نماذج تقويم العظام متعدية للورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال

Summary

هنا ، نصف نموذج الفأر التقويمي قبل السريري ل GBM ، الذي تم إنشاؤه عن طريق الحقن داخل الجمجمة للخلايا المشتقة من أورام نموذج الفئران المعدلة وراثيا. يعرض هذا النموذج السمات المميزة لمرض GBM البشري. بالنسبة للدراسات الانتقالية ، يتم تتبع ورم دماغ الفأر عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي وعلم أمراض الأنسجة.

Abstract

تعد نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) للورم الأرومي الدبقي البشري متعدد الأشكال (GBM) ضرورية لفهم تطور أورام الدماغ وتطورها. على عكس أورام xenograft ، في GEMs ، تنشأ الأورام في البيئة المكروية الأصلية في فأر مناعي. ومع ذلك ، فإن استخدام GBM GEMs في دراسات العلاج قبل السريري يمثل تحديا بسبب زمن انتقال الورم الطويل ، وعدم التجانس في تردد الأورام ، وتوقيت تطور الورم من الدرجة المتقدمة. الفئران المستحثة عن طريق الحقن التقويمي داخل الجمجمة هي أكثر قابلية للتتبع للدراسات قبل السريرية ، وتحتفظ بسمات أورام GEM. لقد أنشأنا نموذجا لورم الدماغ التقويمي مشتقا من نموذج GEM مع انحرافات Rb و Kras و p53 (TRP) ، والتي تطور أورام GBM التي تعرض بؤرا خطية للنخر بواسطة الخلايا الورمية ، والأوعية الدموية الكثيفة المماثلة ل GBM البشري. يتم حقن الخلايا المشتقة من أورام GEM GBM داخل الجمجمة في الفئران المتلقية من النوع البري والمتطابقة مع الإجهاد وتكاثر أورام الدرجة الرابعة ، وبالتالي تجاوز فترة كمون الورم الطويلة في الفئران GEM والسماح بإنشاء مجموعات كبيرة وقابلة للتكرار للدراسات قبل السريرية. يتم تلخيص السمات التكاثرية للغاية والغازية والأوعية الدموية لنموذج TRP GEM ل GBM في أورام تقويم العظام ، وتعكس علامات التشريح المرضي مجموعات فرعية GBM البشرية. تتم مراقبة نمو الورم عن طريق فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي التسلسلية. نظرا للطبيعة الغازية للأورام داخل الجمجمة في النماذج ذات الكفاءة المناعية ، فإن اتباع إجراء الحقن الموضح هنا بعناية أمر ضروري لمنع نمو الورم خارج الجمجمة.

Introduction

الورم الأرومي الدبقي (GBM ؛ الورم الدبقي من الدرجة الرابعة) هو ورم الدماغ الأكثر شيوعا والخبيث ، والعلاجات الحالية غير فعالة ، مما يؤدي إلى بقاء متوسط 15 شهرا¹. تعد النماذج قبل السريرية الموثوقة والدقيقة التي تمثل مسارات الإشارات المعقدة المشاركة في نمو ورم الدماغ والتسبب في المرض ضرورية لتسريع التقدم في تقييم الأنظمة العلاجية الجديدة ل GBM. لا تعكس نماذج الفئران التي يتم فيها زرع خطوط خلايا ورم الدماغ البشري تحت الجلد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة البيئة المناعية الأصلية لأورام المخ ، ولا يمكن استخدامها لتقييم قدرة العلاجات على عبور الحاجز الدموي الدماغي². من الناحية المثالية ، يجب أن تتكاثر نماذج الفئران قبل السريرية أيضا عن كثب في علم أمراض الأنسجة البشرية GBM ، بما في ذلك المستوى العالي من الغزو في الحمة المحيطة³. على الرغم من أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) تطور الأورام في سياق نظام مناعي سليم ، إلا أن خطط التكاثر المعقدة غالبا ما تكون مطلوبة ، وقد تتطور الأورام ببطء وبشكل غير متسق⁴. تعد نماذج الطعم الخيفي المشتقة من GEM أكثر ملاءمة للدراسات العلاجية قبل السريرية ، حيث تكون هناك حاجة إلى مجموعات كبيرة من الفئران الحاملة للورم في إطار زمني أقصر.

في تقرير سابق ، وصفنا نموذج فأر GBM التقويمي المشتق مباشرة من أورام GEM. يبدأ تكوين الورم في GEM من خلال الأحداث الجينية في مجموعات الخلايا (الخلايا النجمية في المقام الأول) التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، والتي تؤدي إلى التقدم إلى GBM. تحتوي هذه GEMs TRP على جين التحوير TgGZT121 (T) ، والذي يعبر عن T121 بعد التعرض لإعادة تجميع Cre التي يحركها GFAP. ينتج عن تعبير بروتين T121 قمع نشاط البروتين Rb (Rb1 و p107 و p103). يستهدف التعبير المشترك لجين التحوير Cre المدفوع ب GFAP (GFAP-CreERT2) التعبير للخلايا النجمية البالغة بعد تحريضه باستخدام عقار تاموكسيفين. تأوي فئران TRP أيضا Kras متحولة تعتمد على Cre (Kras^G12D; R) أليل ، لتمثيل تنشيط مسار مستقبلات التيروزين كيناز ، وهي غير متجانسة الزيجوت لفقدان Pten (P) ^5,6. الانحرافات الجينية المتزامنة في مستقبلات التيروزين كيناز (RTK) وشبكات PI3K و RB متورطة في 74٪ من التسبب في GBM⁷. لذلك ، يتم تمثيل مسارات الإشارات الأولية التي تم تغييرها في GBM البشري من خلال الطفرات المهندسة في الفئران TRP ، ولا سيما أورام GBM ، حيث يتم تنشيط أهداف المصب المشتركة ل RTKs⁵.

تم التحقق من صحة نموذج تقويم العظام الجيني المشتق من GEM كنموذج يلخص ميزات أورام الدماغ البشرية ، بما في ذلك الغزو ووجود المؤشرات الحيوية من النوع الفرعي ، لاستخدامه كمنصة لتقييم علاجات السرطان التي تستهدف المسارات الشاذة في GBM. تم استزراع الخلايا من الأورام التي تم حصادها من أدمغة TRP وإعادة زرعها في دماغ الفئران المتطابقة مع الإجهاد ، باستخدام معدات التوضيع التجسيمي للحقن داخل الجمجمة في القشرة. طور نموذج الفأر التقويمي قبل السريري هذا أوراما GBM كانت خلوية للغاية ، وغازية ، ومتعددة الأشكال مع معدل انقسام مرتفع ، وأظهرت بؤرا خطية للنخر بواسطة الخلايا الورمية والأوعية الدموية الكثيفة ، كما لوحظ بالنسبة ل GBM البشري. تم قياس حجم الورم ونموه بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي (MRI).

في هذا التقرير ، نصف التقنية المثلى للحقن داخل الجمجمة لخلايا GBM الأولية أو خطوط الخلايا في دماغ الفأر من النوع البري ، باستخدام أورام TRP كمثال. يمكن تكييف نفس البروتوكول للفئران التي تعاني من نقص المناعة وخطوط خلايا GBM الأخرى. يتم تقديم نصائح حاسمة لتجنب المزالق الشائعة ، مثل تحضير الخلايا دون المستوى الأمثل أو تسرب الخلايا في موقع الحقن ، ولاستخدام معدات التوضيع التجسيمي بشكل صحيح لضمان استنساخ النموذج وموثوقيته. لأغراض متعدية ، نقوم بالتحقق من صحة النموذج عن طريق الكشف بالرنين المغناطيسي عن نمو ورم المخ في الحيوانات الحية ، والتوصيف النسيجي ، وتقديم مثال على العلاج في الفئران الحاملة للورم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة الموصوف هنا من قبل NCI في لجنة فريدريك لرعاية واستخدام الحيوان. تم اعتماد NCI-Frederick من قبل AAALAC International ويتبع سياسة خدمة الصحة العامة لرعاية واستخدام المختبر. تم توفير رعاية الحيوانات وفقا للإجراءات الموضحة في "دليل رعاية واستخدام المختبر (المجلس القومي للبحوث، 2011; مطبعة الأكاديميات الوطنية ، واشنطن العاصمة).

1. تحضير الخلايا للحقن

ملاحظة: تم عزل الخلايا الأولية لورم دماغ الفأر (MBRs) المستخدمة في هذا النموذج في الأصل من فئران TRP GEM التي يسببها عقار تاموكسيفين ، كما هو موضح في El Meskini et ^al.5. يمكن العثور على تفاصيل حول إعداد الخلية في هذا المرجع.

1. نفذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
2. زراعة خلايا ورم الدماغ الأولية في المختبر حتى تصل إلى مرحلة النمو الأسي.
3. احصد الخلايا في 0.25٪ من التربسين ، وبمجرد فصلها ، قم بتخفيفها بوسط نمو لتعطيل التربسين.
4. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × غرام وغسل مع وسائل الإعلام خالية من المصل. كرر مرة واحدة قبل العد.
5. عد الخلايا يدويا أو باستخدام عداد خلايا آلي. أعد تعليق الخلايا في ميثيل سلولوز معقم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) بالتركيز المطلوب ، بناء على حجم الحقن النهائي البالغ 2 ميكرولتر. قد يختلف تركيز الخلية المطلوب بناء على خط الخلية ونموذج ورم الدماغ. بالنسبة لخلايا GBM GEM TRP ، نقوم بحقن 2 ميكرولتر من محلول 25 × 10⁶ خلايا / مل ، أو 50000 خلية.

2. سلالة الماوس

1. تولد أو شراء سلالة الفئران المناسبة التي تتطابق مع خلفية سلالة خلايا ورم الدماغ. بالنسبة لخلايا TRP ، استخدم الفئران B6D2F1 / J البالغة من العمر 9 أسابيع (من تقاطع بين إناث C57BL / 6J [B6] وذكور DBA / 2J [D2]) كمتلقين للخلايا السرطانية.

3. إعداد المنطقة الجراحية

ملاحظة: يتم إجراء جميع الخطوات الجراحية باستخدام تقنية معقمة في بيئة نظيفة ومعقمة. يجب أن يرتدي الجراح الدعك ومعدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك القناع. يجب تعقيم الأدوات الجراحية بالحرارة قبل الاستخدام.

1. ضع واقيات السطح تحت جهاز التجسيم وعلى سطح العمل.
2. قم بتوصيل أنبوب الفينيل من آلة التخدير بمنفذ IN لمنصة التخدير الغازي لجهاز التجسيم ، وأنبوب آخر بمنفذ OUT.
3. قم بتوصيل الشاشة الرقمية بمصدر طاقة وبالجهاز.
4. قم بتوصيل وحدة تحكم micropump (الشكل 1A) بمصدر طاقة وقم بتوصيل المضخة الدقيقة (الشكل 1A) بذراع المعالج للجهاز (انظر أيضا تعليمات الشركة المصنعة).
5. اضبط المضخة الدقيقة على 5.6 نانولتر / ثانية لحقن حجم 2000 نانولتر.
6. قم بتشغيل معقم الخرزة الساخنة.
7. قم بتوصيل وسادة تسخين الماوس بجهاز التحكم في درجة الحرارة وقم بتوصيله بمصدر طاقة. ضع اللوحة على منصة المسرح. اضبط درجة حرارة اللوحة على 37 درجة مئوية.
8. قم بتحميل حقنة دقيقة 30 جرام ، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات. أدخل المكبس وأرفق الإبرة. تأكد من إمساك الإبرة من لوحة التحكم فقط. اضغط على المكبس حتى يتم توزيع قطرة من خليط خلية ميثيل سلولوز من خلال الإبرة. نظف الإبرة باستخدام وسادة تحضير كحول بنسبة 70٪ عن طريق مسح جوانب الإبرة بعناية ، أو عن طريق وضع وسادة شاش معقمة على سطح العمل ونشافها. احرص على عدم ثني أو كسر الإبرة.
9. قم بتوصيل المحقنة الدقيقة بالمضخة الدقيقة وقم بتدوير ذراع المناور بعيدا عن المسرح ، لمنع إزاحة إبرة المحقنة قبل وضع الماوس على المسرح.

4. تحضير الفأر للجراحة

1. تخدير الماوس عن طريق وضعه في غرفة الحث مع ضبط مبخر الأيزوفلوران على 2.5٪ ، أو وفقا للإرشادات المؤسسية. قم بتشغيل تدفق الأيزوفلوران إلى الأنف.
2. انقل الماوس إلى الجهاز التجسيمي وثبته في مخروط الأنف ، مع وضع الأسنان العلوية على دعامة مخروط الأنف (الشكل 1 ب ، 9). شد المقبض الموجود على مخروط الأنف لتأمينه (الشكل 1 ب). تأكد من مستوى مناسب من التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم للتحقق من رد الفعل.
   1. راقب الأذنين والقدمين والأغشية المخاطية بحثا عن اللون (الوردي) لضمان الأوكسجين الكافي. أيضا ، راقب معدل التنفس (قد تشير الزيادة أو النقصان إلى الحاجة إلى ضبط مستويات الأيزوفلوران).
3. أدخل قضبان الأذن (الشكل 1 ب) في كلتا الأذنين وشد المقبض لتأمين الرأس.
4. ضع مرهم العين لتليين العينين أثناء تخدير الفأر.
5. استخدم ملقط منحني لنتف الشعر على رأس الفأر إلى منطقة أكبر بنسبة 150٪ من الشق المخطط له ، لضمان ظروف معقمة مناسبة.
6. حقن 0.5-1 ملغ/كغ من تسكين البوبرينورفين SR تحت الجلد، أو استخدم مسكنا آخر معتمدا من البروتوكول.
7. ضع مسبار المستقيم للفأر لمراقبة درجة الحرارة الداخلية ومنع انخفاض حرارة الجسم بسبب التخدير. حافظ على درجة حرارة جسم الفأر بين 36.5 و 38.5 درجة مئوية.
8. تعقيم المجال الجراحي باستخدام الدوائر الخارجية ، بالتناوب بين فرك الجراحية والإيثانول ثلاث مرات.
9. باستخدام ملقط لسحب الجلد مشدود ، قم بعمل شق حوالي 1 سم بشفرة المشرط ، بدءا من بين العينين. يجب أن تكون bregma مرئية من خلال شق.
   ملاحظة: للحصول على تقنية معقمة مناسبة ، المس موقع الجراحة فقط بأطراف الأدوات المعقمة ، وضع أطراف الأدوات على سطح معقم فقط (مثل الجزء الداخلي من حزمة أدوات التعقيم).
10. استخدمي الطرف الخشبي للقضيب ذي الرؤوس القطنية لكشط الأنسجة الضامة الزائدة ، ثم الطرف القطني لقضيب آخر حتى يجف.

5. حقن الخلايا

1. أعد ذراع المعالج مع ملحق المحقنة فوق الماوس ، مع شد المقبض لتأمينه. استخدم المقابض X و Y في المستوى الأفقي لتحريك حامل المحقنة فوق bregma. اخفض الإبرة باستخدام مقبض Z لتأكيد موضع البريغما. اضبط وحدة تحكم القراءة الرقمية على الصفر.
2. استخدم مقابض X و Y والقراءات الرقمية المقابلة لتحريك الإبرة إلى الموضع المطلوب. بالنسبة لموقع القشرة القشرية ، تكون الإحداثيات المناسبة 3 مم خلفية ، و 2 مم جانبية يمين إلى بريجما ، وعمق 2 مم من الأم الجافية. استخدم مقبض Z لتحريك الإبرة إلى سطح الجمجمة.
3. ثقب ثقب في الجمجمة باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25 G المرفقة. ضع شطبة الإبرة باتجاه المحقنة والإبرة الدقيقة 30 جم ، وقم بتدوير ذراع المعالج بعناية إلى الجانب. باستخدام الإبهام والإصبع ، لف الإبرة ذهابا وإيابا ببطء مع ضغط لطيف حتى يخترق طرف الإبرة غطاء الجمجمة.
4. استخدم أداة تطبيق قطنية لمسح أي دم بعيدا عن فتحة الإبرة. استبدل ذراع المناور إلى الموضع المناسب بإبرة حقنة دقيقة محملة فوق الفتحة. قم بمحاذاة طرف الإبرة مع الفتحة ، باستخدام مقبض Z لخفض الإبرة وصولا إلى الجافية الدماغية ، واضبط وحدة التحكم في القراءة الرقمية على الصفر.
5. باستخدام مقبض Z ، اخفض الإبرة 1 مم ، ثم انتظر دقيقة واحدة. كرر حتى يتم الوصول إلى العمق المطلوب (2 مم كما هو موضح).
   ملاحظة: يتم خفض الإبرة ببطء لمنع حدوث تلف إضافي لأنسجة المخ المحيطة والتدفق العكسي لمحلول الخلية.
6. ابدأ تشغيل المضخة الدقيقة ، ثم راقبها للتأكد من توقف المضخة عند حقن 2 ميكرولتر. يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي 6 دقائق بالسرعة المحددة. ثم انتظر 1 دقيقة قبل تحريك الإبرة.

6. إزالة الإبرة وإغلاق الجرح

1. ارفع الإبرة 1 مم ثم انتظر دقيقة واحدة. كرر حتى تصبح الإبرة خالية تماما من الجمجمة.
2. إذا لزم الأمر ، استخدم قضيبا برأس قطني لمسح أي دم بعيدا عن موقع الحقن.
3. باستخدام الطرف الخشبي لقضيب ذو رأس قطني ، خذ قطعة صغيرة من شمع العظام (~ 1 مم) وشكلها على شكل مخروط. ضعه في الفتحة في الجمجمة ، وادفع الشمع في الحفرة.
4. قم بتسخين الملقط باستخدام معقم الخرزة واستخدمه لإذابة الشمع المتبقي على الجمجمة وتنعيمه.
5. ضع ما يقرب من قطرتين من محلول بوبيفاكايين (مخدر) في الشق واستخدم ملقط لسحب حواف الجلد معا.
6. اسحب الجلد مشدودا وضع مشبكا أو اثنين من مشبك الجرح لإغلاق الجلد.
7. ضع الماوس في قفص استرداد نظيف على وسادة تدفئة في منطقة خالية من السحب ، وراقب الماوس عن كثب. اسمح للفأر بالاستيقاظ تماما من التخدير ، واستئناف النشاط الطبيعي ، قبل إعادته إلى السكن العادي.
8. تحقق من الماوس يوميا بعد الإجراء الجراحي وقم بإدارة الألم ، وفقا للإرشادات المؤسسية.
   1. إذا تم استخدام البوبرينورفين SR (الخطوة 4.6) للتسكين ، فإن تركيبة الإطلاق المستدام تستمر لمدة 72 ساعة. كرر الحقن فقط في حالة وجود ألم أو إزعاج مرئي بعد 72 ساعة. عند إجراؤها بشكل صحيح ، تتعافى الفئران جيدا من الحقن داخل الجمجمة ولا تكون هناك حاجة إلى تسكين إضافي.
   2. قم بإزالة الدبابيس بعد 7-10 أيام من الجراحة.
9. مراقبة نمو الورم عن طريق تصوير الحيوانات الحية (MRI).
   1. القتل الرحيم للفئران عند الوصول إلى نقاط النهاية الإنسانية (أي إذا فقد الحيوان 20٪ من وزن الجسم أو أصبح منخفض الحرارة).
   2. نظرا للطبيعة الغازية لأورام المخ هذه ، راقب الفئران بحثا عن أعراض عصبية ، مثل المشية غير المتساوية أو الشلل الجزئي أو الدوران أو إمالة الرأس. القتل الرحيم للفأر إذا لوحظت أي من هذه العلامات السريرية لنمو الورم المتقدم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يجب مراقبة الفئران المحقونة بخلايا ورم المخ يوميا بحثا عن علامات نمو الورم مثل النوبات أو الرنح أو فقدان الوزن. يمكن أيضا مراقبة نمو ورم الدماغ عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي على فترات منتظمة. تسمح فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي الأسبوعية بتصور زيادة عبء الورم داخل الدماغ وقياسات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

النماذج قبل السريرية ضرورية لتقييم الأهداف العلاجية الجديدة واستراتيجيات العلاج الجديدة في GBM. تتمتع نماذج الفئران المعدلة وراثيا ل GBM بميزة حدوث الورم في الموقع الأصلي ، ولكن غالبا مع زمن انتقال طويل ونمو ورم لا يمكن التنبؤ به¹³. تظهر أورام نموذج GEM زمن انتقال من 4-5 أشهر ، والن?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T