다형성 교모세포종의 번역 동소 모델

요약

여기에서 우리는 유전자 조작 마우스 모델 종양에서 파생된 세포의 두개내 주입에 의해 확립된 GBM에 대한 전임상 동소 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 인간 GBM의 질병 특징을 표시합니다. 중개 연구를 위해 마우스 뇌종양은 생체 내 MRI 및 조직병리학에 의해 추적됩니다.

초록

인간 다형성 교모세포종(GBM)에 대한 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 뇌종양의 발달과 진행을 이해하는 데 중요합니다. 이종 이식 종양과는 달리, GEM에서 종양은 면역 적격 마우스의 천연 미세 환경에서 발생합니다. 그러나 전임상 치료 연구에서 GBM GEM을 사용하는 것은 긴 종양 잠복기, 신생물 빈도의 이질성 및 고급 등급 종양 발달 시기로 인해 어렵습니다. 두개내 동소 주사를 통해 유도된 마우스는 전임상 연구에서 더 다루기 쉽고 GEM 종양의 특징을 유지합니다. 우리는 Rb, Kras 및 p53 수차(TRP)가 있는 GEM 모델에서 파생된 동소 뇌종양 모델을 생성했으며, 이는 신생물 세포에 의한 괴사의 선형 초점과 인간 GBM과 유사한 조밀한 혈관화를 나타내는 GBM 종양을 발달시킵니다. GEM GBM 종양에서 유래한 세포를 야생형의 균주 일치 수용자 마우스에 두개내 주입하고 등급 IV 종양을 재현하므로 GEM 마우스에서 긴 종양 잠복기를 우회하고 전임상 연구를 위한 크고 재현 가능한 코호트를 생성할 수 있습니다. GBM에 대한 TRP GEM 모델의 고증식성, 침습성 및 혈관 특징은 동소 종양에서 요약되며 조직병리학 마커는 인간 GBM 하위 그룹을 반영합니다. 종양 성장은 일련의 MRI 스캔으로 모니터링됩니다. 면역 적격 모델에서 두개내 종양의 침습적 특성으로 인해 여기에 설명된 주사 절차를 주의 깊게 따르는 것이 두개외 종양 성장을 방지하는 데 필수적입니다.

서문

교모세포종(GBM; grade IV glioma)은 가장 흔하고 악성 뇌종양이며, 현재의 치료법은 효과가 없어 생존 중앙값이 15개월이다¹. 뇌종양 성장 및 병인과 관련된 복잡한 신호 전달 경로를 나타내는 신뢰할 수 있고 정확한 전임상 모델은 GBM에 대한 새로운 치료 요법 평가의 진전을 촉진하는 데 필수적입니다. 인간 뇌종양 세포주를 면역저하 마우스에 피하로 이식한 마우스 모델은 뇌종양의 본래 면역 환경을 반영하지 않으며, 혈액뇌장벽을 통과하는 치료제의 능력을 평가하는 데 사용할 수 없다². 이상적으로, 전임상 마우스 모델은 또한 주변 실질에 대한 높은 수준의 침습성을 포함하여 인간 GBM 조직병리학을 밀접하게 재현해야 한다³. 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 온전한 면역계의 맥락에서 종양을 발생시키지만, 복잡한 육종 계획이 필요한 경우가 많으며, 종양이 느리고 일관되지 않게 진행될 수 있다⁴. GEM 유래 동종이식 모델은 종양이 있는 마우스의 대규모 코호트가 더 짧은 기간에 필요한 전임상 치료 연구에 더 적합합니다.

이전 보고서에서 우리는 GEM 종양에서 직접 파생된 동소 GBM 마우스 모델을 설명했습니다. GEM의 종양 형성은 신경교 섬유소 산성 단백질(GFAP)을 발현하는 세포 집단(주로 성상교세포)의 유전적 사건에 의해 시작되어 GBM으로 진행됩니다. 이 TRP GEM은 GFAP 구동 Cre 재조합효소에 노출된 후 T121을 발현하는 TgGZT121 이식유전자(T)를 보유합니다. T121 단백질 발현은 Rb (Rb1, p107, 및 p103) 단백질 활성의 억제를 초래한다. GFAP-driven Cre 이식유전자(GFAP-CreERT2)의 공동 발현은 타목시펜으로 유도한 후 성인 성상교세포로의 발현을 표적으로 합니다. TRP 마우스는 또한 Cre-의존성 돌연변이 Kras(Kras^G12D; R) 대립유전자는, 수용체 티로신 키나아제 경로의 활성화를 나타내며, Pten(P)^5,6의 손실에 대해 이형접합성이다. 수용체 티로신 키나아제(RTK), PI3K 및 RB 네트워크의 동시 유전자 이상은 GBM 발병기전의 74%와 관련이 있습니다⁷. 따라서 인간 GBM에서 변경된 1차 신호전달 경로는 TRP 마우스, 특히 RTK의 공유 다운스트림 표적이 활성화된 GBM 종양에서 조작된 돌연변이로 표시됩니다⁵.

GEM 유래 syngeneic orthotopic 모델은 GBM에서 비정상적인 경로를 표적으로 하는 암 치료제를 평가하기 위한 플랫폼으로 사용하기 위해 침습성 및 아형 바이오마커의 존재를 포함하여 인간 뇌종양의 특징을 요약하는 모델로 검증되었습니다. 세포는 TRP 뇌에서 채취한 종양에서 배양되고 피질의 두개내 주입을 위한 정위 장비를 사용하여 균주 일치 마우스의 뇌에 다시 이식되었습니다. 이 전임상 동소 마우스 모델은 인간 GBM에서 관찰된 바와 같이 유사분열 속도가 높은 고도로 세포성, 침습성, 다형성성이고 종양 세포에 의한 괴사의 선형 병소 및 조밀한 혈관화를 나타내는 GBM 종양을 개발했습니다. 종양 부피 및 성장은 생체내 자기 공명 영상(MRI)에 의해 측정되었다.

이 보고서에서는 TRP 종양을 예로 들어 원발성 GBM 세포 또는 세포주를 야생형 마우스 뇌에 두개내 주입하는 최적의 기술을 설명합니다. 동일한 프로토콜이 면역저하 마우스 및 다른 GBM 세포주에 대해 적응될 수 있다. 최적이 아닌 세포 준비 또는 주입 부위에서의 세포 누출과 같은 일반적인 함정을 방지하고 정위 장비를 올바르게 사용하여 모델 재현성과 신뢰성을 보장하기 위한 중요한 팁이 제공됩니다. 번역 목적을 위해, 우리는 살아있는 동물의 뇌종양 성장에 대한 MRI 검출, 조직학적 특성화를 통해 모델을 검증하고 종양이 있는 마우스에서의 치료 예를 제시합니다.

프로토콜

여기에 설명된 연구 프로토콜은 Frederick Animal Care and Use Committee의 NCI에 의해 승인되었습니다. NCI-Frederick은 AAALAC International의 인증을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 공중 보건 서비스 정책을 따릅니다. 동물 관리는 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드(National Research Council, 2011; National Academies Press, 워싱턴 D.C.).

1. 주사용 세포의 제조

참고: 이 모델에 사용된 마우스 뇌종양 원발성 세포(MBR)는 원래 El Meskini et ^al.5에 설명된 바와 같이 타목시펜 유도 TRP GEM 마우스에서 분리되었습니다. 세포 제조에 대한 자세한 내용은 이 참고문헌에서 찾을 수 있습니다.

1. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 다음 단계를 수행하십시오.
2. 원발성 뇌종양 세포가 기하급수적인 성장 단계에 도달할 때까지 시험관 내에서 배양합니다.
3. 0.25% 트립신에서 세포를 수확하고 분리되면 성장 배지로 희석하여 트립신을 비활성화합니다.
4. 400 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 무혈청 배지로 세척합니다. 계산하기 전에 한 번 반복하십시오.
5. 수동으로 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 2μL의 최종 주입 부피를 기준으로 원하는 농도로 1x 인산염 완충 식염수(PBS)의 5% 멸균 메틸셀룰로오스에 세포를 재현탁합니다. 원하는 세포 농도는 세포주 및 뇌종양 모델에 따라 달라질 수 있다. GBM GEM TRP 세포의 경우 25 x 10⁶ cells/ml 용액 또는 50,000개 세포 2μL를 주입합니다.

2. 마우스 변형

1. 뇌종양 세포의 균주 배경과 일치하는 적절한 마우스 균주를 번식시키거나 구입하십시오. TRP 세포의 경우 9주령의 B6D2F1/J 마우스(C57BL/6J [B6] 암컷과 DBA/2J [D2] 수컷 사이의 교배종)를 종양 세포 수혜자로 사용합니다.

3. 수술 부위 설정

알림: 모든 수술 단계는 깨끗하고 위생적인 환경에서 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 외과의는 마스크를 포함한 스크럽 및 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 수술 도구는 사용하기 전에 열 멸균해야 합니다.

1. 표면 보호기를 입체 장치 아래와 작업 표면에 놓습니다.
2. 마취기의 비닐 튜브를 정위 장치의 가스 마취 플랫폼의 IN 포트에 연결하고 다른 튜브를 OUT 포트에 연결합니다.
3. 디지털 디스플레이를 전원과 장치에 연결합니다.
4. 마이크로 펌프 컨트롤러(그림 1A)를 전원에 연결하고 마이크로 펌프(그림 1A)를 장치의 매니퓰레이터 암에 연결합니다(제조업체 지침 참조).
5. 2,000nL 체적 주입을 위해 마이크로 펌프를 5.6nL/s로 설정합니다.
6. 핫 비드 살균기를 켭니다.
7. 마우스 가열 패드를 온도 조절기에 꽂고 전원에 연결합니다. 접시를 무대 플랫폼에 놓습니다. 플레이트 온도를 37°C로 설정합니다.
8. 기포가 생기지 않도록 주의하면서 30G 정밀 주사기를 백로드합니다. 플런저를 삽입하고 바늘을 부착하십시오. 바늘을 허브로만 잡으십시오. 메틸셀룰로오스 세포 혼합물 한 방울이 바늘을 통해 분배될 때까지 플런저를 누릅니다. 바늘의 측면을 조심스럽게 닦거나 멸균 거즈 패드를 작업 표면에 놓고 닦아서 70% 알코올 준비 패드로 바늘을 청소합니다. 바늘이 구부러지거나 부러지지 않도록 주의하십시오.
9. 정밀 주사기를 마이크로 펌프에 부착하고 매니퓰레이터 암을 스테이지에서 멀리 돌려 마우스를 스테이지에 놓기 전에 주사기 바늘 변위를 방지합니다.

4. 마우스 수술 준비

1. 이소플루란 기화기를 2.5%로 설정한 상태에서 유도 챔버에 마우스를 넣거나 기관 지침에 따라 마우스를 마취합니다. 노즈콘으로의 이소플루란 흐름을 켭니다.
2. 마우스를 정위 장치로 옮기고 노즈콘 지지대에 상단 치아를 위치시켜 노즈콘에 고정합니다(그림 1B, 9). 노즈콘의 손잡이를 조여 고정합니다(그림 1B). 반사를 확인하기 위해 발가락 꼬집을 수행하여 적절한 수준의 마취를 보장합니다.
   1. 귀, 발, 점막의 색(분홍색)을 모니터링하여 적절한 산소 공급을 보장합니다. 또한 호흡수를 모니터링하십시오 (증가 또는 감소는 이소 플루란 수치를 조정해야 함을 나타낼 수 있음).
3. 이어바(그림 1B)를 양쪽 귀에 삽입하고 손잡이를 조여 헤드를 고정합니다.
4. 마우스가 마취 상태에있는 동안 눈을 윤활하기 위해 눈 연고를 바르십시오.
5. 구부러진 집게를 사용하여 마우스 머리의 털을 계획된 절개보다 약 150% 더 큰 영역으로 뽑아 적절한 무균 상태를 보장합니다.
6. 0.5-1 mg/kg 부프레노르핀 SR 진통제를 피하 주사하거나 다른 프로토콜 승인 진통제를 사용하십시오.
7. 마우스 직장 프로브를 배치하여 내부 온도를 모니터링하고 마취로 인한 저체온증을 예방합니다. 마우스 체온을 36.5 내지 38.5 °C로 유지한다.
8. 바깥쪽 원을 사용하여 수술 부위를 소독하고 수술용 스크럽과 에탄올을 세 번 번갈아 가며 소독합니다.
9. 집게를 사용하여 피부를 팽팽하게 당기고 메스 칼날로 눈 사이를 시작하여 약 1cm를 절개합니다. 브레그마는 절개를 통해 볼 수 있어야 합니다.
   알림: 적절한 멸균 기술을 위해 멸균된 도구의 끝으로만 수술 부위를 만지고 도구 팁을 멸균 표면(예: 오토클레이브 도구 팩 내부)에만 내려놓으십시오.
10. 끝이 솜이 있는 어플리케이터의 나무 끝을 사용하여 과도한 결합 조직을 긁어낸 다음 다른 어플리케이터의 면 끝을 사용하여 건조시킵니다.

5. 세포 주입

1. 주사기가 부착된 매니퓰레이터 암을 마우스 위로 되돌리고 손잡이를 조여 고정합니다. 수평면에 있는 X 및 Y 손잡이를 사용하여 주사기 마운트를 브레그마 위로 이동합니다. Z 노브를 사용하여 바늘을 내려 브레그마 위치를 확인합니다. 디지털 판독 콘솔을 0으로 설정합니다.
2. X 및 Y 노브와 해당 디지털 판독값을 사용하여 바늘을 원하는 위치로 이동합니다. 피질 피질 위치의 경우 적절한 좌표는 뒤쪽 3mm, 브레그마 오른쪽 측면 2mm, 경막에서 깊이 2mm입니다. Z 노브를 사용하여 바늘을 두개골 표면으로 이동합니다.
3. 25G 바늘이 부착된 1mL 주사기를 사용하여 두개골에 구멍을 뚫습니다. 바늘의 경사를 30G 정밀 주사기와 바늘 쪽으로 놓고 매니퓰레이터 암을 조심스럽게 옆으로 돌립니다. 엄지와 손가락을 사용하여 바늘 끝이 두개골 캡을 뚫을 때까지 부드러운 압력으로 바늘을 천천히 앞뒤로 굴립니다.
4. 면봉 어플리케이터를 사용하여 바늘 구멍에서 혈액을 두드리십시오. 구멍 위에 로드된 정밀 주사기 바늘을 사용하여 매니퓰레이터 암을 적절한 위치로 교체합니다. Z 노브를 사용하여 바늘 끝을 구멍에 맞추고 바늘을 뇌 경막으로 내리고 디지털 판독 콘솔을 0으로 설정합니다.
5. Z 노브를 사용하여 바늘을 1mm 내린 다음 1분 동안 기다립니다. 원하는 깊이에 도달할 때까지 반복합니다(표시된 대로 2mm).
   참고: 주변 뇌 조직의 추가 손상과 세포 용액의 역류를 방지하기 위해 바늘을 천천히 내립니다.
6. 마이크로 펌프를 시작한 다음 2μL가 주입되었을 때 펌프가 멈추는지 모니터링합니다. 이 프로세스는 표시된 속도로 약 6분이 소요됩니다. 그런 다음 바늘을 움직이기 전에 1분 정도 기다리십시오.

6. 바늘 제거 및 상처 봉합

1. 바늘을 1mm 올린 다음 1분 동안 기다립니다. 바늘이 두개골에서 완전히 자유로워질 때까지 반복합니다.
2. 필요한 경우 면봉 어플리케이터를 사용하여 주사 부위에서 혈액을 두드리십시오.
3. 끝이 솜이 있는 어플리케이터의 나무 끝을 사용하여 작은 뼈 왁스 조각(~1mm)을 원뿔 모양으로 만듭니다. 두개골의 구멍에 넣고 왁스를 구멍에 밀어 넣습니다.
4. 비드 살균기를 사용하여 집게를 가열하고 두개골에 남아있는 왁스를 녹여 부드럽게합니다.
5. 부피바카인(마취제) 용액 약 2방울을 절개 부위에 넣고 집게를 사용하여 피부 가장자리를 함께 당깁니다.
6. 피부를 팽팽하게 당기고 하나 또는 두 개의 상처 클립을 넣어 피부를 닫습니다.
7. 통풍이 없는 지역의 가열 패드에 있는 깨끗한 복구 케이지에 마우스를 놓고 마우스를 면밀히 관찰합니다. 마우스가 마취에서 완전히 깨어나 정상적인 활동을 재개 한 후 일반 주택으로 되돌려 놓으십시오.
8. 수술 후 매일 마우스를 확인하고 기관 지침에 따라 통증 관리를 관리합니다.
   1. 부프레노르핀 SR(단계 4.6)을 진통에 사용하는 경우 서방성 포뮬러는 72시간 동안 지속됩니다. 72시간 후에 눈에 띄는 통증이나 불편함이 있는 경우에만 주사를 반복하십시오. 올바르게 수행되면 마우스는 두개 내 주사에서 잘 회복되며 추가 진통이 필요하지 않습니다.
   2. 수술 후 7-10일 후에 스테이플을 제거합니다.
9. 살아있는 동물 영상(MRI)으로 종양 성장을 모니터링합니다.
   1. 인도적 종점에 도달하면 생쥐를 안락사시킵니다(즉, 동물이 체중의 20%를 잃거나 저체온증이 되는 경우).
   2. 이러한 뇌종양의 침습적 특성으로 인해 고르지 않은 보행, 부분 마비, 회전 또는 머리 기울임과 같은 신경학적 증상에 대해 마우스를 관찰합니다. 진행된 종양 성장의 이러한 임상 징후 중 하나라도 관찰되는 경우 마우스를 안락사시킵니다.

결과

뇌종양 세포를 주사한 마우스는 발작, 운동실조증 또는 체중 감소와 같은 종양 성장의 징후가 있는지 매일 모니터링해야 합니다. 뇌종양 성장은 또한 정기적으로 MRI 스캔으로 모니터링할 수 있습니다. 매주 MRI 스캔을 통해 뇌 내 증가하는 종양 부담과 종양 부피 측정을 시각화할 수 있습니다(그림 1C). 특히, TRP 종양은 공격적인 성장을 나타내며, 3D 종양 부피는 두개내 주사 ?...

토론

전임상 모델은 GBM에서 새로운 치료 표적과 새로운 치료 전략을 평가하는 데 필수적입니다. GBM에 대한 유전자 조작 마우스 모델은 자가성 부위에서 종양이 발생할 수 있다는 이점이 있지만, 종종 긴 잠복기와 예측할 수 없는 종양 성장을 보인다¹³. GEM 모델 종양은 4-5개월의 잠복기를 나타내며 이미징, 모집 및 치료를 위한 이상적인 시간 창은 개별 마우스마다 다릅니다. 동소 모델?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T