Перевязка левой коронарной артерии: хирургическая мышиная модель инфаркта миокарда

Резюме

Здесь представлена хирургическая процедура перманентной перевязки левой коронарной артерии у мышей. Эта модель может быть использована для исследования патофизиологии и связанной с ней воспалительной реакции после инфаркта миокарда.

Аннотация

Ишемическая болезнь сердца и последующий инфаркт миокарда (ИМ) является одной из ведущих причин смертности в Соединенных Штатах и во всем мире. Для изучения патофизиологических изменений после инфаркта миокарда и разработки будущих методов лечения необходимы исследовательские модели ИМ. Постоянная перевязка левой коронарной артерии (LCA) у мышей является популярной моделью для исследования сердечной функции и ремоделирования желудочков после ИМ. Здесь мы описываем менее инвазивную, надежную и воспроизводимую хирургическую модель инфаркта миокарда мыши путем постоянного перевязки LCA. Наша хирургическая модель состоит из легко обратимой общей анестезии, эндотрахеальной интубации, не требующей трахеотомии, и торакотомии. Электрокардиография и измерение тропонина должны быть выполнены для обеспечения инфаркта миокарда. Эхокардиография на 28-й день после инфаркта миокарда позволит определить функцию сердца и параметры сердечной недостаточности. Степень фиброза сердца можно оценить с помощью трихромного окрашивания Массона и МРТ сердца. Эта модель инфаркта миокарда полезна для изучения патофизиологических и иммунологических изменений после инфаркта миокарда.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных проблем общественного здравоохранения, которая ежегодно уносит 17,9 миллиона жизней, что составляет 31 процент глобальной^{смертности1}. Наиболее распространенным типом сердечно-сосудистой аномалии является ишемическая болезнь сердца, а инфаркт миокарда (ИМ) является одним из основных проявлений ишемической болезни сердца². ИМ обычно вызывается тромботической окклюзией коронарной артерии из-за разрыва уязвимой бляшки³. Возникающая в результате ишемия вызывает глубокие ионные и метаболические изменения в пораженном миокарде, а также быстрое снижение систолической функции. Инфаркт миокарда приводит к гибели кардиомиоцитов, что в дальнейшем может привести к дисфункции желудочков и сердечной недостаточности⁴.

Исследования ИМ у пациентов ограничены из-за дефицита тканей, полученных от пациентов с ИМ⁵. Таким образом, мышиные модели инфаркта миокарда полезны как для изучения механизмов заболевания, так и для разработки потенциальных терапевтических мишеней. Доступные в настоящее время мышиные модели инфаркта миокарда включают модели необратимой ишемии (LCA и методы абляции) и модели реперфузии (ишемия/реперфузия, I/R)⁶. Постоянное перевязка левой коронарной артерии (LCA) у мышей является наиболее часто используемым методом и имитирует патофизиологию и иммунологию ИМ у пациентов ^7,8,9. Постоянный инфаркт миокарда также может быть вызван методами абляции, которые связаны с электрическим повреждением или криотравмой. Методы абляции способны генерировать инфаркт одинакового размера в точном месте¹⁰. С другой стороны, образование рубцов, морфология инфаркта и молекулярные сигнальные механизмы могут варьироваться в зависимости от методов абляции^10,11. Метод I/R у мышей является еще одной важной моделью ИМ, поскольку он представляет собой клинический сценарий реперфузионной терапии¹². Модель I/R связана с такими проблемами, как переменный размер инфаркта, трудности в различении реакций первоначальной травмы и реперфузия⁶.

Несмотря на широкое распространение, методы лигирования LCA связаны с низкой выживаемостью и послеоперационной болью¹³. Этот протокол демонстрирует мышиную хирургическую модель ИМ лигирования LCA, которая включает подготовку и интубацию мышей, лигирование LCA, послеоперационный уход и валидацию MI. Вместо использования инвазивной трахеотомии¹⁴ в этом методе используется эндотрахеальная интубация. Животное интубируют, освещая ротоглотку с помощью ларингоскопа, что делает процедуру проще, безопаснее и менее травматичной¹⁵. Мышь находится на аппарате искусственной вентиляции легких и под изофлурановой анестезией на протяжении всей процедуры. Кроме того, эхокардиография и трихромное окрашивание Массона выполняются для оценки функции сердца и фиброза сердца после ИМ соответственно. В целом, этот метод обеспечивает надежную и воспроизводимую хирургическую мышиную модель ИМ, которая может быть использована для изучения патофизиологии и воспаления после ИМ.

протокол

Настоящий протокол исследования был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Питтсбурга. Для этих экспериментов использовали восемь (фиктивные n = 4 и MI n = 4) 1-летних самок мышей C57BL/6J весом 24-30 г. Приблизительно 100% и, по крайней мере, 80% мышей выжили в первые 24 ч и 28 дней соответственно.

1. Подготовка и эндотрахеальная интубация мышей

1. Разогрейте стерилизатор (см. Таблицу материалов) до 250 °C и поместите в него автоклавные хирургические инструменты на несколько минут.
2. Обезболивают мышей в индукционной камере 3% изофлураном и 1 л/мин кислорода в течение 5 мин.
3. Обеспечьте глубину анестезии в мыши, проверив реакцию на твердое защемление пальца ноги.
4. Взвесьте мышь, чтобы оценить дозировку предоперационного обезболивающего препарата бупренорфина (0,1 мг / кг). Вводят препарат интраперитонально.
5. Подстригите шерсть с левой стороны грудной клетки с помощью электрической бритвы.
6. После этого трижды продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% этанолом.
7. Поместите мышь в положение лежа на спине на наклонной доске. Закрепите голову и конечности мыши с помощью резинки, прикрепленной к верхним резцам и скотча соответственно. Нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
8. Откройте челюсть и осторожно вытащите язык из ротовой полости.
9. Определить отверстие гортани можно, осветив ротоглотку с помощью ларингоскопа (см. Таблицу материалов).
10. Отрежьте около 0,5 см от иглы катетера 24 G и вставьте тупую иглу в пластиковый щиток. Направьте тупую иглу с пластиковым щитком в трахею. Выньте иглу, оставив пластиковый щиток в трахее.
11. Установите аппарат ИВЛ (см. Таблицу материалов) на частоту дыхания 137 ударов в минуту (оптимизированную для мышей, используемых в этом исследовании) и дыхательный объем 0,18 куб. см. Подсоедините респираторные трубки к экрану катетера и подтвердите правильность интубации, посмотрев на синхронизированное движение грудной клетки с аппаратом искусственной вентиляции легких.
12. Отсоедините респираторную трубку от щитка катетера и поместите животное в положение лежа на спине на предварительно нагретую хирургическую доску с регулируемой температурой. Снова подключите мышь к аппарату искусственной вентиляции легких.

2. Постоянная перевязка левой коронарной артерии

1. Продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% спиртом. Наложите стерильную простыню с отверстием размером с четверть в центре, чтобы закрепить место операции. Аккуратно поднимите кожу с помощью щипцов и сделайте небольшой (1,5-2 см) поперечный разрез кожи вдоль линии между большой и малой мышцами левой грудной мышцы с помощью хирургических ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для разреза использовались ножницы, поскольку они обеспечивают необходимый контроль над глубиной и направлением разреза.
2. Отделите нижележащие грудные мышцы щипцами и рассекающими ножницами. Мышцы были разделены с помощью ретракторов, прикрепленных к эластичным лентам.
3. Сделайте разрез в третьем межреберье микроножницами, следуя естественному углу грудной клетки. На этом этапе необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы предотвратить повреждение сердца и легких.
4. Осторожно растяните ребра с помощью ретракторов, чтобы обнажить левый желудочек. Отодвиньте перикардиальный жир в сторону и найдите LCA, который проходит от края левого предсердия к вершине сердца.
5. Пас 8-0 нейлоновый шов под LCA с помощью иглодержателя. Перевязывайте LCA двойным узлом, за которым следует второй узел (модифицированный узел хирурга).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Побледнение нижнего левого желудочка подтверждает успешную перевязку LCA. В дополнение к этому, измерение тропонина, мониторинг ЭКГ (подъем сегмента ST), эхо / in vivo кардиоуправляемая МРТ или микро-КТ также рекомендуются для подтверждения сопоставимых поражений ИМ.
6. Извлеките ретракторы и вставьте иглу катетера 22 G в грудную полость. Извлеките иглу, оставив кончик пластикового щитка в грудной полости. Закройте грудную клетку нейлоновым швом 4-0.
7. Подсоедините шприц к пластиковому экрану 22 G и медленно удалите лишний воздух, попавший в грудную полость, осторожно нажимая на грудную клетку, чтобы установить отрицательное давление воздуха. Снимите пластиковый щиток.
8. Закройте кожу нейлоновым швом 4-0.
9. Отключите подачу изофлурана. На этом этапе мышь находится на аппарате искусственной вентиляции легких, подающем кислород.

3. Послеоперационный уход

1. Выключите аппарат искусственной вентиляции легких, как только начнется спонтанное дыхание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура занимает около 30-35 минут на животное с момента подготовки мышей до этого этапа.
2. Держите мышь под нагревательной лампой и следите за ней, пока она не проснется. Животное не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
3. После операции поместите животное в отдельную клетку и верните его в исходную клетку с другими животными только после того, как оно полностью выздоровеет.
4. Ежедневно следите за мышью на наличие любых признаков боли или дискомфорта.
5. Продолжайте внутрибрюшинную инъекцию бупренорфина (0,1 мг / кг) каждые 6-8 часов в течение дополнительных 2 дней после операции.

4. Эхокардиографическая оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиография была выполнена для оценки параметров сердечной недостаточности на 28-й день после ИМ.

1. Через 28 дней после операции обезболите мышей 3% изофлураном и 1 л / мин кислорода, нанесите стерильную офтальмологическую смазку на глаза и удалите волосы на груди с помощью крема для удаления волос. Трижды продезинфицируйте область грудной клетки повидон-йодом и 70% этанолом.
2. Закрепите анестезированных мышей на платформе визуализации (см. Таблицу материалов) в положении лежа на спине и поддерживайте постоянный уровень анестезии на протяжении всей процедуры, используя носовой конус, подключенный к анестезиологической системе (1% -2% изофлурана и 1 л / мин кислорода).
3. Прикрепите четыре лапы к электродам ЭКГ электродным гелем (см. Таблицу материалов). Следите за температурой животного, вставляя ректальный зонд (см. Таблицу материалов).
4. Нанесите сканирующий гель (см. Таблицу материалов) на грудную клетку, поместите датчик вертикально, опустите его на парастернальную линию (параллельно грудной клетке) и поверните на 35° против часовой стрелки, чтобы получить вид левого желудочка по длинной оси парастерна.
5. Нажмите кнопку визуализации в B-режиме на программном обеспечении для визуализации (см. Таблицу материалов), чтобы получить полный вид сердца по длинной оси. Отрегулируйте размер и яркость затвора и сохраните изображения с помощью «Сохранить клип » или « Сохранить кадр» для последующих измерений¹⁶.
6. Переключитесь в М-режим (motion-mode) и расположите ось М-режима на уровне сосочковой мышцы. Отрегулируйте размер ворот и нажмите кнопку «Пуск» в режиме M. Сохраните изображения с помощью Save Clip или Save Frame^16,17.
7. Поскольку процесс получения изображений в режиме 4D автоматизирован, перед получением данных убедитесь, что сигналы ЭКГ и дыхания активны (рис. 1).
8. Начните получать данные в B-режиме. Откройте панель 4D-сканирования и запустите 3D-двигатель. Установите параметры изображения на панели 4D-сканирования и нажмите кнопку «Сканировать », чтобы начать сканирование. После просмотра изображений в 2D-представлении загрузите изображения в режим 4D с помощью кнопки «Загрузить в 4D ».

Результаты

На рисунке 1 показаны репрезентативные активные сигналы ЭКГ и дыхания во время эхокардиографической оценки фиктивных (рис. 1А) и инфаркта миокарда (рис. 1Б). Проверка активных сигналов ЭКГ и дыхания важна перед получением эхокардиографиче?...

Обсуждение

Мышиная модель инфаркта миокарда набирает популярность в сердечно-сосудистых исследовательских лабораториях, и в этом исследовании описывается воспроизводимая и клинически значимая модель инфаркта миокарда. Этот протокол улучшает процесс лигирования LCA несколькими способами. Начн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis