Linke Koronararterienligatur: Ein chirurgisches Mausmodell des Myokardinfarkts

Zusammenfassung

Hier wird ein chirurgisches Verfahren zur permanenten Ligatur der linken Koronararterie bei Mäusen vorgestellt. Mit diesem Modell kann die Pathophysiologie und die damit verbundene Entzündungsreaktion nach Myokardinfarkt untersucht werden.

Zusammenfassung

Ischämische Herzkrankheit und anschließender Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten und auf der ganzen Welt. Um die pathophysiologischen Veränderungen nach einem Myokardinfarkt zu erforschen und zukünftige Behandlungen zu entwickeln, sind Forschungsmodelle von MI erforderlich. Die permanente Ligatur der linken Koronararterie (LCA) bei Mäusen ist ein beliebtes Modell zur Untersuchung der Herzfunktion und des ventrikulären Umbaus nach MI. Hier beschreiben wir ein weniger invasives, zuverlässiges und reproduzierbares chirurgisches Maus-MI-Modell durch permanente Ligatur der LCA. Unser chirurgisches Modell besteht aus einer leicht reversiblen Vollnarkose, einer endotrachealen Intubation, die keine Tracheotomie erfordert, und einer Thorakotomie. Elektrokardiographie und Troponinmessung sollten durchgeführt werden, um MI sicherzustellen. Echokardiographie am Tag 28 nach MI erkennt Herzfunktion und Herzinsuffizienzparameter. Der Grad der Herzfibrose kann durch Massons Trichromfärbung und Herz-MRT beurteilt werden. Dieses MI-Modell ist nützlich für die Untersuchung der pathophysiologischen und immunologischen Veränderungen nach MI.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit, das jedes Jahr 17,9 Millionen Menschenleben fordert, was 31 Prozent der weltweiten Sterblichkeit ausmacht¹. Die häufigste Form der kardiovaskulären Anomalie ist die koronare Herzkrankheit, und der Myokardinfarkt (MI) ist eine der Hauptmanifestationen der koronaren Herzkrankheit². MI wird in der Regel durch einen thrombotischen Verschluss einer Koronararterie aufgrund des Bruchs einer anfälligen Plaque^{verursacht 3}. Die daraus resultierende Ischämie verursacht tiefgreifende ionische und metabolische Veränderungen im betroffenen Myokard sowie eine rasche Abnahme der systolischen Funktion. MI führt zum Absterben von Kardiomyozyten, was zu ventrikulärer Dysfunktion und Herzinsuffizienz führen kann⁴.

Die Erforschung von MI bei Patienten ist aufgrund der Knappheit von Geweben, die von Patienten mit MI⁵ gewonnen werden, begrenzt. Daher sind murine Modelle von MI sowohl für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen als auch für die Entwicklung potenzieller therapeutischer Ziele nützlich. Zu den derzeit verfügbaren Mausmodellen für MI gehören irreversible Ischämiemodelle (LCA und Ablationsmethoden) und Reperfusionsmodelle (Ischämie/Reperfusion, I/R)⁶. Die permanente Ligatur der linken Koronararterie (LCA) bei Mäusen ist die am häufigsten verwendete Methode und imitiert die Pathophysiologie und Immunologie von MI bei Patienten ^7,8,9. Permanenter MI kann auch durch Ablationsmethoden induziert werden, die elektrische Schäden oder Kryoverletzungen beinhalten. Ablationsverfahren sind in der Lage, einen Infarkt einheitlicher Größe an der genauen Stelle¹⁰ zu erzeugen. Andererseits können Narbenbildung, Infarktmorphologie und molekulare Signalmechanismen zwischen den Ablationsmethoden variieren^10,11. Die murine I/R-Methode ist ein weiteres wichtiges MI-Modell, da sie das klinische Szenario der Reperfusionstherapie^{darstellt 12}. Das I/R-Modell ist mit Herausforderungen wie einer variablen Infarktgröße, Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von Reaktionen auf die Erstverletzung und Reperfusion⁶ verbunden.

Obwohl LCA-Ligaturmethoden weit verbreitet sind, sind sie mit niedrigen Überlebensraten und postoperativen Schmerzen verbunden¹³. Dieses Protokoll demonstriert das murine chirurgische MI-Modell der LCA-Ligatur, das die Vorbereitung und Intubation von Mäusen, die LCA-Ligatur, die postoperative Versorgung und die Validierung von MI umfasst. Anstatt eine invasive Tracheotomie¹⁴ zu verwenden, verwendet diese Methode eine endotracheale Intubation. Das Tier wird intubiert, indem der Oropharynx mit einem Laryngoskop beleuchtet wird, was den Eingriff einfacher, sicherer und weniger traumatisch macht¹⁵. Die Maus wird während des gesamten Eingriffs beatmet und unter Isofluran-Anästhesie gehalten. Darüber hinaus werden die Echokardiographie und die Masson-Trichrom-Färbung durchgeführt, um die Herzfunktion bzw. die Herzfibrose nach MI zu bewerten. Insgesamt bietet diese Methode ein zuverlässiges und reproduzierbares chirurgisches Mausmodell von MI, das zur Untersuchung der Pathophysiologie und Entzündung nach MI verwendet werden kann.

Protokoll

Das vorliegende Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh geprüft und genehmigt. Für diese Experimente wurden acht (schein n = 4 und MI n = 4) 1-jährige weibliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 24-30 g verwendet. Ungefähr 100% und mindestens 80% der Mäuse überlebten in den ersten 24 Stunden bzw. 28 Tagen.

1. Vorbereitung und endotracheale Intubation der Mäuse

1. Einen Perlensterilisator (siehe Materialtabelle) auf 250 °C vorheizen und autoklavierte chirurgische Instrumente für einige Minuten hineinlegen.
2. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff für 5 min.
3. Stellen Sie die Anästhesietiefe in der Maus sicher, indem Sie die Reaktion auf ein festes Zeheneinklemmen überprüfen.
4. Wiegen Sie die Maus, um die Dosierung des präoperativen Analgetikums Buprenorphin (0,1 mg/kg) abzuschätzen. Injizieren Sie das Medikament intraperitonial.
5. Schneiden Sie das Fell auf der linken Seite des Brustkorbs mit einem Elektrorasierer ab.
6. Desinfizieren Sie die Operationsstelle danach dreimal mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
7. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein geneigtes Brett. Befestigen Sie den Kopf und die Gliedmaßen der Maus mit einem Gummiband, das an den oberen Schneidezähnen bzw. dem Klebeband befestigt ist. Tragen Sie steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
8. Öffnen Sie den Kiefer und ziehen Sie die Zunge vorsichtig aus der Mundhöhle.
9. Identifizieren Sie die Öffnung des Kehlkopfes, indem Sie den Oropharynx mit einem Laryngoskop beleuchten (siehe Materialtabelle).
10. Schneiden Sie ca. 0,5 cm von einer 24 G Katheternadel ab und führen Sie die stumpfe Nadel in den Kunststoffschild ein. Richten Sie die stumpfe Nadel mit dem Kunststoffschild in die Luftröhre. Nehmen Sie die Nadel heraus und lassen Sie den Kunststoffschild in der Luftröhre.
11. Stellen Sie das Beatmungsgerät (siehe Materialtabelle) auf eine Atemfrequenz von 137 Schlägen pro Minute (optimiert für die in dieser Studie verwendeten Mäuse) und ein Atemzugvolumen von 0,18 cm³ ein. Verbinden Sie die Beatmungsschläuche mit dem Katheterschild und bestätigen Sie die korrekte Intubation, indem Sie nach einer synchronisierten Brustbewegung mit dem Beatmungsgerät suchen.
12. Trennen Sie den Beatmungsschlauch vom Katheterschild und legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein vorgewärmtes, temperaturgesteuertes Operationsbrett. Schließen Sie die Maus wieder an das Beatmungsgerät an.

2. Permanente Ligatur der linken Koronararterie

1. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod und 70% Alkohol. Tragen Sie ein steriles Tuch mit einem viertelgroßen Loch in der Mitte auf, um die Operationsstelle zu sichern. Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen (1,5-2 cm) kutanen Querschnitt entlang der Linie zwischen dem linken Brustmuskel major und dem kleinen Muskel.
   HINWEIS: Für den Einschnitt wurde eine Schere verwendet, da sie die erforderliche Kontrolle über die Tiefe und Richtung des Schnitts bietet.
2. Trennen Sie die darunter liegenden Brustmuskeln mit einer Pinzette und einer Sezierschere. Die Muskeln wurden mit Hilfe von Retraktoren, die an Gummibändern befestigt waren, getrennt.
3. Machen Sie einen Einschnitt in den dritten Interkostalraum mit einer Mikroschere, die dem natürlichen Winkel des Brustkorbs folgt. In dieser Phase ist äußerste Vorsicht geboten, um Verletzungen von Herz und Lunge zu vermeiden.
4. Dehnen Sie die Rippen vorsichtig mit Retraktoren auseinander, um den linken Ventrikel freizulegen. Bewegen Sie das Perikardfett beiseite und lokalisieren Sie die Ökobilanz, die vom Rand des linken Vorhofs zur Herzspitze verläuft.
5. Pass ein 8-0 Nylonnaht unter der Ökobilanz mit Hilfe eines Nadelhalters. Ligate die LCA mit einem Doppelknoten, gefolgt von einem zweiten Knoten (ein modifizierter Chirurgenknoten).
   HINWEIS: Das Blanchieren des unteren linken Ventrikels bestätigt eine erfolgreiche LCA-Ligatur. Darüber hinaus werden Troponinmessungen, EKG-Überwachung (ST-Hebung), Echo-/In-vivo-Herz-gesteuerte MRT oder Mikro-CT-Bilder empfohlen, um die vergleichbaren MI-Läsionen zu bestätigen.
6. Entfernen Sie die Retraktoren und führen Sie eine 22-G-Katheternadel in die Brusthöhle ein. Entfernen Sie die Nadel und lassen Sie die Spitze des Kunststoffschildes in der Brusthöhle. Schließen Sie den Brustkorb mit einer 4-0-Nylonnaht.
7. Schließen Sie eine Spritze an die 22-G-Kunststoffabschirmung an und entfernen Sie langsam überschüssige Luft, die in der Brusthöhle eingeschlossen ist, indem Sie vorsichtig auf die Brust drücken, um einen negativen Luftdruck herzustellen. Entfernen Sie das Plastikschild.
8. Verschließen Sie die Haut mit einer 4-0 Nylonnaht.
9. Schalten Sie die Isofluranzufuhr aus. In diesem Stadium befindet sich die Maus am Beatmungsgerät und liefert Sauerstoff.

3. Nachsorge

1. Schalten Sie das Beatmungsgerät aus, sobald die Spontanatmung einsetzt.
   HINWEIS: Das Verfahren dauert etwa 30-35 Minuten pro Tier von der Vorbereitung der Mäuse bis zu diesem Schritt.
2. Halten Sie die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie, bis sie wach ist. Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis es genug Bewusstsein wiedererlangt hat, um das Brustbein aufrechtzuerhalten.
3. Legen Sie das Tier nach der Operation in einen separaten Käfig und bringen Sie es erst dann mit anderen Tieren in den ursprünglichen Käfig zurück, wenn es sich vollständig erholt hat.
4. Überwachen Sie die Maus täglich auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden.
5. Setzen Sie die intraperitoneale Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 6-8 Stunden für weitere 2 Tage nach der Operation fort.

4. Echokardiographische Auswertung

HINWEIS: Eine Echokardiographie wurde durchgeführt, um die Parameter der Herzinsuffizienz am Tag 28 nach MI zu bewerten.

1. Anästhesieren Sie die Mäuse 28 Tage nach der Operation mit 3% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff, tragen Sie steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen auf und entfernen Sie die Brusthaare mit einer Haarentfernungscreme. Desinfizieren Sie den Brustbereich dreimal mit Povidon-Jod und 70% Ethanol.
2. Befestigen Sie die anästhesierten Mäuse auf der Bildgebungsplattform (siehe Materialtabelle) in Rückenlage und halten Sie während des gesamten Eingriffs ein konstantes Anästhesieniveau aufrecht, indem Sie einen Nasenkonus verwenden, der mit dem Anästhesiesystem verbunden ist (1%-2% Isofluran und 1 l/min Sauerstoff).
3. Kleben Sie die vier Pfoten mit Elektrodengel auf die EKG-Elektroden (siehe Materialtabelle). Überwachen Sie die Temperatur des Tieres, indem Sie eine rektale Sonde einführen (siehe Materialtabelle).
4. Tragen Sie das Scan-Gel (siehe Materialtabelle) auf den Brustkorb auf, platzieren Sie den Schallkopf senkrecht, senken Sie ihn auf die parasternale Linie (parallel zum Thorax) ab und drehen Sie ihn um 35° gegen den Uhrzeigersinn, um die parasternale Längsachse des linken Ventrikels zu erhalten.
5. Tippen Sie in der Bildgebungssoftware auf die Schaltfläche B-Modus-Bildgebung (siehe Materialtabelle), um eine vollständige Ansicht des Herzens mit langer Achse zu erhalten. Passen Sie die Größe und Helligkeit des Anschnitts an und speichern Sie die Bilder mit " Clip speichern " oder " Rahmen speichern" für spätere Messungen¹⁶.
6. Wechseln Sie in den M-Modus (Bewegungsmodus) und platzieren Sie die M-Mode-Achse auf Höhe des Papillarmuskels. Passen Sie die Gate-Größe an und tippen Sie auf die Schaltfläche Start im M-Modus. Speichern Sie die Bilder mit "Clip speichern" oder "Rahmen^{speichern 16,17}".
7. Da der Bilderfassungsprozess im 4D-Modus automatisiert ist, überprüfen Sie, ob die EKG- und Atmungssignale aktiv sind (Abbildung 1), bevor Sie die Daten erfassen.
8. Beginnen Sie mit der Erfassung der Daten im B-Modus. Öffnen Sie das 4D-Scanfeld und starten Sie den 3D-Motor. Stellen Sie die Bildparameter im 4D Scan-Bedienfeld ein und tippen Sie auf die Schaltfläche Scannen , um den Scanvorgang zu starten. Nachdem Sie die Bilder in der 2D-Ansicht überprüft haben, laden Sie die Bilder mit der Schaltfläche In 4D laden in den 4D-Modus .

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die repräsentativen aktiven EKG- und Atmungssignale während der echokardiographischen Auswertung von Scheinmäusen (Abbildung 1A) und MI (Abbildung 1B). Die Überprüfung der aktiven EKG- und Atmungssignale ist wichtig, bevor die echokardiographischen Daten erfasst werden. Abbildung 2 zeigt die echokardiographische Messung von Herzfunktionsparametern nach 28 Tagen n...

Diskussion

Das murine Modell von MI gewinnt in kardiovaskulären Forschungslabors an Popularität, und diese Studie beschreibt ein reproduzierbares und klinisch relevantes MI-Modell. Dieses Protokoll verbessert den LCA-Ligationsprozess in mehrfacher Hinsicht. Zunächst wird der Einsatz von injizierbaren präoperativen Anästhetika wie Xylazin/Ketamin oder Natrium-Pentobarbital^14,15 vermieden. Es wurde nur eine Isofluran-Anästhesie verwendet, die dazu beiträgt, die Überle...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis