좌측 관상동맥 결찰술: 심근경색의 외과적 쥐 모델

요약

여기에 제시된 것은 생쥐에서 왼쪽 관상 동맥의 영구 결찰을위한 수술 절차입니다. 이 모델은 심근 경색 후 병태생리학 및 관련 염증 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

허혈성 심장 질환 및 그에 따른 심근 경색(MI)은 미국 및 전 세계에서 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 심근경색 후 병태생리학적 변화를 탐색하고 향후 치료법을 설계하기 위해서는 MI의 연구 모델이 필요합니다. 마우스에서 좌관상동맥(LCA)의 영구 결찰은 MI 후 심장 기능 및 심실 리모델링을 조사하는 데 널리 사용되는 모델입니다. 여기에서 우리는 LCA의 영구 결찰에 의한 덜 침습적이고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 외과적 쥐 MI 모델을 설명합니다. 우리의 수술 모델은 쉽게 가역적인 전신 마취, 기관 절개술이 필요하지 않은 기관내 삽관 및 개흉술로 구성됩니다. MI를 보장하기 위해 심전도 및 트로포닌 측정을 수행해야 합니다. MI 후 28일째에 심초음파는 심장 기능과 심부전 매개변수를 식별합니다. 심장 섬유증의 정도는 Masson의 삼색 염색 및 심장 MRI로 평가할 수 있습니다. 이 MI 모델은 MI 후 병태생리학적 및 면역학적 변화를 연구하는 데 유용합니다.

서문

심혈관 질환은 매년 1,790만 명의 목숨을 앗아가는 주요 공중 보건 문제로, 전 세계 사망률의 31%를 차지합니다¹. 심혈관 기형의 가장 흔한 유형은 관상 동맥 심장 질환이며, 심근 경색(myocardial infarction, MI)은 관상 동맥 심장 질환의 주요 증상 중 하나이다². MI는 일반적으로 취약한 플라크의 파열로 인한 관상동맥의 혈전성 폐색에 의해 발생한다³. 결과적인 허혈은 영향을받는 심근의 심오한 이온 및 대사 변화뿐만 아니라 수축기 기능의 급격한 감소를 유발합니다. 심근경색은 심근 세포의 사멸을 초래하며, 이는 심실 기능 장애와 심부전을 유발할 수 있다⁴.

MI 환자에서 MI에 대한 연구는 MI⁵ 환자로부터 얻은 조직의 부족으로 인해 제한적입니다. 이와 같이, MI의 쥐 모델은 질병 기전을 연구하고 잠재적인 치료 표적을 개발하는 데 유용합니다. MI의 현재 이용 가능한 쥐 모델에는 비가역적 허혈 모델(LCA 및 절제 방법) 및 재관류 모델(허혈/재관류, I/R)^이 포함됩니다6. 마우스에서 좌관상동맥(LCA)의 영구 결찰이 가장 많이 사용되는 방법이며, 환자에서 MI의 병태생리학 및 면역학을 모방한다 ^7,8,9. 영구적인 MI는 전기적 손상이나 냉동 손상을 수반하는 절제 방법에 의해서도 유도될 수 있습니다. 절제 방법은 정확한 위치⁽¹⁰)에서 균일한 크기의 경색을 발생시킬 수 있다. 반면에, 흉터 형성, 경색 형태 및 분자 신호 전달 메커니즘은 절제 방법^10,11에 따라 다를 수 있다. 쥐 I/R 방법은 재관류 요법의 임상적 시나리오를 나타내기 때문에 또 다른 중요한 MI 모델이다¹². I/R 모델은 다양한 경색 크기, 초기 손상의 반응을 구별하는 어려움, 재관류⁶와 같은 문제와 관련이 있다.

LCA 결찰법은 널리 사용되고 있지만, 낮은 생존율과 수술 후 통증과 관련이 있다¹³. 이 프로토콜은 마우스의 준비 및 삽관, LCA 결찰, 수술 후 관리 및 MI의 검증을 포함하는 LCA 결찰의 쥐 수술 MI 모델을 입증한다. 침습적 기관 절개술¹⁴을 사용하는 대신, 이 방법은 기관내 삽관을 사용한다. 동물은 후두경을 사용하여 구강 인두를 비추어 삽관하므로 절차가 더 쉽고 안전하며 외상이 적습니다¹⁵. 마우스는 시술 내내 인공호흡기 지지대와 이소플루란 마취 하에 유지됩니다. 또한, 심초음파와 Masson's trichrome 염색을 수행하여 MI 후 심장 기능과 심장 섬유증을 각각 평가합니다. 전반적으로, 이 방법은 MI 후 병태생리학 및 염증을 연구하는 데 사용할 수 있는 MI의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 외과적 쥐 모델을 제공합니다.

프로토콜

현재 연구 프로토콜은 피츠버그 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인했습니다. 8마리(가짜 n = 4 및 MI n = 4)의 1세 암컷 C57BL/6J 마우스(체중 24-30g)를 이 실험에 사용했습니다. 마우스의 약 100 % 및 적어도 80 %가 처음 24 시간 및 28 일 동안 각각 생존했습니다.

1. 마우스의 준비 및 기관 내 삽관

1. 비드 멸균기( 재료 표 참조)를 250°C로 예열하고 오토클레이브 수술 기구를 몇 분 동안 그 안에 넣습니다.
2. 3% 이소플루란과 1L/min 산소가 있는 유도 챔버에서 5분 동안 마우스를 마취합니다.
3. 단단한 발가락 꼬집음에 대한 반응을 확인하여 마우스의 마취 깊이를 확인하십시오.
4. 수술 전 진통제인 부프레노르핀(0.1mg/kg)의 용량을 추정하기 위해 마우스의 무게를 잰다. 약물을 주 내로 주사하십시오.
5. 전기 면도기를 사용하여 흉부 왼쪽의 털을 다듬습니다.
6. 그 후 포비돈 요오드와 70% 에탄올로 수술 부위를 3회 소독합니다.
7. 마우스를 경사 보드의 앙와위 위치에 놓습니다. 마우스의 머리와 팔다리를 각각 상악절치에 부착된 탄성 밴드와 접착 테이프를 사용하여 고정합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 멸균 안과 윤활제를 바르십시오.
8. 턱을 열고 혀를 구강 밖으로 부드럽게 잡아 당깁니다.
9. 후두경을 사용하여 구인두를 조명하여 후두의 입구를 확인합니다( 재료 표 참조).
10. 24G 카테터 바늘에서 약 0.5cm를 잘라내고 뭉툭한 바늘을 플라스틱 실드에 삽입합니다. 플라스틱 실드가 있는 뭉툭한 바늘을 기관 안으로 향하게 합니다. 바늘을 꺼내 플라스틱 실드를 기관에 남겨 둡니다.
11. 인공호흡기( 재료 표 참조)를 분당 137회(이 연구에 사용된 마우스에 최적화됨)의 호흡수와 일회 호흡량 0.18cc로 설정합니다. 호흡기 튜브를 카테터 실드에 연결하고 인공호흡기와 동기화된 흉부 움직임을 찾아 올바른 삽관을 확인합니다.
12. 카테터 실드에서 호흡기 튜브를 분리하고 예열된 온도 조절 수술판에 동물을 앙와위 자세로 놓습니다. 마우스를 인공호흡기에 다시 연결합니다.

2. 왼쪽 관상 동맥의 영구 결찰

1. 포비돈 요오드와 70 % 알코올로 수술 부위를 소독하십시오. 수술 부위를 고정하기 위해 중앙에 4분의 1 크기의 구멍이 있는 멸균 드레이프를 적용합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 피부를 부드럽게 들어 올리고 한 쌍의 수술 용 가위를 사용하여 왼쪽 가슴 대근육과 소근육 사이의 선을 따라 작은 (1.5-2cm) 피부 횡 절개를합니다.
   알림: 가위는 절단 깊이와 방향에 필요한 제어를 제공하기 때문에 절개를 하는 데 사용되었습니다.
2. 집게와 해부 가위로 밑에있는 가슴 근육을 분리하십시오. 근육은 탄성 밴드에 부착 된 견인기를 사용하여 분리되었습니다.
3. 흉곽의 자연스러운 각도를 따라 한 쌍의 미세 가위로 세 번째 늑간 공간을 절개합니다. 이 단계에서는 심장과 폐의 손상을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다.
4. 견인기를 사용하여 갈비뼈를 부드럽게 펴서 좌심실을 노출시킵니다. 심낭 지방을 옆으로 옮기고 좌심방 가장자리에서 심장의 정점을 향해 이어지는 LCA를 찾습니다.
5. 8-0 통과 바늘 홀더의 도움으로 LCA 아래의 나일론 봉합사. LCA를 이중 매듭과 두 번째 매듭(수정된 외과 의사의 매듭)으로 합자합니다.
   참고: 하부 좌심실의 희석은 성공적인 LCA 결찰을 확인합니다. 이 외에도 트로포닌 측정, ECG 모니터링(ST 상승), 에코/생체 내 심장 게이트 MRI 또는 마이크로 CT 영상도 유사한 MI 병변을 확인하는 것이 좋습니다.
6. 견인기를 제거하고 22G 카테터 바늘을 흉강에 삽입합니다. 플라스틱 방패의 끝을 흉강에 남겨두고 바늘을 제거하십시오. 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 흉곽을 닫습니다.
7. 주사기를 22G 플라스틱 실드에 연결하고 흉부를 부드럽게 눌러 흉강에 갇힌 과도한 공기를 천천히 제거하여 음의 기압을 설정합니다. 플라스틱 실드를 제거합니다.
8. 4-0 나일론 봉합사로 피부를 닫습니다.
9. 이소플루란 공급을 끕니다. 이 단계에서 마우스는 산소를 공급하는 인공 호흡기에 있습니다.

3. 수술 후 관리

1. 자발 호흡이 시작되면 인공 호흡기를 끄십시오.
   참고: 이 절차는 마우스 준비에서 이 단계까지 동물당 약 30-35분이 소요됩니다.
2. 마우스를 열 램프 아래에 두고 깨어날 때까지 모니터링합니다. 동물은 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 방치해서는 안됩니다.
3. 수술 후 동물을 별도의 케이지에 넣고 완전히 회복 된 후에 만 다른 동물과 함께 원래 케이지로 되돌립니다.
4. 통증이나 불편함의 징후가 있는지 매일 마우스를 모니터링하십시오.
5. 수술 후 추가 2일 동안 6-8시간마다 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 복강주사를 계속합니다.

4. 심초음파 평가

참고: MI 후 28일째에 심부전의 매개변수를 평가하기 위해 심초음파를 수행했습니다.

1. 수술 후 28일 후 3% 이소플루란과 1L/min 산소로 마우스를 마취시키고 멸균 안과용 윤활제를 눈에 바르고 제모 크림을 사용하여 가슴 털을 제거합니다. 포비돈 요오드와 70 % 에탄올로 가슴 부위를 세 번 소독하십시오.
2. 마취된 마우스를 앙와위 자세로 이미징 플랫폼( 재료 표 참조) 위에 고정하고 마취 시스템에 연결된 노즈 콘(1%-2% 이소플루란 및 1L/min 산소)을 사용하여 시술 내내 일정한 수준의 마취를 유지합니다.
3. 전극 젤로 4개의 발을 ECG 전극에 테이프로 붙입니다( 재료 표 참조). 직장 탐침을 삽입하여 동물의 온도를 모니터링하십시오 ( 재료 표 참조).
4. 스캐닝 젤( 재료 표 참조)을 가슴에 바르고 변환기를 수직으로 놓고 흉골주위선(흉부와 평행)으로 내린 다음 시계 반대 방향으로 35° 회전하여 흉골주위 장축을 얻습니다.
5. 이미징 소프트웨어(재료 표 참조)의 B 모드 이미징 버튼을 눌러 심장의 완전한 장축 보기를 얻을 수 있습니다. 게이트 크기와 밝기를 조정하고 나중에 측정할 수 있도록 Save Clip 또는 Save Frame을 사용하여 이미지를 저장합니다¹⁶.
6. M 모드(모션 모드)로 전환하고 M 모드 축을 유두 근육 수준에 배치합니다. 게이트 크기를 조정하고 M 모드 시작 버튼을 누릅니다. 클립 저장 또는 프레임^{저장 16,17}을 사용하여 이미지를 저장합니다.
7. 4D 모드 이미지 획득 프로세스가 자동화되므로 데이터를 수집하기 전에 ECG 및 호흡 신호가 활성 상태인지 확인합니다(그림 1).
8. B 모드에서 데이터 수집을 시작합니다. 4D 스캔 패널을 열고 3D 모터를 시작합니다. 4D 스캔 패널에서 이미지 매개변수를 설정하고 스캔 버튼을 눌러 스캔 을 시작합니다. 2D 뷰에서 이미지를 검토한 후 4D로 로드 버튼을 사용하여 이미지를 4D 모드로 로드합니다.

결과

그림 1은 가짜 마우스(그림 1A) 및 MI(그림 1B) 마우스의 심초음파 평가 동안 대표적인 활성 ECG 및 호흡 신호를 보여줍니다. 심초음파 데이터를 수집하기 전에 활성 ECG 및 호흡 신호를 확인하는 것이 중요합니다. 그림 2는 LCA 결찰 후 28일 후 심장 기능 매개변수의 심초음파 측정을 보여줍니다. 그림...

토론

MI의 쥐 모델은 심혈관 연구 실험실에서 인기를 얻고 있으며, 이 연구는 재현 가능하고 임상적으로 관련된 MI 모델을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 LCA 결찰 과정을 개선합니다. 우선, 자일라진/케타민 또는 펜토바르비탈^{나트륨 14,15}와 같은 주사 가능한 수술 전 마취제의 사용을 피합니다. 이소플루란 마취제만 사용했는데, 이는 동물 생?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis