多形性胶质母细胞瘤的转化原位模型

摘要

在这里，我们描述了GBM的临床前原位小鼠模型，该模型是通过颅内注射源自基因工程小鼠模型肿瘤的细胞而建立的。该模型显示了人类GBM的疾病特征。对于转化研究，通过 体内 MRI和组织病理学跟踪小鼠脑肿瘤。

摘要

用于人类多形性胶质母细胞瘤（GBM）的基因工程小鼠（GEM）模型对于了解脑肿瘤的发展和进展至关重要。与异种移植肿瘤不同，在GEM中，肿瘤在免疫功能正常的小鼠的天然微环境中出现。然而，由于肿瘤潜伏期长、肿瘤频率异质性以及晚期肿瘤发展的时间，GBM GEMs在临床前治疗研究中的使用具有挑战性。通过颅内原位注射 诱导 的小鼠在临床前研究中更容易处理，并保留了GEM肿瘤的特征。我们生成了一个原位脑肿瘤模型，该模型源自具有Rb，Kras和p53畸变（TRP）的GEM模型，该模型发展为GBM肿瘤，显示肿瘤细胞的线性坏死病灶，以及类似于人类GBM的密集血管化。来自GEM GBM肿瘤的细胞被颅内注射到野生型，品系匹配的受体小鼠中并复制IV级肿瘤，因此绕过了GEM小鼠中较长的肿瘤潜伏期，并允许为临床前研究创建大型且可重复的队列。针对 GBM 的 TRP GEM 模型的高度增殖性、侵袭性和血管特征在原位肿瘤中得到概括，组织病理学标志物反映了人类 GBM 亚组。通过连续MRI扫描监测肿瘤生长。由于免疫功能正常模型中颅内肿瘤的侵袭性，仔细遵循此处概述的注射程序对于防止颅外肿瘤生长至关重要。

引言

胶质母细胞瘤（GBM;IV 级胶质瘤）是最常见和恶性的脑肿瘤，目前的治疗方法无效，导致中位生存期为 15 个月¹。代表脑肿瘤生长和发病机制所涉及的复杂信号通路的可靠和准确的临床前模型对于加快评估GBM新治疗方案的进展至关重要。将人脑肿瘤细胞系皮下植入免疫功能低下的小鼠小鼠模型不能反映脑肿瘤的天然免疫环境，也不能用于评估治疗药物穿越血脑屏障的能力²。理想情况下，临床前小鼠模型还应密切再现人类GBM组织病理学，包括对周围薄壁³的高度侵入性。尽管基因工程小鼠（GEM）模型在完整的免疫系统背景下发展肿瘤，但通常需要复杂的育种方案，并且肿瘤可能发展缓慢^{且不一致4}。GEM衍生的同种异体移植模型更适合临床前治疗研究，在这些研究中，需要在更短的时间内进行大量荷瘤小鼠。

在之前的报告中，我们描述了一种直接来自GEM肿瘤的原位GBM小鼠模型。GEM中的肿瘤发生是由表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的细胞群（主要是星形胶质细胞）中的遗传事件引发的，导致进展为GBM。这些TRP GEM含有TgGZT121转基因（T），其在暴露于GFAP驱动的Cre重组酶后表达T121。T121蛋白表达导致Rb（Rb1，p107和p103）蛋白活性的抑制。GFAP驱动的Cre转基因（GFAP-CreERT2）的共表达靶向使用他莫昔芬诱导后对成年星形胶质细胞的表达。TRP小鼠还携带一种依赖克雷的突变体克拉斯（Kras^G12D;R）等位基因，代表受体酪氨酸激酶途径的激活，并且是Pten（P）^5，6损失的杂合子。受体酪氨酸激酶 （RTK）、PI3K 和 RB 网络中的并发基因畸变与 74% 的 GBM 发病机制有关⁷。因此，人类GBM中改变的主要信号通路由TRP小鼠的工程突变表示，特别是GBM肿瘤，其中RTK的共同下游靶标被激活⁵。

GEM衍生的同源原位模型被验证为一种模型，该模型概括了人脑肿瘤的特征，包括侵袭性和亚型生物标志物的存在，可用作评估针对GBM异常途径的癌症治疗的平台。从从TRP脑中收获的肿瘤中培养细胞，并使用立体定向设备在皮层中进行颅内注射，重新植入品系匹配小鼠的大脑中。该临床前原位小鼠模型开发了GBM肿瘤，这些肿瘤具有高度细胞性，侵袭性，多形性，具有高有丝分裂率，并显示出肿瘤细胞坏死和致密血管化的线性病灶，如人类GBM所观察到的那样。通过 体内 磁共振成像（MRI）测量肿瘤体积和生长。

在本报告中，我们以TRP肿瘤为例，描述了将原代GBM细胞或细胞系颅内注射到野生型小鼠大脑中的最佳技术。相同的方案可以适用于免疫功能低下的小鼠和其他GBM细胞系。给出了避免常见陷阱的关键技巧，例如细胞制备欠佳或注射部位的细胞泄漏，以及正确使用立体定向设备以确保模型的可重复性和可靠性。出于转化目的，我们通过MRI检测活体动物脑肿瘤生长，组织学表征来验证该模型，并提出了荷瘤小鼠的治疗示例。

研究方案

这里描述的研究方案得到了弗雷德里克动物护理和使用委员会的NCI的批准。NCI-Frederick获得了AAALAC国际的认可，并遵循实验动物护理和使用公共卫生服务政策。动物护理是根据"实验动物护理和使用指南"（国家研究委员会，2011 年;国家科学院出版社，华盛顿特区）。

1.注射用细胞的制备

注意:用于该模型的小鼠脑肿瘤原代细胞（MBR）最初是从他莫昔芬诱导的TRP GEM小鼠中分离出来的，如El Meskini等人5^中所述。有关细胞制备的详细信息，请参阅本参考文献。

1. 在生物安全柜中使用无菌技术执行以下步骤。
2. 体外培养原发性脑肿瘤细胞，直到它们达到指数生长期。
3. 在0.25%胰蛋白酶中收获细胞，一旦它们分离，用生长培养基稀释它们以使胰蛋白酶失活。
4. 通过以400 x g 离心沉淀细胞并用无血清培养基洗涤。计数前重复一次。
5. 手动或使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。根据2μL的最终进样体积，将细胞重悬于5%无菌甲基纤维素中，以所需浓度在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。所需的细胞浓度可能因细胞系和脑肿瘤模型而异。对于GBM GEM TRP细胞，我们注入2μL的25 x 10⁶ 细胞/ ml溶液，或50，000个细胞。

2. 小鼠品系

1. 繁殖或购买与脑肿瘤细胞的菌株背景相匹配的适当小鼠品系。对于TRP细胞，使用9周龄的B6D2F1 / J小鼠（来自C57BL / 6J [B6]雌性和DBA / 2J [D2]雄性之间的杂交）作为肿瘤细胞受体。

3. 设置手术区域

注意:所有手术步骤均在清洁、消毒的环境中使用无菌技术进行。外科医生应佩戴磨砂膏和个人防护设备，包括口罩。手术工具在使用前必须进行热消毒。

1. 将表面保护器放置在立体定位设备和工作表面上。
2. 将麻醉机的乙烯基管连接到立体定位装置的气体麻醉平台的IN端口，并将另一根管连接到OUT端口。
3. 将数字显示器连接到电源和设备。
4. 将微型泵控制器（图1A）连接到电源，并将微型泵（图1A）连接到设备的机械臂（另请参阅制造商说明）。
5. 将微泵设置为 5.6 nL/s，以进行 2，000 nL 体积进样。
6. 打开热珠消毒器。
7. 将鼠标加热垫插入温度控制器并连接到电源。将盘子放在舞台平台上。将板温设置为37°C。
8. 回装30 G精密注射器，注意不要引入气泡。插入柱塞并连接针头。确保仅通过轮毂夹住针头。按下柱塞，直到一滴甲基纤维素细胞混合物通过针头分配。用70%酒精制备垫清洁针头，小心擦拭针头的侧面，或在工作表面上放置无菌纱布垫并吸干。注意不要弯曲或折断针头。
9. 将精密注射器连接到微型泵上，并在将鼠标放在载物台上之前将机械臂旋转远离载物台，以防止注射器针头移位。

4. 准备手术小鼠

1. 通过将小鼠置于诱导室中，异氟醚蒸发器设置为2.5%，或根据机构指南麻醉小鼠。打开异氟醚流向鼻锥。
2. 将鼠标转移到立体定位装置并固定在鼻锥上，将上齿定位在鼻锥支架上（图1B，9）。拧紧鼻锥上的旋钮以固定（图1B）。通过捏住脚趾来检查反射，以确保适当的麻醉水平。
   1. 监测耳朵、脚和粘膜的颜色（粉红色），以确保充足的氧合。此外，监测呼吸频率（增加或减少可能表明需要调整异氟醚水平）。
3. 将耳杆（图1B）插入双耳并拧紧旋钮以固定头部。
4. 在小鼠麻醉期间涂抹眼膏润滑眼睛。
5. 使用弯曲的镊子将小鼠头上的毛发拔出比计划切口大约150%的区域，以确保足够的无菌条件。
6. 皮下注射0.5-1mg/kg丁丙诺啡SR镇痛药，或使用其他方案批准的镇痛药。
7. 放置小鼠直肠探头以监测内部温度并防止由于麻醉引起的体温过低。保持鼠标体温在36.5至38.5°C之间。
8. 使用向外圆圈对手术区域进行消毒，在手术擦洗和乙醇之间交替使用三次。
9. 使用镊子拉紧皮肤，用手术刀刀片切开约1厘米的切口，从眼睛之间开始。前膛应通过切口可见。
   注意:对于正确的无菌技术，请仅用灭菌工具的尖端触摸手术部位，并仅将工具尖端放在无菌表面上（例如高压灭菌工具包的内部）。
10. 使用棉尖涂抹器的木端刮掉多余的结缔组织，然后用另一个涂抹器的棉端干燥。

5. 细胞注射

1. 将带有注射器附件的机械臂放回鼠标上，拧紧旋钮以固定。使用水平面上的 X 和 Y 旋钮将注射器支架移动到前膛上。使用 Z 旋钮降低针头以确认前膛位置。将数字读出控制台设置为零。
2. 使用 X 和 Y 旋钮以及相应的数字读数将指针移动到所需位置。对于皮质皮层位置，适当的坐标为后方 3 mm，前膛右侧 2 mm 外侧，距硬脑膜 2 mm 深。使用 Z 旋钮将针移动到头骨表面。
3. 使用带有25 G针头的1 mL注射器刺穿颅骨上的孔。将针头的斜面朝向30 G精密注射器和针头，并小心地将机械臂旋转到一侧。使用拇指和手指，用轻轻的压力慢慢来回滚动针头，直到针尖刚好刺穿颅帽。
4. 使用棉头涂抹器将针孔上的血液擦去。将机械臂更换到适当的位置，并在孔上方装载精密注射器针头。将针尖与孔对齐，使用 Z 旋钮将针头降低到脑硬膜，并将数字读出控制台设置为零。
5. 使用 Z 旋钮将针降低 1 毫米，然后等待 1 分钟。重复直到达到所需的深度（指示的 2 毫米）。
   注意:针头缓慢降低，以防止对周围脑组织和细胞溶液回流的额外损害。
6. 启动微量泵，然后进行监测以确保泵在注入 2 μL 时停止。在指示的速度下，此过程大约需要 6 分钟。然后，在移动针头之前等待 1 分钟。

6. 移除针头和伤口闭合

1. 将针头抬高1毫米，然后等待1分钟。重复直到针头完全脱离颅骨。
2. 如有必要，使用棉头涂抹器将任何血液从注射部位轻拍。
3. 使用棉头涂抹器的木端，取一小块骨蜡（~1毫米）并将其塑造成圆锥体。将其放入颅骨的开口中，将蜡推入孔中。
4. 使用珠子消毒器加热镊子，并用它们融化头骨上剩余的蜡并将其平滑。
5. 将大约两滴布比卡因（麻醉剂）溶液放入切口，并使用镊子将皮肤边缘拉在一起。
6. 拉紧皮肤并放置一两个伤口夹以闭合皮肤。
7. 将鼠标放在无气流区域的加热垫上的干净恢复笼中，并密切观察鼠标。让鼠标从麻醉中完全唤醒，恢复正常活动，然后再将其恢复正常住房。
8. 手术后每天检查小鼠，并根据机构指南进行疼痛管理。
   1. 如果丁丙诺啡SR（步骤4.6）用于镇痛，则缓释配方持续72小时。仅在72小时后出现明显的疼痛或不适时才重复注射。当正确执行时，小鼠从颅内注射中恢复良好，不需要额外的镇痛。
   2. 手术后 7-10 天取下订书钉。
9. 通过活体动物成像（MRI）监测肿瘤生长。
   1. 当达到人道终点时（即，如果动物体重减轻20%或体温过低），对小鼠实施安乐死。
   2. 由于这些脑肿瘤的侵袭性，观察小鼠的神经系统症状，如步态不均、部分瘫痪、旋转或头部倾斜。如果观察到任何这些晚期肿瘤生长的临床症状，则对小鼠实施安乐死。

结果

应每天监测注射脑肿瘤细胞的小鼠是否有肿瘤生长的迹象，如癫痫发作、共济失调或体重减轻。脑肿瘤的生长也可以通过定期的MRI扫描来监测。每周一次的MRI扫描可以可视化大脑中增加的肿瘤负荷和肿瘤体积测量（图1C）。特别是，TRP 肿瘤表现出侵袭性生长，并且在颅内注射后 2 至 3 周内可通过 MRI 测量 3D 肿瘤体积（平均体积为 30 至 40 mm³）。在一项代表性研究中，...

讨论

临床前模型对于评估GBM的新治疗靶点和新的治疗策略至关重要。用于GBM的基因工程小鼠模型具有肿瘤在本土部位发生的优势，但通常具有较长的潜伏期和不可预测的肿瘤生长¹³。GEM模型肿瘤表现出4-5个月的潜伏期，成像，募集和治疗的理想时间窗口在个体小鼠之间是可变的。原位模型具有4-5周的成熟且易于处理的生长和治疗时间表，并且在植入后通过MRI可靠地检测到肿瘤。使用GE...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T