحصول على البيانات.
8. ابدأ في الحصول على البيانات في الوضع B. افتح لوحة المسح الضوئي 4D وابدأ تشغيل محرك 3D. قم بتعيين معلمات الصورة في لوحة المسح الضوئي 4D واضغط على زر المسح الضوئي لبدء المسح. بعد مراجعة الصور في عرض 2D ، قم بتحميل الصور في وضع 4D باستخدام الزر تحميل في 4D .

النتائج

يوضح الشكل 1 إشارات تخطيط القلب والتنفس النشطة التمثيلية أثناء تقييم تخطيط صدى القلب للفئران الوهمية (الشكل 1 أ) و MI (الشكل 1 ب). يعد التحقق من إشارات تخطيط القلب والتنفس النشطة أمرا مهما قبل الحصول على بيانات تخطيط صدى القلب. يوضح

Discussion

يكتسب نموذج الفئران من MI شعبية في مختبرات أبحاث القلب والأوعية الدموية ، وتصف هذه الدراسة نموذج MI القابل للتكرار والمناسب سريريا. يعمل هذا البروتوكول على تحسين عملية ربط LCA بعدة طرق. بادئ ذي بدء ، يتم تجنب استخدام التخدير عن طريق الحقن قبل الجراحة مثل زيلازين / الكيتامين أو بنتوباربيتال ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis