קשירת עורקים כליליים שמאליים: מודל מורין כירורגי של אוטם שריר הלב

Summary

מוצג כאן הליך כירורגי לקשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי בעכברים. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה ואת התגובה הדלקתית הקשורים לאחר אוטם שריר הלב.

Abstract

מחלת לב איסכמית ואוטם שריר הלב (MI) לאחר מכן היא אחד הגורמים המובילים לתמותה בארצות הברית וברחבי העולם. על מנת לחקור את השינויים הפתופיזיולוגיים לאחר אוטם שריר הלב ולתכנן טיפולים עתידיים, נדרשים מודלים מחקריים של MI. קשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי (LCA) בעכברים היא מודל פופולרי לחקר תפקוד הלב ועיצוב מחדש של החדרים לאחר MI. כאן אנו מתארים מודל MI כירורגי פחות פולשני, אמין וניתן לשחזור על ידי קשירה קבועה של LCA. המודל הניתוחי שלנו כולל הרדמה כללית הפיכה בקלות, אינטובציה אנדוטרכאלית שאינה דורשת טרכאוטומיה ותורקוטומיה. יש לבצע אלקטרוקרדיוגרפיה ומדידת טרופונין כדי להבטיח MI. אקוקרדיוגרפיה ביום 28 לאחר MI תבחין בתפקוד הלב ובפרמטרים של אי ספיקת לב. ניתן להעריך את מידת הפיברוזיס הלבבי על ידי צביעת טריכרום ו- MRI לב של מאסון. מודל MI זה שימושי לחקר השינויים הפתופיזיולוגיים והאימונולוגיים לאחר MI.

Introduction

מחלות לב וכלי דם הן דאגה מרכזית לבריאות הציבור שגובה את חייהם של 17.9 מיליון בני אדם מדי שנה, ומהווה 31% מהתמותה העולמית¹. הסוג השכיח ביותר של אנומליה קרדיווסקולרית הוא מחלת לב כלילית, ואוטם שריר הלב (MI) הוא אחד הביטויים העיקריים של מחלת לב כלילית². MI נגרמת בדרך כלל על ידי חסימה טרומבוטית של עורק כלילי עקב קרע של רובד פגיע³. האיסכמיה המתקבלת גורמת לשינויים יוניים ומטבוליים עמוקים בשריר הלב המושפע, כמו גם לירידה מהירה בתפקוד הסיסטולי. MI גורם למוות של קרדיומיוציטים, אשר יכול להוביל עוד יותר לתפקוד לקוי של החדרים ואי ספיקת לב⁴.

המחקר על MI בחולים מוגבל בשל מחסור ברקמות המתקבלות מחולים עם MI⁵. ככאלה, מודלים של MI שימושיים הן בחקר מנגנוני המחלה והן בפיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות. המודלים הקיימים כיום של MI כוללים מודלים בלתי הפיכים של איסכמיה (LCA ושיטות אבלציה) ומודלים של רפרפוזיה (איסכמיה/רפרפוזיה, I/R)⁶. קשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי (LCA) בעכברים היא השיטה הנפוצה ביותר, והיא מחקה את הפתופיזיולוגיה והאימונולוגיה של MI בחולים ^7,8,9. MI קבוע יכול להיגרם גם על ידי שיטות אבלציה, אשר כרוך נזק חשמלי או cryoinjury. שיטות אבלציה מסוגלות ליצור אוטם בגודל אחיד במיקום המדויק¹⁰. מצד שני, היווצרות צלקת, מורפולוגיית אוטם ומנגנוני איתות מולקולריים עשויים להשתנות בין שיטות האבלציה^10,11. שיטת Murine I/R היא מודל MI חשוב נוסף מכיוון שהיא מייצגת את התרחיש הקליני של טיפול ברפרפוזיה¹². מודל I/R קשור לאתגרים כגון גודל אוטם משתנה, קושי להבחין בין תגובות של פגיעה ראשונית ורפרפוזיה⁶.

למרות השימוש הנפוץ, שיטות קשירת LCA קשורות לשיעורי הישרדות נמוכים וכאב לאחר הניתוח¹³. פרוטוקול זה מדגים את מודל MI הכירורגי של קשירת LCA הכולל הכנה ואינטובציה של עכברים, קשירת LCA, טיפול לאחר ניתוח ותיקוף של MI. במקום להשתמש בטרכאוטומיה פולשנית¹⁴, שיטה זו משתמשת באינטובציה אנדוטרכאלית. החיה עוברת אינטובציה על ידי הארת הלוע באמצעות לרינגוסקופ, מה שהופך את ההליך לקל, בטוח יותר ופחות טראומטי¹⁵. העכבר מוחזק על תמיכת הנשמה ותחת הרדמה איזופלורנית לאורך כל ההליך. יתר על כן, אקוקרדיוגרפיה וצביעת טריכרום של מאסון מבוצעות כדי להעריך את תפקוד הלב ואת פיברוזיס הלב לאחר MI, בהתאמה. בסך הכל, שיטה זו מספקת מודל מורין כירורגי אמין וניתן לשחזור של MI שניתן להשתמש בו כדי ללמוד פתופיזיולוגיה ודלקת לאחר MI.

Protocol

פרוטוקול המחקר הנוכחי נבדק ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת פיטסבורג. שמונה עכברי C57BL/6J בנות שנה (sham n = 4 ו-MI n = 4) בנות שנה במשקל 24-30 גרם שימשו לניסויים אלה. כ-100% ולפחות 80% מהעכברים שרדו ב-24 וב-28 הימים הראשונים, בהתאמה.

1. הכנה ואינטובציה אנדוטרכאלית של העכברים

1. מחממים מעקר חרוזים (ראו טבלת חומרים) ל-250°C ומניחים בו כלי ניתוח אוטוקלאביים למשך מספר דקות.
2. מרדימים את העכבר בתא אינדוקציה עם 3% איזופלורן ו-1 ליטר/דקה חמצן למשך 5 דקות.
3. ודא את עומק ההרדמה בעכבר על ידי בדיקת התגובה לצביטת בוהן יציבה.
4. שקול את העכבר כדי להעריך את המינון של התרופה משככת כאבים לפני הניתוח, buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג). להזריק את התרופה intraperitonially.
5. קצצו את הפרווה בצד שמאל של בית החזה באמצעות סכין גילוח חשמלי.
6. יש לחטא את אתר הניתוח בפובידון-יוד ובאתנול 70% לאחר מכן שלוש פעמים.
7. מקם את העכבר במצב שכיבה על לוח נוטה. אבטח את ראשו וגפיו של העכבר באמצעות רצועה אלסטית המחוברת לשיניים החותכות העליונות ולסרט הדבקה, בהתאמה. החל חומר סיכה אופתלמי סטרילי על העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
8. פתחו את הלסת ומשכו בעדינות את הלשון מחלל הפה.
9. זהה את פתח הגרון על ידי הארת הלוע באמצעות לרינגוסקופ (ראה טבלת חומרים).
10. חותכים כ-0.5 ס"מ ממחט צנתר 24 גרם ומחדירים את המחט הקהה למגן הפלסטיק. כוונו את המחט הקהה עם מגן הפלסטיק לתוך קנה הנשימה. מוציאים את המחט, ומשאירים את מגן הפלסטיק לתוך קנה הנשימה.
11. כוונו את מכונת ההנשמה (ראו טבלת חומרים) לקצב נשימה של 137 פעימות לדקה (מותאם לעכברים ששימשו במחקר זה) ולנפח גאות ושפל של 0.18 סמ"ק. חבר את צינורות ההנשמה למגן הצנתר וודא אינטובציה תקינה על ידי חיפוש תנועת חזה מסונכרנת עם מכונת ההנשמה.
12. נתק את צינור ההנשמה ממגן הצנתר והנח את בעל החיים במצב שכיבה על לוח ניתוחים מבוקר טמפרטורה שחומם מראש. חבר מחדש את העכבר למכונת ההנשמה.

2. קשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי

1. לחטא את אתר הניתוח עם פובידון-יוד ו 70% אלכוהול. החל וילון סטרילי עם חור בגודל רבע במרכז כדי לאבטח את אתר הניתוח. הרימו בעדינות את העור באמצעות זוג מלקחיים ובצעו חתך עורי רוחבי קטן (1.5-2 ס"מ) לאורך הקו שבין שרירי החזה השמאלי הגדול לשרירי המינור באמצעות זוג מספריים כירורגיים.
   הערה: מספריים שימשו לביצוע החתך מכיוון שהוא מספק את השליטה הנדרשת על עומק וכיוון החיתוך.
2. הפרידו את שרירי החזה הבסיסיים בעזרת מלקחיים ומספריים מנתחים. השרירים הופרדו באמצעות retractors מחובר רצועות אלסטיות.
3. בצע חתך בחלל הבין-קוסטלי השלישי עם זוג מספריים מיקרו בעקבות הזווית הטבעית של כלוב הצלעות. בשלב זה יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה בלב ובריאות.
4. מתחו בעדינות את הצלעות זו מזו באמצעות retractors כדי לחשוף את החדר השמאלי. הזיזו את שומן קרום הלב הצידה ואתרו את ה-LCA, הזורם מקצה האטריום השמאלי לכיוון קודקוד הלב.
5. פס"ד 8-0 תפר ניילון מתחת ל- LCA בעזרת מחזיק מחט. קשר את ה- LCA עם קשר כפול ואחריו קשר שני (קשר מנתח שונה).
   הערה: הלבנה של החדר השמאלי התחתון מאשרת קשירת LCA מוצלחת. בנוסף לכך, מדידת טרופונין, ניטור א.ק.ג. (גובה ST), אקו / in vivo מגודר לב, או תמונות micro-CT מומלץ גם לאשר את נגעי MI דומים.
6. הסר את retractors ולהכניס מחט קטטר 22 G לתוך חלל החזה. הסר את המחט, משאיר את קצה מגן הפלסטיק בחלל החזה. סגור את כלוב הצלעות באמצעות תפר ניילון 4-0.
7. חבר מזרק למגן הפלסטיק 22 G והסר באיטיות עודפי אוויר הכלואים בחלל בית החזה על ידי לחיצה עדינה על החזה כדי ליצור לחץ אוויר שלילי. הסירו את מגן הפלסטיק.
8. סוגרים את העור בתפר ניילון 4-0.
9. כבה את אספקת האיזופלורן. בשלב זה, העכבר נמצא על מכונת ההנשמה המספקת חמצן.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. כבו את מכונת ההנשמה ברגע שמתחילה נשימה ספונטנית.
   הערה: ההליך אורך כ-30-35 דקות לכל בעל חיים מהכנת העכברים ועד לשלב זה.
2. שמור את העכבר מתחת למנורת חום ועקוב אחריו עד שהוא ער. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא התאושש מספיק בהכרה כדי לשמור על שכיבת עצם החזה.
3. לאחר הניתוח, הניחו את בעל החיים בכלוב נפרד והחזירו אותו לכלוב המקורי עם בעלי חיים אחרים רק לאחר החלמתו המלאה.
4. עקוב אחר העכבר מדי יום עבור כל סימן של כאב או אי נוחות.
5. יש להמשיך בהזרקה תוך צפקית של בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) כל 6-8 שעות למשך יומיים נוספים לאחר הניתוח.

4. הערכה אקוקרדיוגרפית

הערה: אקוקרדיוגרפיה בוצעה כדי להעריך את הפרמטרים של אי ספיקת לב ביום 28 לאחר MI.

1. לאחר 28 ימים לאחר הניתוח, יש להרדים את העכברים עם 3% איזופלורן ו-1 ליטר חמצן, למרוח חומר סיכה סטרילי על העיניים ולהסיר את שיער החזה באמצעות קרם להסרת שיער. יש לחטא את אזור החזה בפובידון-יוד ובאתנול 70% שלוש פעמים.
2. אבטחו את העכברים המורדמים על גבי פלטפורמת ההדמיה (ראו טבלת חומרים) במצב שכיבה ושמרו על רמת הרדמה קבועה לאורך כל ההליך באמצעות חרוט אף המחובר למערכת ההרדמה (1%-2% איזופלורן ו-1 ליטר/דקה חמצן).
3. הדביקו את ארבע הכפות לאלקטרודות האק"ג בעזרת אלקטרודה ג'ל (ראו טבלת חומרים). עקוב אחר הטמפרטורה של בעל החיים על ידי החדרת בדיקה רקטלית (ראה טבלת חומרים).
4. יש למרוח את ג'ל הסריקה (ראו טבלת חומרים) על בית החזה, להניח את המתמר אנכית, להוריד אותו לקו הפארסטרנלי (במקביל לבית החזה) ולסובב 35° נגד כיוון השעון כדי לקבל את מבט הציר הארוך של החזה בחדר השמאלי.
5. הקש על לחצן הדמיה במצב B בתוכנת ההדמיה (ראה רשימת חומרים) כדי לקבל תצוגה מלאה של הלב על ציר ארוך. התאם את גודל השער ואת בהירותו ושמור את התמונות באמצעות Save Clip או Save Frame למדידות מאוחרות יותר¹⁶.
6. עברו למצב M (מצב תנועה) ומקמו את ציר מצב M ברמת שריר הפפילרי. התאם את גודל השער והקש על לחצן התחל במצב M. שמור את התמונות באמצעות Save Clip או Save Frame^16,17.
7. מכיוון שתהליך רכישת התמונה במצב 4D הוא אוטומטי, ודא שאותות האק"ג והנשימה פעילים (איור 1) לפני קבלת הנתונים.
8. התחל לרכוש את הנתונים במצב B. פתח את לוח הסריקה 4D והפעל את המנוע התלת-ממדי. הגדר את פרמטרי התמונה בחלונית הסריקה 4D והקש על לחצן סריקה כדי להתחיל בסריקה. לאחר סקירת התמונות בתצוגה הדו-ממדית, טען את התמונות למצב 4D באמצעות הלחצן טען ל-4D .

תוצאות

איור 1 מדגים את אותות האק"ג והנשימה הפעילים המייצגים במהלך הערכה אקוקרדיוגרפית של עכברי דמה (איור 1A) ו-MI (איור 1B). אימות של אותות אק"ג פעילים ונשימה חשובים לפני רכישת הנתונים אקוקרדיוגרפיים. איור 2 מראה מדידה אקוקרדיו...

Discussion

מודל מורין של MI צובר פופולריות במעבדות מחקר לב וכלי דם, ומחקר זה מתאר מודל MI הניתן לשחזור ורלוונטי קלינית. פרוטוקול זה משפר את תהליך קשירת LCA במספר דרכים. ראשית, נמנע השימוש בחומרי הרדמה לפני הניתוח בהזרקה כגון קסילזין/קטמין או נתרן פנטוברביטל^14,15. נעשה שימוש ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis