Ligature de l’artère coronaire gauche: un modèle murin chirurgical d’infarctus du myocarde

Résumé

Présenté ici est une procédure chirurgicale pour la ligature permanente de l’artère coronaire gauche chez la souris. Ce modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et la réponse inflammatoire associée après un infarctus du myocarde.

Résumé

La cardiopathie ischémique et l’infarctus du myocarde (IM) subséquent sont l’une des principales causes de mortalité aux États-Unis et dans le monde. Afin d’explorer les changements physiopathologiques après un infarctus du myocarde et de concevoir de futurs traitements, des modèles de recherche de l’IM sont nécessaires. La ligature permanente de l’artère coronaire gauche (ACL) chez la souris est un modèle populaire pour étudier la fonction cardiaque et le remodelage ventriculaire après l’IM. Nous décrivons ici un modèle chirurgical d’IM murin moins invasif, fiable et reproductible par ligature permanente de l’ACL. Notre modèle chirurgical comprend une anesthésie générale facilement réversible, une intubation endotrachéale qui ne nécessite pas de trachéotomie et une thoracotomie. L’électrocardiographie et la mesure de la troponine doivent être effectuées pour assurer l’IM. L’échocardiographie au jour 28 après l’IM permettra de discerner la fonction cardiaque et les paramètres d’insuffisance cardiaque. Le degré de fibrose cardiaque peut être évalué par la coloration trichrome de Masson et l’IRM cardiaque. Ce modèle d’IM est utile pour étudier les altérations physiopathologiques et immunologiques après un IM.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont un problème majeur de santé publique qui fait 17,9 millions de victimes chaque année, soit 31 % de la mortalité mondiale¹. Le type d’anomalie cardiovasculaire le plus répandu est la maladie coronarienne, et l’infarctus du myocarde (IM) est l’une des principales manifestations de la maladie coronarienne². L’IM est généralement causée par une occlusion thrombotique d’une artère coronaire due à la rupture d’une plaque vulnérable³. L’ischémie qui en résulte provoque de profonds changements ioniques et métaboliques dans le myocarde affecté, ainsi qu’une diminution rapide de la fonction systolique. L’IM entraîne la mort des cardiomyocytes, ce qui peut entraîner un dysfonctionnement ventriculaire et une insuffisance cardiaque⁴.

La recherche sur l’IM chez les patients est limitée en raison de la rareté des tissus obtenus chez les patients atteints d’IM⁵. En tant que tels, les modèles murins de l’IM sont utiles à la fois pour étudier les mécanismes de la maladie et pour développer des cibles thérapeutiques potentielles. Les modèles murins actuellement disponibles d’IM comprennent des modèles d’ischémie irréversible (ACV et méthodes d’ablation) et des modèles de reperfusion (ischémie/reperfusion, I/R)⁶. La ligature permanente de l’artère coronaire gauche (ACL) chez la souris est la méthode la plus utilisée, et elle imite la physiopathologie et l’immunologie de l’IM chez les patients ^7,8,9. L’IM permanent peut également être induit par des méthodes d’ablation, qui impliquent des dommages électriques ou des cryoblessures. Les méthodes d’ablation sont capables de générer un infarctus de taille uniforme à l’endroit précis¹⁰. D’autre part, la formation de cicatrices, la morphologie de l’infarctus et les mécanismes de signalisation moléculaire peuvent varier selon les méthodes d’ablation^10,11. La méthode I/R murine est un autre modèle important d’IM car elle représente le scénario clinique de la thérapie de reperfusion¹². Le modèle I/R est associé à des défis tels qu’une taille variable de l’infarctus, la difficulté à distinguer les réponses de la blessure initiale et la reperfusion⁶.

Bien que largement utilisées, les méthodes de ligature de l’ACL sont associées à de faibles taux de survie et à des douleurs postopératoires¹³. Ce protocole démontre le modèle chirurgical murin de ligature de l’ACL qui implique la préparation et l’intubation de souris, la ligature de l’ACL, les soins postopératoires et la validation de l’IM. Plutôt que d’utiliser une trachéotomie^{invasive 14}, cette méthode utilise l’intubation endotrachéale. L’animal est intubé en éclairant l’oropharynx à l’aide d’un laryngoscope, ce qui rend la procédure plus facile, plus sûre et moins traumatisante¹⁵. La souris est maintenue sous assistance respiratoire et sous anesthésie à l’isoflurane tout au long de la procédure. De plus, l’échocardiographie et la coloration trichrome de Masson sont effectuées pour évaluer la fonction cardiaque et la fibrose cardiaque après un IM, respectivement. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un modèle murin chirurgical fiable et reproductible de l’IM qui peut être utilisé pour étudier la physiopathologie et l’inflammation après un IM.

Protocole

Le présent protocole d’étude a été examiné et approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Pittsburgh. Huit souris C57BL/6J femelles (simulé n = 4 et MI n = 4) âgées de 1 an pesant entre 24 et 30 g ont été utilisées pour ces expériences. Environ 100% et au moins 80% des souris ont survécu au cours des premières 24 heures et 28 jours, respectivement.

1. Préparation et intubation endotrachéale des souris

1. Préchauffez un stérilisateur à billes (voir le tableau des matériaux) à 250 °C et placez-y des instruments chirurgicaux autoclavés pendant quelques minutes.
2. Anesthésier la souris dans une chambre d’induction avec 3% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène pendant 5 min.
3. Assurez-vous de la profondeur de l’anesthésie chez la souris en vérifiant la réponse à un pincement ferme des orteils.
4. Peser la souris pour estimer la posologie de l’analgésique préopératoire, la buprénorphine (0,1 mg/kg). Injectez le médicament par voie intrapéritonique.
5. Coupez la fourrure sur le côté gauche du thorax à l’aide d’un rasoir électrique.
6. Désinfectez le site chirurgical avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70% trois fois.
7. Placez la souris en décubitus dorsal sur une planche inclinée. Fixez la tête et les membres de la souris à l’aide d’une bande élastique fixée aux incisives supérieures et au ruban adhésif, respectivement. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
8. Ouvrez la mâchoire et retirez doucement la langue de la cavité buccale.
9. Identifier l’ouverture du larynx en éclairant l’oropharynx à l’aide d’un laryngoscope (voir le tableau des matériaux).
10. Coupez environ 0,5 cm d’une aiguille de cathéter de 24 G et insérez l’aiguille émoussée dans le bouclier en plastique. Dirigez l’aiguille émoussée avec le bouclier en plastique dans la trachée. Sortez l’aiguille en laissant le bouclier en plastique dans la trachée.
11. Réglez le ventilateur (voir le tableau des matériaux) à une fréquence respiratoire de 137 battements par minute (optimisée pour les souris utilisées dans cette étude) et un volume courant de 0,18 cc. Connectez les tubes du respirateur au bouclier du cathéter et confirmez l’intubation correcte en recherchant un mouvement thoracique synchronisé avec le ventilateur.
12. Débranchez le tube respiratoire de l’écran du cathéter et placez l’animal en décubitus dorsal sur une planche chirurgicale préchauffée à température contrôlée. Reconnectez la souris au ventilateur.

2. Ligature permanente de l’artère coronaire gauche

1. Désinfectez le site chirurgical avec de la povidone iodée et de l’alcool à 70%. Appliquez un champ stérile ayant un trou de la taille d’un quart au centre pour sécuriser le site chirurgical. Soulevez doucement la peau à l’aide d’une paire de pinces et faites une petite incision transversale cutanée (1,5-2 cm) le long de la ligne entre le grand pectoral gauche et les muscles mineurs à l’aide d’une paire de ciseaux chirurgicaux.
   REMARQUE: Des ciseaux ont été utilisés pour faire l’incision car ils fournissent le contrôle requis sur la profondeur et la direction de la coupe.
2. Séparez les muscles pectoraux sous-jacents avec des pinces et des ciseaux à dissectionner. Les muscles ont été séparés à l’aide de rétracteurs attachés à des bandes élastiques.
3. Faites une incision dans le troisième espace intercostal avec une paire de micro-ciseaux en suivant l’angle naturel de la cage thoracique. À ce stade, une extrême prudence doit être exercée pour éviter les blessures au cœur et aux poumons.
4. Étirez doucement les côtes à l’aide de rétracteurs pour exposer le ventricule gauche. Déplacez la graisse péricardique de côté et localisez l’ACV, qui s’étend du bord de l’oreillette gauche vers l’apex du cœur.
5. Passer un 8-0 suture en nylon sous l’ACV à l’aide d’un porte-aiguille. Libellez l’ACV avec un double nœud suivi d’un deuxième nœud (un nœud de chirurgien modifié).
   REMARQUE: Le blanchiment du ventricule inférieur gauche confirme une ligature ACL réussie. En plus de cela, la mesure de la troponine, la surveillance de l’ECG (élévation du ST), l’écho / IRM cardiaque in vivo ou les images micro-CT sont également conseillées pour confirmer les lésions MI comparables.
6. Retirez les rétracteurs et insérez une aiguille de cathéter de 22 G dans la cavité thoracique. Retirez l’aiguille en laissant l’extrémité du bouclier en plastique dans la cavité thoracique. Fermez la cage thoracique à l’aide d’une suture en nylon 4-0.
7. Connectez une seringue au bouclier en plastique de 22 G et retirez lentement l’excès d’air emprisonné dans la cavité thoracique en appuyant doucement sur la poitrine pour établir une pression d’air négative. Retirez le bouclier en plastique.
8. Fermez la peau avec une suture en nylon 4-0.
9. Coupez l’alimentation en isoflurane. À ce stade, la souris est sur le ventilateur fournissant de l’oxygène.

3. Soins postopératoires

1. Éteignez le ventilateur une fois que la respiration spontanée commence.
   REMARQUE: La procédure prend environ 30-35 minutes par animal de la préparation des souris jusqu’à cette étape.
2. Gardez la souris sous une lampe chauffante et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit réveillée. L’animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait recouvré suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
3. Après la chirurgie, placez l’animal dans une cage séparée et remettez-le dans la cage d’origine avec d’autres animaux seulement après son rétablissement complet.
4. Surveillez la souris quotidiennement pour tout signe de douleur ou d’inconfort.
5. Poursuivre l’injection intrapéritonéale de buprénorphine (0,1 mg / kg) toutes les 6-8 heures pendant 2 jours supplémentaires après la chirurgie.

4. Évaluation échocardiographique

REMARQUE: Une échocardiographie a été réalisée pour évaluer les paramètres de l’insuffisance cardiaque le jour 28 après l’IM.

1. Après 28 jours après la chirurgie, anesthésiez les souris avec 3% d’isoflurane et 1 L / min d’oxygène, appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur les yeux et enlevez les poils de la poitrine à l’aide d’une crème dépilatoire. Désinfectez la poitrine avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70% trois fois.
2. Fixez les souris anesthésiées au sommet de la plateforme d’imagerie (voir le tableau des matériaux) en décubitus dorsal et maintenez un niveau constant d’anesthésie tout au long de la procédure à l’aide d’un cône nasal relié au système anesthésique (1 % à 2 % d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène).
3. Collez les quatre pattes aux électrodes ECG avec du gel d’électrode (voir le tableau des matériaux). Surveillez la température de l’animal en insérant une sonde rectale (voir le tableau des matériaux).
4. Appliquez le gel de balayage (voir le tableau des matériaux) sur la poitrine, placez le transducteur verticalement, abaissez-le jusqu’à la ligne parasternale (parallèle au thorax) et faites pivoter de 35° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour obtenir la vue parasternale à grand axe du ventricule gauche.
5. Appuyez sur le bouton d’imagerie en mode B du logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) pour obtenir une vue complète du cœur sur l’axe long. Ajustez la taille et la luminosité de la porte et enregistrez les images à l’aide de Save Clip ou Save Frame pour des mesures ultérieures¹⁶.
6. Passez en mode M (mode mouvement) et placez l’axe du mode M au niveau du muscle papillaire. Ajustez la taille de la porte et appuyez sur le bouton Démarrer en mode M. Enregistrez les images à l’aide de Save Clip ou Save Frame ^16,17.
7. Comme le processus d’acquisition d’images en mode 4D est automatisé, vérifiez que les signaux ECG et respiratoire sont actifs (Figure 1) avant d’acquérir les données.
8. Commencez à acquérir les données en mode B. Ouvrez le panneau de numérisation 4D et lancez le moteur 3D. Définissez les paramètres de l’image dans le panneau de numérisation 4D et appuyez sur le bouton Numérisation pour commencer la numérisation. Après avoir examiné les images dans la vue 2D, chargez-les en mode 4D à l’aide du bouton Charger dans 4D .

Résultats

La figure 1 montre les signaux ECG et respiratoires actifs représentatifs lors de l’évaluation échocardiographique de souris simulées (Figure 1A) et MI (Figure 1B). La vérification de l’ECG actif et des signaux respiratoires est importante avant d’acquérir les données échocardiographiques. La figure 2 montre la mesure échocardiographique des paramètres fonctionnels card...

Discussion

Le modèle murin de l’IM gagne en popularité dans les laboratoires de recherche cardiovasculaire, et cette étude décrit un modèle d’IM reproductible et cliniquement pertinent. Ce protocole améliore le processus de ligature de l’ACV de plusieurs façons. Pour commencer, l’utilisation d’anesthésiques préopératoires injectables tels que la xylazine/kétamine ou le pentobarbital^{sodique 14,15} est évitée. Seule l’anesthésie à l’isoflurane a é...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis