多形性膠芽腫の並進同所性モデル

要約

ここでは、遺伝子操作されたモデルマウス腫瘍に由来する細胞の頭蓋内注射によって樹立されたGBMの前臨床同所性マウスモデルについて述べる。このモデルは、ヒトGBMの疾患の特徴を示しています。トランスレーショナル研究のために、マウス脳腫瘍は in vivoMRI および組織病理学によって追跡される。

要約

ヒト多形性膠芽腫(GBM)の遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、脳腫瘍の発生と進行を理解するために重要です。異種移植腫瘍とは異なり、GEMでは、腫瘍は免疫適格マウスの天然微小環境で発生します。しかし、前臨床治療研究におけるGBM GEMの使用は、腫瘍潜伏期間が長く、新生物頻度の不均一性、および進行性度の腫瘍発生のタイミングのために困難である。頭蓋内同所性注射 によって 誘導されたマウスは、前臨床試験にとってより扱いやすく、GEM腫瘍の特徴を保持しています。Rb、Kras、p53異常(TRP)を有するGEMモデルから派生した同所性脳腫瘍モデルを作成し、腫瘍細胞による線状壊死病巣を示すGBM腫瘍と、ヒトGBMに類似した高密度血管新生を発症した。GEM GBM腫瘍に由来する細胞は、野生型の系統が一致したレシピエントマウスに頭蓋内注射され、グレードIV腫瘍を再現するため、GEMマウスの長い腫瘍潜伏期間を回避し、前臨床試験用の大規模で再現性のあるコホートの作成を可能にします。GBMのTRP GEMモデルの高度に増殖性、浸潤性、および血管の特徴は、同所性腫瘍で再現され、組織病理学マーカーはヒトGBMサブグループを反映しています。腫瘍の成長は、連続MRIスキャンによって監視されます。免疫適格モデルにおける頭蓋内腫瘍の浸潤性のため、ここで概説した注射手順に注意深く従うことは、頭蓋外腫瘍の成長を防ぐために不可欠です。

概要

膠芽腫(GBM;グレードIV神経膠腫)は最も一般的で悪性の脳腫瘍であり、現在の治療法は効果がなく、生存期間の中央値は15か月です¹。脳腫瘍の成長と病因に関与する複雑なシグナル伝達経路を表す信頼性の高い正確な前臨床モデルは、GBMの新しい治療レジメンの評価の進歩を促進するために不可欠です。ヒト脳腫瘍細胞株を免疫不全マウスの皮下に移植したマウスモデルは、脳腫瘍の本来の免疫環境を反映しておらず、血液脳関門を通過する治療薬の能力を評価するためにも使用できません²。理想的には、前臨床マウスモデルはまた、周囲の実質³への高レベルの侵襲性を含むヒトGBM組織病理学を密接に再現すべきである。遺伝子改変マウス(GEM)モデルは、無傷の免疫系の状況で腫瘍を発症しますが、複雑な育種スキームが必要になることが多く、腫瘍は^{ゆっくりと一貫性のない}状態で発生する可能性があります4。GEM由来の同種移植片モデルは、担がんマウスの大規模なコホートがより短い時間枠で必要とされる前臨床治療研究に適しています。

以前の報告では、GEM腫瘍から直接誘導された同所性GBMマウスモデルについて説明しました。GEMにおける腫瘍形成は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)を発現する細胞集団(主に星状細胞)における遺伝的事象によって開始され、その結果、GBMに進行する。これらのTRP GEMは、GFAP駆動Creリコンビナーゼへの曝露後にT121を発現するTgGZT121導入遺伝子(T)を保有しています。T121タンパク質発現は、Rb(Rb1、p107、およびp103)タンパク質活性の抑制をもたらす。GFAP駆動型Cre導入遺伝子(GFAP-CreERT2)の共発現は、タモキシフェンによる誘導後の成体星状細胞への発現を標的とする。TRPマウスはまた、Cre依存性変異Kras(Kras^G12D;R)対立遺伝子は、受容体チロシンキナーゼ経路の活性化を表すため、Pten(P)^5,6の喪失に対してヘテロ接合性である。受容体チロシンキナーゼ(RTK)、PI3K、およびRBネットワークにおける同時遺伝子異常は、GBM病因の74%に関与しています⁷。したがって、ヒトGBMで変化した一次シグナル伝達経路は、TRPマウス、特にGTKの共有下流標的が活性化されるGBM腫瘍における操作された突然変異によって表されます⁵。

GEM由来の同系同所性モデルは、GBMの異常な経路を標的とするがん治療薬を評価するためのプラットフォームとして使用するために、浸潤性やサブタイプバイオマーカーの存在など、ヒト脳腫瘍の特徴を再現するモデルとして検証されました。TRP脳から採取した腫瘍から細胞を培養し、皮質に頭蓋内注射するための定位装置を用いて、系統適合マウスの脳に再移植した。この前臨床同所性マウスモデルは、細胞性が高く、浸潤性で、有糸分裂率が高く、ヒトGBMで観察されたように、腫瘍細胞による壊死の線状病巣と密な血管新生を示すGBM腫瘍を発症しました。腫瘍体積および成長は、 in vivo 磁気共鳴画像法(MRI)によって測定した。

本報告では、初代GBM細胞または細胞株を野生型マウス脳に頭蓋内注射するための最適な手法について、TRP腫瘍を例に説明する。同じプロトコルを、免疫無防備状態のマウスおよび他のGBM細胞株に適合させることができる。最適ではない細胞調製や注入部位での細胞漏出などの一般的な落とし穴を回避し、定位装置を正しく使用してモデルの再現性と信頼性を確保するための重要なヒントを提供します。翻訳目的で、生きた動物の脳腫瘍増殖のMRI検出、組織学的特性評価、および担癌マウスでの治療例によってモデルを検証します。

プロトコル

ここに記載されている研究プロトコルは、フレデリック動物管理および使用委員会のNCIによって承認されました。NCI-フレデリックはAAALACインターナショナルの認定を受けており、実験動物の世話と使用に関する公衆衛生サービスポリシーに従っています。動物の世話は、「実験動物の世話と使用のためのガイド」(国立研究評議会、2011;全米アカデミーズプレス、ワシントンDC)。

1.注射用細胞の調製

注:このモデルに用いたマウス脳腫瘍初代細胞(MBR)は、El Meskiniらに記載されているように、もともとタモキシフェン誘導TRP GEMマウスから単離^{された5。}細胞調製の詳細は、この参考文献に見出すことができる。

1. バイオセーフティキャビネットで滅菌技術を使用して次の手順を実行します。
2. 初代脳腫瘍細胞を指数関数的増殖期に達するまで in vitro で培養します。
3. 細胞を0.25%トリプシンで採取し、剥離したら増殖培地で希釈してトリプシンを不活性化します。
4. 400 x g の遠心分離により細胞をペレット化し、無血清培地で洗浄します。カウントする前に一度繰り返します。
5. 手動または自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。細胞を5%滅菌メチルセルロースに1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、2 μLの最終注入量に基づいて所望の濃度で再懸濁します。所望の細胞濃度は、細胞株および脳腫瘍モデルに基づいて変化し得る。GBM GEM TRP細胞の場合、25 x 10⁶ 細胞/ml溶液、または50,000細胞を2 μL注入します。

2.マウス系統

1. 脳腫瘍細胞の株背景に一致する適切なマウス系統を繁殖または購入する。TRP細胞については、9週齢のB6D2F1/Jマウス(C57BL/6J [B6]雌とDBA/2J [D2]雄の交配種由来)を腫瘍細胞レシピエントとして使用します。

3.手術領域の設定

注意: すべての外科的ステップは、清潔で消毒された環境で無菌技術を使用して行われます。スクラブとマスクを含む個人用保護具は、外科医が着用する必要があります。手術器具は使用前に加熱滅菌する必要があります。

1. 固定装置の下と作業面に表面プロテクターを置きます。
2. 麻酔器からのビニールチューブを固定装置のガス麻酔プラットフォームのINポートに取り付け、別のチューブをOUTポートに取り付けます。
3. デジタルディスプレイを電源と装置に接続します。
4. マイクロポンプコントローラ(図1A)を電源に接続し、マイクロポンプ(図1A)を装置のマニピュレータアームに取り付けます(製造元の指示も参照してください)。
5. 2,000 nLの容量注入では、マイクロポンプを5.6 nL/sに設定します。
6. ホットビーズ滅菌器の電源を入れます。
7. マウスの加熱パッドを温度コントローラーに接続し、電源に接続します。プレートをステージプラットフォームに置きます。プレート温度を37°Cに設定します。
8. 30 Gの精密シリンジをバックロードし、気泡が発生しないように注意してください。プランジャーを挿入し、針を取り付けます。針はハブのみでつかんでください。メチルセルロース細胞混合物の滴が針を通して分注されるまでプランジャーを押し下げます。針の側面を注意深く拭くか、滅菌ガーゼパッドを作業台に置いて吸い取り、70%アルコール調製パッドで針を洗浄します。針を曲げたり折ったりしないように注意してください。
9. 精密シリンジをマイクロポンプに取り付け、マニピュレーターアームをステージから離れるように回転させて、マウスをステージに置く前にシリンジと針の変位を防ぎます。

4.手術のためのマウスの準備

1. マウスをイソフルラン気化器を2.5%に設定した誘導チャンバーに置くか、施設のガイドラインに従って麻酔します。ノーズコーンへのイソフルランの流れをオンにします。
2. マウスを定位固定装置に移し、上の歯をノーズコーンサポートに配置して、ノーズコーンに固定します(図1B、9)。ノーズコーンのノブを締めて固定します(図1B)。つま先をつまんで反射をチェックすることにより、適切なレベルの麻酔を確保します。
   1. 耳、足、粘膜の色(ピンク)を監視して、適切な酸素供給を確保します。また、呼吸数を監視します(増減はイソフルランレベルを調整する必要があることを示している可能性があります)。
3. イヤーバー(図1B)を両耳に挿入し、ノブを締めて頭を固定します。
4. マウスが麻酔下にある間に目を滑らかにするために目の軟膏を塗ります。
5. 湾曲した鉗子を使用して、マウスの頭の毛を計画した切開よりも約150%大きい領域まで摘み取り、適切な無菌状態を確保します。
6. 0.5〜1 mg / kgのブプレノルフィンSR鎮痛を皮下注射するか、別のプロトコル承認鎮痛薬を使用します。.
7. マウス直腸プローブを配置して、内部温度を監視し、麻酔による低体温を防ぎます。マウスの体温を36.5〜38.5°Cに保ちます。
8. 外向きの円を使用して手術野を消毒し、外科用スクラブとエタノールを3回交互に使用します。
9. 鉗子を使って皮膚をぴんと張って引っ張り、目の間からメスの刃で約1cmの切開を行います。ブレグマは切開を通して見えるはずです。
   注意: 適切な滅菌技術を得るには、滅菌されたツールの先端でのみ手術部位に触れ、ツールチップを滅菌面(オートクレーブ滅菌されたツールパックの内側など)にのみ置きます。
10. 先端が綿のアプリケーターの木製の端を使用して余分な結合組織をこすり落とし、次に別のアプリケーターの綿の端を使用して乾燥させます。

5.細胞注入

1. シリンジアタッチメントをマウスの上に取り付けた状態でマニピュレータアームを戻し、ノブを締めて固定します。水平面のXノブとYノブを使用して、シリンジマウントをブレグマの上に移動します。Zノブを使用して針を下げ、ブレグマの位置を確認します。デジタル読み出しコンソールをゼロに設定します。
2. XノブとYノブ、および対応するデジタル読み出しを使用して、針を目的の位置に移動します。皮質皮質の位置については、適切な座標は、後方3 mm、ブレグマの外側右2 mm、硬膜から深さ2 mmです。Zノブを使用して、針を頭蓋骨の表面に移動します。
3. 25 Gの針が取り付けられた1 mLの注射器を使用して、頭蓋骨に穴を開けます。針のベベルを30 Gの精密シリンジと針に向けて置き、マニピュレーターアームを慎重に横に回転させます。親指と指を使用して、針先が頭蓋骨のキャップを突き刺すまで、穏やかな圧力で針をゆっくりと前後に転がします。
4. 先端が綿のアプリケーターを使用して、針穴から血液を軽くたたきます。マニピュレーターアームを適切な位置に交換し、穴の上に装填された精密シリンジ針を取り付けます。針の先端を穴に合わせ、Zノブを使用して針を脳硬膜まで下げ、デジタル読み出しコンソールをゼロに設定します。
5. Zノブを使用して、針を1 mm下げてから、1分間待ちます。希望の深さ(示されているように2 mm)に達するまで繰り返します。
   注:針は、周囲の脳組織へのさらなる損傷および細胞溶液の逆流を防ぐためにゆっくりと下げられる。
6. マイクロポンプを起動し、2 μLが注入されたときにポンプが停止することを確認するために監視します。このプロセスには、指定された速度で約6分かかります。次に、針を動かす前に1分間待ちます。

6.針の取り外しと創傷閉鎖

1. 針を1 mm上げてから1分間待ちます。針が頭蓋骨から完全に外れるまで繰り返します。
2. 必要に応じて、先端が綿のアプリケーターを使用して、注射部位から血液を軽くたたきます。
3. 先端が綿のアプリケーターの木の端を使って、骨ワックスの小片(~1 mm)を取り、円錐形にします。頭蓋骨の開口部にそれを置き、ワックスを穴に押し込みます。
4. ビーズ滅菌器を使用して鉗子を加熱し、それらを使用して頭蓋骨に残っているワックスを溶かし、滑らかにします。
5. 約2滴のブピバカイン(麻酔薬)溶液を切開部に入れ、鉗子を使用して皮膚の端を一緒に引っ張ります。
6. 皮膚をぴんと張って引っ張り、1つまたは2つの傷付きクリップを配置して皮膚を閉じます。
7. ドラフトのない場所の加熱パッドの清潔な回復ケージにマウスを置き、マウスを注意深く観察します。マウスが麻酔から完全に目覚め、通常の活動を再開してから、通常のハウジングに戻します。
8. 外科的処置後に毎日マウスをチェックし、施設のガイドラインに従って疼痛管理を行います。
   1. ブプレノルフィンSR(ステップ4.6)が鎮痛に使用される場合、徐放性処方は72時間持続します。72時間後に目に見える痛みや不快感がある場合にのみ注射を繰り返します。正しく実施された場合、マウスは頭蓋内注射から十分に回復し、追加の鎮痛は必要ありません。
   2. 手術後7〜10日でステープルを取り外します。
9. 生きた動物イメージング(MRI)によって腫瘍の成長を監視します。
   1. 人道的なエンドポイントに達したとき(すなわち、動物が20%の体重を失うか、低体温になった場合)にマウスを安楽死させる。
   2. これらの脳腫瘍の浸潤性のために、不均一な歩行、部分的な麻痺、回転、または頭の傾きなどの神経学的症状についてマウスを観察します。進行した腫瘍増殖のこれらの臨床徴候のいずれかが観察された場合は、マウスを安楽死させます。

結果

脳腫瘍細胞を注射したマウスは、発作、運動失調、体重減少などの腫瘍増殖の兆候がないか毎日監視する必要があります。脳腫瘍の成長は、定期的にMRIスキャンによって監視することもできます。毎週のMRIスキャンにより、脳内の腫瘍量の増加と腫瘍体積の測定を視覚化できます(図1C)。特にTRP腫瘍は積極的な増殖を示し、3D腫瘍体積は頭蓋内注射後2〜3週間以内にMRIで?...

ディスカッション

前臨床モデルは、多形性神経膠芽腫における新しい治療標的および新規治療戦略の評価に不可欠である。GBMの遺伝子改変マウスモデルは、自生部位に腫瘍が発生するという利点がありますが、多くの場合、潜伏期間が長く、腫瘍の成長が予測できません¹³。GEMモデル腫瘍は4〜5か月の潜伏期を示し、イメージング、リクルートメント、および治療の理想的な時間枠は個々のマ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T