Sol Koroner Arter Ligasyonu: Miyokard Enfarktüsünün Cerrahi Murin Modeli

Özet

Burada sunulan, farelerde sol koroner arterin kalıcı olarak bağlanması için cerrahi bir prosedürdür. Bu model, miyokard enfarktüsü sonrası patofizyolojiyi ve ilişkili inflamatuar yanıtı araştırmak için kullanılabilir.

Özet

İskemik kalp hastalığı ve ardından gelen miyokard enfarktüsü (MI), Amerika Birleşik Devletleri'nde ve dünyada mortalitenin önde gelen nedenlerinden biridir. Miyokard enfarktüsü sonrası patofizyolojik değişiklikleri araştırmak ve gelecekteki tedavileri tasarlamak için MI'nin araştırma modellerine ihtiyaç vardır. Farelerde sol koroner arterin (LCA) kalıcı ligasyonu, MI sonrası kardiyak fonksiyonu ve ventriküler yeniden şekillenmeyi araştırmak için popüler bir modeldir. Burada LCA'nın kalıcı ligasyonu ile daha az invaziv, güvenilir ve tekrarlanabilir bir cerrahi murin MI modeli tanımlanmıştır. Cerrahi modelimiz kolay geri dönüşümlü genel anestezi, trakeotomi gerektirmeyen endotrakeal entübasyon ve torakotomiden oluşmaktadır. MI'den sonraki 28. günde ekokardiyografi kalp fonksiyonlarını ve kalp yetmezliği parametrelerini ayırt edecektir. Kardiyak fibrozis derecesi Masson trikrom boyama ve kardiyak MRG ile değerlendirilebilir. Bu MI modeli, MI sonrası patofizyolojik ve immünolojik değişiklikleri incelemek için yararlıdır.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık, her yıl 17,9 milyon yaşam iddia eden ve küresel ölümlerin yüzde 31'ini oluşturan önemli bir halk sağlığı sorunudur¹. En sık görülen kardiyovasküler anomali tipi koroner kalp hastalığıdır ve miyokard enfarktüsü (MI) koroner kalp hastalığının başlıca belirtilerinden biridir². MI genellikle hassas bir plağın yırtılmasına bağlı olarak koroner arterin trombotik tıkanıklığından^{kaynaklanır 3}. Ortaya çıkan iskemi, etkilenen miyokardda derin iyonik ve metabolik değişikliklere ve ayrıca sistolik fonksiyonda hızlı bir azalmaya neden olur. MI, kardiyomiyositlerin ölümüyle sonuçlanır, bu da ventriküler disfonksiyona ve kalp yetmezliğine yol açabilir⁴.

Hastalarda MI üzerine yapılan araştırmalar, MI^5'li hastalardan elde edilen dokuların azlığı nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, MI'nin murin modelleri hem hastalık mekanizmalarını incelemede hem de potansiyel terapötik hedeflerin geliştirilmesinde yararlıdır. MI'nin şu anda mevcut murin modelleri, geri dönüşümsüz iskemi modellerini (LCA ve ablasyon yöntemleri) ve reperfüzyon modellerini (iskemi / reperfüzyon, I / R) ^6'yı içermektedir. Farelerde sol koroner arterin (LCA) kalıcı ligasyonu en çok kullanılan yöntemdir ve ^7,8,9 hastalarında MI'nin patofizyolojisini ve immünolojisini taklit eder. Kalıcı MI, elektriksel hasar veya kriyoyaralanma içeren ablasyon yöntemleri ile de indüklenebilir. Ablasyon yöntemleri,¹⁰ numaralı kesin yerde eşit büyüklükte enfarktüs üretebilir. Öte yandan, skar oluşumu, enfarktüs morfolojisi ve moleküler sinyal mekanizmaları ablasyon yöntemleri arasında farklılık gösterebilir^10,11. Murin I/R yöntemi, reperfüzyon tedavisinin klinik senaryosunu temsil ettiği için bir diğer önemli MI modelidir¹². I / R modeli, değişken enfarktüs boyutu, ilk yaralanma yanıtlarını ayırt etmede zorluk ve reperfüzyon⁶ gibi zorluklarla ilişkilidir.

LCA ligasyon yöntemleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen düşük sağkalım oranları ve postoperatif ağrı ile ilişkilidir¹³. Bu protokol, farelerin hazırlanması ve entübasyonunu, LCA ligasyonunu, ameliyat sonrası bakımı ve MI'nin doğrulanmasını içeren LCA ligasyonunun murin cerrahi MI modelini göstermektedir. Hayvan, orofarenksi bir laringoskop kullanarak aydınlatılarak entübe edilir, bu da prosedürü daha kolay, daha güvenli ve daha az travmatik^{hale getirir 15}. Fare, prosedür boyunca ventilatör desteğinde ve izofluran anestezisi altında tutulur. Ayrıca, MI sonrası kalp fonksiyonlarını ve kardiyak fibrozisi değerlendirmek için sırasıyla ekokardiyografi ve Masson trikrom boyama yapılır. Genel olarak, bu yöntem, MI sonrası patofizyoloji ve inflamasyonu incelemek için kullanılabilecek güvenilir ve tekrarlanabilir bir cerrahi murin MI modeli sağlar.

Protokol

Bu çalışma protokolü, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu deneyler için 24-30 g ağırlığındaki sekiz (sahte n = 4 ve MI n = 4) 1 yaşındaki dişi C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Farelerin yaklaşık% 100'ü ve en az% 80'i sırasıyla ilk 24 saat ve 28 gün içinde hayatta kaldı.

1. Farelerin hazırlanması ve endotrakeal entübasyonu

1. Bir boncuk sterilizatörünü (bakınız Malzeme Tablosu) 250 ° C'ye ısıtın ve otoklavlanmış cerrahi aletleri birkaç dakika boyunca içine yerleştirin.
2. Fareyi bir indüksiyon odasında 5 dakika boyunca% 3 izofluran ve 1 L / dak oksijen ile uyuşturun.
3. Sert bir ayak parmağı sıkışmasına verilen yanıtı kontrol ederek faredeki anestezi derinliğini sağlayın.
4. Ameliyat öncesi analjezik ilaç olan buprenorfinin (0.1 mg / kg) dozajını tahmin etmek için fareyi tartın. İlacı intraperitoniyal olarak enjekte edin.
5. Elektrikli bir tıraş bıçağı kullanarak toraksın sol tarafındaki kürkü kesin.
6. Cerrahi bölgeyi povidon-iyot ve% 70 etanol ile üç kez dezenfekte edin.
7. Fareyi eğimli bir tahta üzerinde sırtüstü konuma getirin. Farenin başını ve uzuvlarını, sırasıyla üst kesici dişlere ve yapışkan banda tutturulmuş elastik bir bant kullanarak sabitleyin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
8. Çeneyi açın ve dili yavaşça ağız boşluğundan çekin.
9. Bir laringoskop kullanarak orofarenksi aydınlatarak larinksin açıklığını tanımlayın (bkz.
10. 24 G'lik bir kateter iğnesinden yaklaşık 0,5 cm kesin ve künt iğneyi plastik kalkana yerleştirin. Künt iğneyi plastik kalkanla trakeaya yönlendirin. Plastik kalkanı trakeaya bırakarak iğneyi çıkarın.
11. Vantilatörünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) dakikada 137 atım solunum hızına (bu çalışmada kullanılan fareler için optimize edilmiş) ve gelgit hacmine 0,18 cc ayarlayın. Solunum cihazı tüplerini kateter kalkanına bağlayın ve ventilatör ile senkronize bir göğüs hareketi arayarak doğru entübasyonu onaylayın.
12. Solunum cihazı tüpünü kateter kalkanından ayırın ve hayvanı önceden ısıtılmış sıcaklık kontrollü bir cerrahi tahta üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Fareyi ventilatöre yeniden bağlayın.

2. Sol koroner arterin kalıcı ligasyonu

1. Cerrahi bölgeyi povidon-iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Cerrahi bölgeyi güvence altına almak için merkezde çeyrek büyüklüğünde bir deliğe sahip steril bir örtü uygulayın. Bir çift forseps kullanarak cildi nazikçe kaldırın ve bir çift cerrahi makas kullanarak sol pektoralis majör ve minör kaslar arasındaki çizgi boyunca küçük (1.5-2 cm) kutanöz enine bir kesi yapın.
   NOT: Makas, kesiğin derinliği ve yönü üzerinde gerekli kontrolü sağladığı için insizyonu yapmak için kullanılmıştır.
2. Altta yatan pektoralis kaslarını forseps ve diseksiyon makası ile ayırın. Kaslar, elastik bantlara bağlı retraktörler kullanılarak ayrıldı.
3. Üçüncü interkostal boşlukta, göğüs kafesinin doğal açısını takip eden bir çift mikro makasla bir kesi yapın. Bu aşamada, kalp ve akciğerlerin yaralanmasını önlemek için çok dikkatli olunmalıdır.
4. Sol ventrikülü açığa çıkarmak için retraktörleri kullanarak kaburgaları yavaşça gerin. Perikard yağını bir kenara taşıyın ve sol atriyumun kenarından kalbin tepesine doğru uzanan LCA'yı bulun.
5. 8-0'lık bir pas Bir iğne tutucu yardımıyla LCA altında naylon sütür. LCA'yı çift düğümle ve ardından ikinci bir düğümle (modifiye edilmiş bir cerrahın düğümü) bağlayın.
   NOT: Sol alt ventrikülün ağartılması, başarılı bir LCA ligasyonunu doğrular. Buna ek olarak, troponin ölçümü, EKG monitörizasyonu (ST elevasyonu), eko / in vivo kardiyak kapılı MRG veya mikro-BT görüntüleri de karşılaştırılabilir MI lezyonlarını doğrulamak için önerilmektedir.
6. Retraktörleri çıkarın ve göğüs boşluğuna 22 G'lik bir kateter iğnesi yerleştirin. Plastik kalkanın ucunu göğüs boşluğunda bırakarak iğneyi çıkarın. 4-0 naylon dikiş kullanarak göğüs kafesini kapatın.
7. 22 G plastik kalkana bir şırınga bağlayın ve negatif bir hava basıncı oluşturmak için göğsüne hafifçe bastırarak göğüs boşluğunda sıkışmış fazla havayı yavaşça çıkarın. Plastik kalkanı çıkarın.
8. Cildi 4-0 naylon dikişle kapatın.
9. İzofluran beslemesini kapatın. Bu aşamada, fare oksijen sağlayan vantilatörün üzerindedir.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Spontan solunum başladıktan sonra ventilatörü kapatın.
   NOT: Prosedür, farelerin hazırlanmasından bu adıma kadar hayvan başına yaklaşık 30-35 dakika sürer.
2. Fareyi bir ısı lambasının altında tutun ve uyanana kadar izleyin. Hayvan, sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci geri kazanana kadar gözetimsiz bırakılmamalıdır.
3. Ameliyattan sonra, hayvanı ayrı bir kafese yerleştirin ve ancak tamamen iyileştikten sonra diğer hayvanlarla birlikte orijinal kafese geri koyun.
4. Herhangi bir ağrı veya rahatsızlık belirtisi için fareyi günlük olarak izleyin.
5. Ameliyattan sonraki 2 gün boyunca her 6-8 saatte bir intraperitoneal buprenorfin (0.1 mg / kg) enjeksiyonuna devam edin.

4. Ekokardiyografik Değerlendirme

NOT: MI'den sonraki 28. günde kalp yetmezliği parametrelerini değerlendirmek için ekokardiyografi yapıldı.

1. Ameliyattan 28 gün sonra, fareleri% 3 izofluran ve 1 L / dak oksijen ile uyuşturun, gözlere steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın ve epilasyon kremi kullanarak göğüs kıllarını çıkarın. Göğüs bölgesini povidon-iyot ve% 70 etanol ile üç kez dezenfekte edin.
2. Anestezi uygulanan fareleri görüntüleme platformunun üzerine (bakınız Malzeme Tablosu) sırtüstü pozisyonda sabitleyin ve anestezik sisteme bağlı bir burun konisi (% 1-2 izofluran ve 1 L / dak oksijen) kullanarak prosedür boyunca sabit bir anestezi seviyesini koruyun.
3. Dört pençeyi EKG elektrotlarına elektrot jeli ile bantlayın (bkz. Bir rektal prob yerleştirerek hayvanın sıcaklığını izleyin (bkz.
4. Tarama jelini göğsünüze uygulayın ( bakınız Malzeme Tablosu) dönüştürücüyü dikey olarak yerleştirin, parasternal çizgiye (toraksa paralel) indirin ve sol ventrikülün parasternal uzun eksen görünümünü elde etmek için saat yönünün tersine 35 ° döndürün.
5. Kalbin tam bir uzun eksen görünümünü elde etmek için görüntüleme yazılımındaki B modu görüntüleme düğmesine dokunun (bkz. Kapı boyutunu ve parlaklığını ayarlayın ve daha sonraki ölçümler için Klibi Kaydet veya Çerçeveyi Kaydet'i kullanarak görüntüleri kaydedin ¹⁶.
6. M moduna (hareket modu) geçin ve M modu eksenini papiller kas seviyesine yerleştirin. Kapı boyutunu ayarlayın ve M modu Başlat düğmesine dokunun. Klibi Kaydet veya Kareyi Kaydet ^16,17'yi kullanarak görüntüleri kaydedin.
7. 4D modu görüntü alma işlemi otomatik olduğundan, verileri almadan önce EKG ve solunum sinyallerinin etkin olduğunu doğrulayın (Şekil 1).
8. Verileri B Modunda almaya başlayın. 4B tarama panelini açın ve 3B motoru başlatın. 4B tarama panelinde görüntü parametrelerini ayarlayın ve taramaya başlamak için Tara düğmesine dokunun. Görüntüleri 2B görünümde inceledikten sonra, 4D'ye yükle düğmesini kullanarak görüntüleri 4B moduna yükleyin .

Sonuçlar

Şekil 1, sahte (Şekil 1A) ve MI (Şekil 1B) farelerinin ekokardiyografik değerlendirmesi sırasında temsili aktif EKG ve solunum sinyallerini göstermektedir. Ekokardiyografik veriler elde edilmeden önce aktif EKG ve solunum sinyallerinin doğrulanması önemlidir. Şekil 2, LCA ligasyonundan 28 gün sonra kardiyak fonksiyonel parametrelerin ekokardiyografik ölçümünü gösterm...

Tartışmalar

MI'nin murin modeli kardiyovasküler araştırma laboratuvarlarında popülerlik kazanmaktadır ve bu çalışma tekrarlanabilir ve klinik olarak ilgili bir MI modelini tanımlamaktadır. Bu protokol, LCA ligasyon sürecini çeşitli şekillerde geliştirir. Başlangıç olarak, ksilazin / ketamin veya sodyum pentobarbital^14,15 gibi enjekte edilebilir ameliyat öncesi anesteziklerin kullanımından kaçınılır. Sadece izofluran anestezisi kullanıldı, bu da ha...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis