Modelos Ortotópicos Translacionais de Glioblastoma Multiforme

Resumo

Aqui, descrevemos um modelo ortotópico pré-clínico em camundongos para GBM, estabelecido por injeção intracraniana de células derivadas de tumores modelo de camundongos geneticamente modificados. Este modelo exibe as características da doença do GBM humano. Para estudos translacionais, o tumor cerebral de camundongo é rastreado por ressonância magnética in vivo e histopatologia.

Resumo

Modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) para glioblastoma multiforme humano (GBM) são críticos para a compreensão do desenvolvimento e progressão de tumores cerebrais. Ao contrário dos tumores de xenoenxerto, nos GEMs, os tumores surgem no microambiente nativo em um camundongo imunocompetente. No entanto, o uso de GEMs GBM em estudos de tratamento pré-clínico é desafiador devido às longas latências tumorais, à heterogeneidade na frequência de neoplasias e ao momento do desenvolvimento de tumores de grau avançado. Camundongos induzidos por injeção ortotópica intracraniana são mais tratáveis para estudos pré-clínicos e mantêm características dos tumores GEM. Geramos um modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de um modelo de GEM com aberrações de Rb, Kras e p53 (TRP), que desenvolve tumores de GBM exibindo focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa análoga à GBM humana. Células derivadas de tumores GEM GBM são injetadas intracranialmente em camundongos selvagens e cepas compatíveis e reproduzem tumores de grau IV, contornando assim o longo período de latência tumoral em camundongos GEM e permitindo a criação de coortes grandes e reprodutíveis para estudos pré-clínicos. As características altamente proliferativas, invasivas e vasculares do modelo TRP GEM para GBM são recapituladas nos tumores ortotópicos, e os marcadores histopatológicos refletem subgrupos humanos de GBM. O crescimento do tumor é monitorado por exames seriados de RM. Devido à natureza invasiva dos tumores intracranianos em modelos imunocompetentes, seguir cuidadosamente o procedimento de injeção descrito aqui é essencial para prevenir o crescimento de tumores extracranianos.

Introdução

O glioblastoma (GBM; glioma grau IV) é o tumor cerebral mais comum e maligno, e as terapias atuais são ineficazes, resultando em uma sobrevida média de 15^meses1. Modelos pré-clínicos confiáveis e precisos que representem as complexas vias de sinalização envolvidas no crescimento e patogênese de tumores cerebrais são essenciais para acelerar o progresso na avaliação de novos regimes terapêuticos para GBM. Modelos murinos nos quais linhagens celulares tumorais cerebrais humanas são implantadas subcutaneamente em camundongos imunocomprometidos não refletem o ambiente imune nativo de tumores cerebrais, nem podem ser usados para avaliar a capacidade da terapêutica de atravessar a barreira hematoencefálica². Idealmente, modelos pré-clínicos em camundongos também devem reproduzir de perto a histopatologia do GBM humano, incluindo o alto nível de invasividade no parênquima circundante³. Embora modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) desenvolvam tumores no contexto de um sistema imunológico intacto, esquemas de melhoramento complicados são frequentemente necessários, e os tumores podem se desenvolver lenta e inconsistentemente⁴. Os modelos de aloenxerto derivados do GEM são mais adequados para estudos terapêuticos pré-clínicos, onde grandes coortes de camundongos portadores de tumor são necessárias em um período de tempo mais curto.

Em um relato anterior, descrevemos um modelo ortotópico de GBM em camundongos derivado diretamente de tumores GEM. A tumorigênese no GEM é iniciada por eventos genéticos em populações celulares (principalmente astrócitos) expressando proteína glial fibrilar ácida (GFAP), que resultam em progressão para GBM. Esses GEMs TRP abrigam um transgene (T) TgGZT121, que expressa T121 após exposição à recombinase Cre dirigida por GFAP. A expressão da proteína T121 resulta na supressão da atividade da proteína Rb (Rb1, p107 e p103). A co-expressão de um transgene Cre dirigido por GFAP (GFAP-CreERT2) tem como alvo a expressão para astrócitos adultos após indução com tamoxifeno. Camundongos TRP também abrigam um mutante Cre-dependente Kras (Kras^G12D; R) alelos, para representar a ativação da via do receptor tirosina quinase, e são heterozigotos para a perda de Pten (P)^5,6. Aberrações gênicas concomitantes nas redes de receptores tirosina quinase (RTK), PI3K e RB estão implicadas em 74% da patogênese do GBM⁷. Portanto, as vias de sinalização primárias alteradas no GBM humano são representadas pelas mutações projetadas em camundongos TRP, em particular tumores GBM, nos quais alvos compartilhados a jusante de RTKs são^ativados5.

O modelo ortotópico singênico derivado do GEM foi validado como um modelo que recapitula características de tumores cerebrais humanos, incluindo invasividade e presença de biomarcadores de subtipo, para uso como uma plataforma para avaliar a terapêutica do câncer visando vias aberrantes no GBM. As células foram cultivadas a partir de tumores colhidos de cérebros de TRP e reimplantadas no cérebro de camundongos pareados por cepas, usando equipamentos estereotáxicos para injeção intracraniana no córtex. Este modelo ortotópico pré-clínico em camundongos desenvolveu tumores de GBM altamente celulares, invasivos, pleomórficos com alta taxa mitótica, e exibiam focos lineares de necrose por células neoplásicas e vascularização densa, como observado para GBM humano. O volume e o crescimento tumoral foram medidos por ressonância magnética (RM) in vivo .

Neste relato, descrevemos a técnica ideal para a injeção intracraniana de células GBM primárias ou linhagens celulares no cérebro selvagem de camundongos, usando tumores TRP como exemplo. O mesmo protocolo pode ser adaptado para camundongos imunocomprometidos e outras linhagens celulares GBM. Dicas cruciais são dadas para evitar armadilhas comuns, como preparação celular subótima ou vazamento celular no local da injeção, e para usar o equipamento estereotáxico corretamente para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade do modelo. Para fins translacionais, validamos o modelo por RM de detecção de crescimento de tumor cerebral em animais vivos, caracterização histológica, e apresentamos um exemplo de tratamento em camundongos portadores de tumor.

Protocolo

O protocolo de estudo aqui descrito foi aprovado pelo NCI do Frederick Animal Care and Use Committee. O NCI-Frederick é acreditado pela AAALAC International e segue a Política do Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cuidados com os animais foram realizados de acordo com os procedimentos descritos no "Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011; A National Academies Press, Washington D.C.).

1. Preparação de células injetáveis

NOTA: Células primárias de tumor cerebral (MBRs) de camundongos usadas para este modelo foram originalmente isoladas de camundongos TRP GEM induzidos por tamoxifeno, como descrito em El Meskini et ^al.5. Detalhes sobre a preparação celular podem ser encontrados nesta referência.

1. Execute as etapas a seguir utilizando técnica estéril em um gabinete de biossegurança.
2. Cultivar células tumorais cerebrais primárias in vitro até atingirem a fase de crescimento exponencial.
3. Colher as células em tripsina 0,25% e, uma vez desprendidas, diluí-las com meio de crescimento para inativar a tripsina.
4. Pellet as células por centrifugação a 400 x g e lavagem com meio sem soro. Repita uma vez antes da contagem.
5. Conte as células manualmente ou com um contador de células automatizado. Ressuspender as células em metilcelulose estéril a 5% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) na concentração desejada, com base em um volume final de injeção de 2 μL. A concentração celular desejada pode variar de acordo com a linhagem celular e o modelo do tumor cerebral. Para células GBM GEM TRP, injetamos 2 μL de uma solução de 25 x 10⁶ células/ml, ou 50.000 células.

2. Tensão do rato

1. Reproduza ou compre uma cepa de camundongo apropriada que corresponda ao fundo da cepa das células tumorais cerebrais. Para células TRP, use camundongos B6D2F1/J de 9 semanas de idade (a partir de um cruzamento entre fêmeas C57BL/6J [B6] e machos DBA/2J [D2]) como receptores de células tumorais.

3. Configuração da área cirúrgica

OBS: Todas as etapas cirúrgicas são realizadas por técnica asséptica em ambiente limpo e higienizado. Esfoliantes e equipamentos de proteção individual, incluindo máscara, devem ser usados pelo cirurgião. As ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas termicamente antes do uso.

1. Coloque protetores de superfície sob o aparelho estereotáxico e sobre a superfície de trabalho.
2. Conecte o tubo de vinil do aparelho de anestesia à porta IN da plataforma de anestesia a gás do aparelho estereotáxico e outro tubo à porta OUT.
3. Conecte o display digital a uma fonte de alimentação e ao aparelho.
4. Conecte o controlador da microbomba (Figura 1A) a uma fonte de alimentação e conecte a microbomba (Figura 1A) ao braço manipulador do aparelho (consulte também as instruções do fabricante).
5. Ajuste a microbomba para 5,6 nL/s para a injeção de volume de 2.000 nL.
6. Ligue o esterilizador de esferas quentes.
7. Conecte a almofada de aquecimento do mouse ao controlador de temperatura e conecte-se a uma fonte de energia. Coloque a placa na plataforma do palco. Ajuste a temperatura da placa para 37 °C.
8. Backload uma seringa de precisão de 30 G, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Insira o êmbolo e prenda a agulha. Certifique-se de segurar a agulha apenas pelo cubo. Pressione o êmbolo até que uma gota da mistura de células metilcelulose se distribua através da agulha. Limpe a agulha com uma almofada de preparação de álcool a 70%, limpando cuidadosamente as laterais da agulha ou colocando uma compressa de gaze estéril na superfície de trabalho e manchando-a. Tome cuidado para não dobrar ou quebrar a agulha.
9. Conecte a seringa de precisão à microbomba e gire o braço manipulador para longe do palco, para evitar o deslocamento da seringa-agulha antes de colocar o mouse no palco.

4. Preparando o mouse para a cirurgia

1. Anestesiar o camundongo colocando-o na câmara de indução com vaporizador de isoflurano regulado para 2,5%, ou de acordo com diretrizes institucionais. Ligue o fluxo de isoflurano para o cone nasal.
2. Transfira o mouse para o aparelho estereotáxico e fixe no cone nasal, com os dentes superiores posicionados sobre o suporte do cone nasal (Figura 1B, 9). Aperte o botão no cone nasal para fixar (Figura 1B). Garanta um nível adequado de anestesia realizando uma pinça no dedo do pé para verificar se há reflexo.
   1. Monitore as orelhas, pés e membranas mucosas para cor (rosa) para garantir a oxigenação adequada. Além disso, monitorar a frequência respiratória (um aumento ou diminuição pode indicar a necessidade de ajustar os níveis de isoflurano).
3. Insira as barras auriculares (Figura 1B) em ambas as orelhas e aperte o botão para prender a cabeça.
4. Aplique pomada ocular para lubrificar os olhos enquanto o rato está sob anestesia.
5. Use pinças curvas para arrancar o cabelo na cabeça do rato para uma área cerca de 150% maior do que a incisão planejada, para garantir condições assépticas adequadas.
6. Injetar 0,5-1 mg/kg de buprenorfina SR analgesia por via subcutânea ou usar outro analgésico aprovado pelo protocolo.
7. Posicione a sonda retal do mouse para monitorar a temperatura interna e evitar hipotermia devido à anestesia. Mantenha a temperatura corporal do rato entre 36,5 e 38,5 °C.
8. Higienizar o campo cirúrgico utilizando círculos externos, alternando três vezes a paramentação cirúrgica e o etanol.
9. Usando pinças para puxar a pele tensa, faça uma incisão de aproximadamente 1 cm com a lâmina do bisturi, começando entre os olhos. O bregma deve ser visível através da incisão.
   NOTA: Para uma técnica estéril adequada, toque no local cirúrgico apenas com as pontas de ferramentas esterilizadas e coloque as pontas das ferramentas apenas em uma superfície estéril (como o interior de um pacote de ferramentas autoclavado).
10. Use a extremidade de madeira do aplicador com ponta de algodão para raspar o excesso de tecido conjuntivo e, em seguida, a extremidade de algodão de outro aplicador para secar.

5. Injeção de células

1. Devolva o braço do manipulador com o acessório da seringa sobre o mouse, apertando o botão para fixar. Use os botões X e Y no plano horizontal para mover a montagem da seringa sobre o bregma. Abaixe a agulha usando o botão Z para confirmar a posição do bregma. Defina o console de leitura digital como zero.
2. Use os botões X e Y e a leitura digital correspondente para mover a agulha para a posição desejada. Para a localização do córtex cortical, as coordenadas apropriadas são 3 mm posteriores, 2 mm laterais à direita do bregma e 2 mm de profundidade da dura-máter. Use o botão Z para mover a agulha para a superfície do crânio.
3. Puncione um orifício no crânio usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 25 G acoplada. Coloque o bisel da agulha em direção à seringa e agulha de precisão de 30 G e gire cuidadosamente o braço do manipulador para o lado. Usando o polegar e o dedo, role a agulha para frente e para trás lentamente com pressão suave até que a ponta da agulha apenas perfure a calota craniana.
4. Use um aplicador com ponta de algodão para afastar qualquer sangue do orifício da agulha. Substitua o braço do manipulador para a posição apropriada com a agulha de seringa de precisão carregada acima do orifício. Alinhe a ponta da agulha com o orifício, usando o botão Z para abaixar a agulha até a dura-má-cérebro, e ajuste o console de leitura digital para zero.
5. Usando o botão Z, abaixe a agulha 1 mm e aguarde 1 min. Repita até atingir a profundidade desejada (2 mm, conforme indicado).
   NOTA: A agulha é abaixada lentamente para evitar danos adicionais ao tecido cerebral circundante e ao refluxo da solução celular.
6. Inicie a microbomba e, em seguida, monitore para garantir que a bomba pare quando 2 μL tiverem sido injetados. Este processo deve levar cerca de 6 min na velocidade indicada. Em seguida, aguarde 1 min antes de mover a agulha.

6. Remoção da agulha e fechamento da ferida

1. Levante a agulha 1 mm e aguarde 1 min. Repita até que a agulha esteja completamente livre do crânio.
2. Se necessário, use um aplicador com ponta de algodão para afastar o sangue do local da injeção.
3. Usando a extremidade de madeira de um aplicador com ponta de algodão, pegue um pequeno pedaço de cera de osso (~1 mm) e modele-o em um cone. Coloque-o na abertura do crânio, empurrando a cera para dentro do buraco.
4. Aqueça as pinças usando um esterilizador de contas e use-as para derreter a cera restante no crânio e alisá-lo.
5. Coloque aproximadamente duas gotas de solução de bupivacaína (anestésico) na incisão e use pinças para unir as bordas da pele.
6. Puxe a pele tensa e coloque um ou dois clipes para fechar a pele.
7. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpa em uma almofada de aquecimento em uma área livre de correntes de ar e observe atentamente o mouse. Permita que o rato acorde completamente da anestesia, retomando a atividade normal, antes de devolvê-lo ao alojamento normal.
8. Verifique o mouse diariamente após o procedimento cirúrgico e administre o controle da dor, de acordo com as diretrizes institucionais.
   1. Se a buprenorfina SR (Passo 4.6) for utilizada para analgesia, a fórmula de liberação sustentada dura 72 h. Repita a injeção apenas se houver dor ou desconforto visíveis após 72 horas. Quando realizada corretamente, os camundongos se recuperam bem das injeções intracranianas e não é necessária analgesia adicional.
   2. Remova os grampos 7-10 dias após a cirurgia.
9. Monitorar o crescimento do tumor por imagens de animais vivos (RM).
   1. Eutanasiar os camundongos quando os desfechos humanos forem atingidos (ou seja, se o animal perder 20% do peso corporal ou se tornar hipotérmico).
   2. Devido à natureza invasiva desses tumores cerebrais, observe os camundongos quanto a sintomas neurológicos, como marcha irregular, paralisia parcial, rotação ou inclinação da cabeça. Eutanásia de um camundongo se algum desses sinais clínicos de crescimento avançado do tumor for observado.

Resultados

Camundongos injetados com células tumorais cerebrais devem ser monitorados diariamente em busca de sinais de crescimento tumoral, como convulsões, ataxia ou perda de peso. O crescimento do tumor cerebral também pode ser monitorado por ressonância magnética em intervalos regulares. A RM semanal permite a visualização do aumento da carga tumoral no interior do encéfalo e das medidas de volume tumoral (Figura 1C). Em particular, os tumores de TRP exibem crescimento agressivo, e os volum...

Discussão

Modelos pré-clínicos são essenciais para a avaliação de novos alvos terapêuticos e novas estratégias de tratamento no GBM. Modelos de camundongos geneticamente modificados para GBM têm a vantagem da ocorrência de tumores no sítio autóctone, mas muitas vezes com longa latência e crescimento tumoral^{imprevisível13}. Os tumores modelo GEM exibem uma latência de 4-5 meses, e a janela de tempo ideal para imagem, recrutamento e tratamento é variável entre camundongos individuais. O modelo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T