Legatura coronaria sinistra: un modello chirurgico murino di infarto miocardico

Riepilogo

Presentato qui è una procedura chirurgica per la legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra nei topi. Questo modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e la risposta infiammatoria associata dopo infarto miocardico.

Abstract

La cardiopatia ischemica e il successivo infarto miocardico (IM) sono una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Al fine di esplorare i cambiamenti fisiopatologici dopo infarto miocardico e progettare trattamenti futuri, sono necessari modelli di ricerca di IM. La legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra (LCA) nei topi è un modello popolare per studiare la funzione cardiaca e il rimodellamento ventricolare post MI. Qui descriviamo un modello di MI murino chirurgico meno invasivo, affidabile e riproducibile mediante legatura permanente dell'LCA. Il nostro modello chirurgico comprende un'anestesia generale facilmente reversibile, un'intubazione endotracheale che non richiede una tracheotomia e una toracotomia. L'elettrocardiografia e la misurazione della troponina devono essere eseguite per garantire l'infarto miocardico. L'ecocardiografia al giorno 28 dopo l'infarto miocardico discernerà la funzione cardiaca e i parametri di insufficienza cardiaca. Il grado di fibrosi cardiaca può essere valutato dalla colorazione tricromatica di Masson e dalla risonanza magnetica cardiaca. Questo modello di MI è utile per studiare le alterazioni fisiopatologiche e immunologiche dopo l'infarto miocardico.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica che mietono 17,9 milioni di vite ogni anno, rappresentando il 31% della mortalità globale¹. Il tipo più diffuso di anomalia cardiovascolare è la malattia coronarica e l'infarto miocardico (MI) è una delle principali manifestazioni della malattia coronarica². L'infarto miocardico è solitamente causato dall'occlusione trombotica di un'arteria coronaria dovuta alla rottura di una placca vulnerabile³. L'ischemia risultante provoca profondi cambiamenti ionici e metabolici nel miocardio interessato, nonché una rapida diminuzione della funzione sistolica. L'infarto miocardico provoca la morte dei cardiomiociti, che può ulteriormente portare a disfunzione ventricolare e insufficienza cardiaca⁴.

La ricerca sull'infarto miocardico nei pazienti è limitata a causa della scarsità di tessuti ottenuti da pazienti con infarto^{miocardico 5}. Pertanto, i modelli murini di infarto miocardico sono utili sia nello studio dei meccanismi della malattia che nello sviluppo di potenziali bersagli terapeutici. I modelli murini di IM attualmente disponibili includono modelli di ischemia irreversibile (LCA e metodi di ablazione) e modelli di riperfusione (ischemia/riperfusione, I/R)⁶. La legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra (LCA) nei topi è il metodo più utilizzato e imita la fisiopatologia e l'immunologia dell'infarto miocardico nei pazienti ^7,8,9. L'infarto miocardico permanente può anche essere indotto da metodi di ablazione, che comportano danni elettrici o criolesioni. I metodi di ablazione sono in grado di generare infarto di dimensioni uniformi nella posizione precisa¹⁰. D'altra parte, la formazione di cicatrici, la morfologia dell'infarto e i meccanismi di segnalazione molecolare possono variare tra i metodi di ablazione^10,11. Il metodo I/R murino è un altro importante modello di MI in quanto rappresenta lo scenario clinico della terapia di riperfusione¹². Il modello I/R è associato a sfide quali una dimensione variabile dell'infarto, difficoltà nel distinguere le risposte della lesione iniziale e riperfusione⁶.

Sebbene ampiamente utilizzati, i metodi di legatura LCA sono associati a bassi tassi di sopravvivenza e dolore post-operatorio¹³. Questo protocollo dimostra il modello di infarto miocardico chirurgico murino della legatura LCA che prevede la preparazione e l'intubazione dei topi, la legatura LCA, la cura post-operatoria e la convalida dell'infarto miocardico. Piuttosto che utilizzare una tracheotomia invasiva¹⁴, questo metodo impiega l'intubazione endotracheale. L'animale viene intubato illuminando l'orofaringe usando un laringoscopio, rendendo la procedura più facile, più sicura e meno traumatica¹⁵. Il topo viene tenuto sul supporto del ventilatore e in anestesia isoflurana durante tutta la procedura. Inoltre, l'ecocardiografia e la colorazione tricromatica di Masson vengono eseguite per valutare rispettivamente la funzione cardiaca e la fibrosi cardiaca dopo l'infarto miocardico. Nel complesso, questo metodo fornisce un modello murino chirurgico affidabile e riproducibile di MI che può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e l'infiammazione dopo l'infarto miocardico.

Protocollo

Il presente protocollo di studio è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh. Per questi esperimenti sono stati utilizzati otto topi femmina C57BL / 6J di 1 anno del peso di 24-30 g. Circa il 100% e almeno l'80% dei topi sono sopravvissuti rispettivamente nelle prime 24 ore e 28 giorni.

1. Preparazione e intubazione endotracheale dei topi

1. Preriscaldare uno sterilizzatore a sfere (vedere Tabella dei materiali) a 250 °C e posizionarvi strumenti chirurgici autoclavati per alcuni minuti.
2. Anestetizzare il topo in una camera di induzione con isoflurano al 3% e 1 L/min di ossigeno per 5 min.
3. Garantire la profondità dell'anestesia nel mouse controllando la risposta a un pizzico fermo del dito.
4. Pesare il topo per stimare il dosaggio del farmaco analgesico preoperatorio, buprenorfina (0,1 mg/kg). Iniettare il farmaco per via intraperitoniale.
5. Taglia la pelliccia sul lato sinistro del torace usando un rasoio elettrico.
6. Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e etanolo al 70% tre volte.
7. Posizionare il mouse in posizione supina su una tavola inclinata. Fissare la testa e gli arti del mouse utilizzando una fascia elastica attaccata rispettivamente agli incisivi superiori e al nastro adesivo. Applicare lubrificante oftalmico sterile sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
8. Apri la mascella e tira delicatamente la lingua fuori dalla cavità orale.
9. Identificare l'apertura della laringe illuminando l'orofaringe usando un laringoscopio (vedere Tabella dei materiali).
10. Tagliare circa 0,5 cm da un ago del catetere da 24 G e inserire l'ago smussato nello schermo di plastica. Dirigere l'ago smussato con lo scudo di plastica nella trachea. Estrarre l'ago, lasciando lo scudo di plastica nella trachea.
11. Impostare il ventilatore (vedi Tabella dei materiali) su una frequenza respiratoria di 137 battiti al minuto (ottimizzata per i topi utilizzati in questo studio) e volume corrente 0,18 cc. Collegare i tubi del respiratore allo schermo del catetere e confermare la corretta intubazione cercando un movimento toracico sincronizzato con il ventilatore.
12. Scollegare il tubo del respiratore dalla protezione del catetere e posizionare l'animale in posizione supina su una tavola chirurgica preriscaldata a temperatura controllata. Ricollegare il mouse al ventilatore.

2. Legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra

1. Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e alcool al 70%. Applicare un drappo sterile con un foro di dimensioni quarte al centro per fissare il sito chirurgico. Sollevare delicatamente la pelle con un paio di pinze e praticare una piccola incisione trasversale cutanea (1,5-2 cm) lungo la linea tra i muscoli pettorali maggiori e minori sinistro usando un paio di forbici chirurgiche.
   NOTA: Le forbici sono state utilizzate per eseguire l'incisione in quanto fornisce il controllo richiesto sulla profondità e sulla direzione del taglio.
2. Separare i muscoli pettorali sottostanti con una pinza e forbici da dissezione. I muscoli sono stati separati usando divaricatori attaccati a elastici.
3. Fai un'incisione nel terzo spazio intercostale con un paio di micro forbici seguendo l'angolo naturale della gabbia toracica. In questa fase, è necessario prestare estrema attenzione per prevenire lesioni al cuore e ai polmoni.
4. Allungare delicatamente le costole usando i divaricatori per esporre il ventricolo sinistro. Spostare il grasso pericardico da parte e individuare l'LCA, che corre dal bordo dell'atrio sinistro verso l'apice del cuore.
5. Passa un 8-0 sutura di nylon sotto l'LCA con l'aiuto di un portaaghi. Ligare la LCA con un doppio nodo seguito da un secondo nodo (un nodo del chirurgo modificato).
   NOTA: Lo sbiancamento del ventricolo inferiore sinistro conferma una legatura LCA di successo. Oltre a questo, si consiglia anche la misurazione della troponina, il monitoraggio ECG (elevazione ST), la risonanza magnetica eco/cardio-dipendente in vivo o le immagini micro-CT per confermare le lesioni MI comparabili.
6. Rimuovere i divaricatori e inserire un ago da catetere da 22 G nella cavità toracica. Rimuovere l'ago, lasciando la punta dello scudo di plastica nella cavità toracica. Chiudere la gabbia toracica utilizzando una sutura di nylon 4-0.
7. Collegare una siringa allo schermo di plastica da 22 G e rimuovere lentamente l'aria in eccesso intrappolata nella cavità toracica premendo delicatamente il torace per stabilire una pressione dell'aria negativa. Rimuovere lo scudo di plastica.
8. Chiudere la pelle con una sutura di nylon 4-0.
9. Spegnere l'alimentazione di isoflurano. In questa fase, il mouse è sul ventilatore che fornisce ossigeno.

3. Assistenza post-operatoria

1. Spegnere il ventilatore una volta iniziata la respirazione spontanea.
   NOTA: La procedura richiede circa 30-35 minuti per animale dalla preparazione dei topi fino a questa fase.
2. Tenere il mouse sotto una lampada di calore e monitorarlo fino a quando non è sveglio. L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha recuperato abbastanza coscienza per mantenere la recumbency sternale.
3. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare l'animale in una gabbia separata e riportarlo nella gabbia originale con altri animali solo dopo che si è completamente ripreso.
4. Monitorare il mouse quotidianamente per qualsiasi segno di dolore o disagio.
5. Continuare l'iniezione intraperitoneale di buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 6-8 ore per altri 2 giorni dopo l'intervento.

4. Valutazione ecocardiografica

NOTA: L'ecocardiografia è stata eseguita per valutare i parametri di insufficienza cardiaca il giorno 28 dopo l'infarto miocardico.

1. Dopo 28 giorni dall'intervento, anestetizzare i topi con il 3% di isoflurano e 1 L/min di ossigeno, applicare un lubrificante oftalmico sterile sugli occhi e rimuovere i peli del torace con una crema depilatoria. Disinfettare l'area del torace con povidone-iodio e etanolo al 70% tre volte.
2. Assicurare i topi anestetizzati in cima alla piattaforma di imaging (vedi Tabella dei materiali) in posizione supina e mantenere un livello costante di anestesia durante tutta la procedura utilizzando un cono nasale collegato al sistema anestetico (1% -2% di isoflurano e 1 L / min di ossigeno).
3. Fissare le quattro zampe agli elettrodi ECG con gel per elettrodi (vedere la tabella dei materiali). Monitorare la temperatura dell'animale inserendo una sonda rettale (vedi Tabella dei materiali).
4. Applicare il gel di scansione (vedi Tabella dei materiali) sul torace, posizionare il trasduttore verticalmente, abbassarlo sulla linea parasternale (parallela al torace) e ruotare di 35° in senso antiorario per ottenere la vista dell'asse lungo parasternale del ventricolo sinistro.
5. Toccare il pulsante di imaging in modalità B sul software di imaging (vedere Tabella dei materiali) per ottenere una visione completa dell'asse lungo del cuore. Regolare le dimensioni e la luminosità del cancello e salvare le immagini utilizzando Save Clip o Save Frame per misurazioni successive¹⁶.
6. Passare alla modalità M (modalità movimento) e posizionare l'asse M-mode a livello del muscolo papillare. Regola le dimensioni del gate e tocca il pulsante M-mode Start. Salvate le immagini utilizzando Save Clip o Save Frame^16,17.
7. Poiché il processo di acquisizione delle immagini in modalità 4D è automatizzato, verificare che i segnali ECG e respirazione siano attivi (Figura 1) prima di acquisire i dati.
8. Inizia ad acquisire i dati in B-Mode. Aprire il pannello di scansione 4D e avviare il motore 3D. Impostare i parametri dell'immagine nel pannello di scansione 4D e toccare il pulsante Scansione per iniziare la scansione. Dopo aver esaminato le immagini nella vista 2D, caricarle in modalità 4D utilizzando il pulsante Carica in 4D .

Risultati

La Figura 1 mostra i segnali rappresentativi attivi dell'ECG e della respirazione durante la valutazione ecocardiografica dei topi sham (Figura 1A) e MI (Figura 1B). La verifica dei segnali attivi ECG e respirazione è importante prima di acquisire i dati ecocardiografici. La Figura 2 mostra la misurazione ecocardiografica dei parametri funzionali cardiaci dopo 28 giorni dopo la legatu...

Discussione

Il modello murino di infarto miocardico sta guadagnando popolarità nei laboratori di ricerca cardiovascolare e questo studio descrive un modello di infarto miocardico riproducibile e clinicamente rilevante. Questo protocollo migliora il processo di legatura LCA in diversi modi. Per cominciare, si evita l'uso di anestetici pre-operatori iniettabili come xilazina / ketamina o pentobarbital di sodio^14,15. È stata utilizzata solo l'anestesia con isoflurano, che aiu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis