Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches orthotopes Mausmodell für GBM, das durch intrakranielle Injektion von Zellen aus gentechnisch veränderten Mausmodelltumoren etabliert wurde. Dieses Modell zeigt die Krankheitsmerkmale des humanen GBM. Für translationale Studien wird der Hirntumor der Maus mittels In-vivo-MRT und Histopathologie verfolgt.

Zusammenfassung

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) für humanes Glioblastoma multiforme (GBM) sind entscheidend für das Verständnis der Entstehung und des Fortschreitens von Hirntumoren. Im Gegensatz zu Xenograft-Tumoren entstehen Tumore bei GEMs in der nativen Mikroumgebung einer immunkompetenten Maus. Der Einsatz von GBM-GEMs in präklinischen Behandlungsstudien ist jedoch aufgrund der langen Tumorlatenzen, der Heterogenität der Neoplasienhäufigkeit und des Zeitpunkts der Tumorentwicklung im fortgeschrittenen Grad eine Herausforderung. Mäuse, die durch intrakranielle orthotope Injektion induziert wurden, sind für präklinische Studien besser handhabbar und behalten Merkmale der GEM-Tumore bei. Wir generierten ein orthotopes Hirntumormodell, das aus einem GEM-Modell mit Rb-, Kras- und p53-Aberrationen (TRP) abgeleitet wurde und GBM-Tumore entwickelt, die lineare Nekroseherde durch neoplastische Zellen und eine dichte Vaskularisation analog zu humanem GBM aufweisen. Zellen, die von GEM-GBM-Tumoren abgeleitet sind, werden intrakraniell in Wildtyp-Empfängermäuse injiziert und reproduzieren Tumore des Typs IV, wodurch die lange Tumorlatenzzeit in GEM-Mäusen umgangen wird und die Erstellung großer und reproduzierbarer Kohorten für präklinische Studien ermöglicht wird. Die hochproliferativen, invasiven und vaskulären Merkmale des TRP-GEM-Modells für GBM werden in den orthotopen Tumoren rekapituliert, und histopathologische Marker spiegeln humane GBM-Subgruppen wider. Das Tumorwachstum wird durch serielle MRT-Scans überwacht. Aufgrund des invasiven Charakters der intrakraniellen Tumoren in immunkompetenten Modellen ist eine sorgfältige Einhaltung des hier beschriebenen Injektionsverfahrens unerlässlich, um ein extrakranielles Tumorwachstum zu verhindern.

Einleitung

Das Glioblastom (GBM; Gliom Grad IV) ist der häufigste und bösartigste Hirntumor, und die derzeitigen Therapien sind unwirksam, was zu einer medianen Überlebenszeit von 15 Monaten führt¹. Zuverlässige und genaue präklinische Modelle, die die komplexen Signalwege darstellen, die am Wachstum und der Pathogenese von Hirntumoren beteiligt sind, sind unerlässlich, um den Fortschritt bei der Bewertung neuer Therapieschemata für GBM zu beschleunigen. Mausmodelle, in denen humane Hirntumorzelllinien subkutan in immungeschwächte Mäuse implantiert werden, spiegeln weder die native Immunumgebung von Hirntumoren wider, noch können sie verwendet werden, um die Fähigkeit von Therapeutika zu bewerten, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden². Idealerweise sollten präklinische Mausmodelle auch die humane GBM-Histopathologie genau reproduzieren, einschließlich der hohen Invasivität in das umgebende Parenchym³. Obwohl gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) Tumore im Kontext eines intakten Immunsystems entwickeln, sind oft komplizierte Zuchtschemata erforderlich, und Tumore können sich langsam und uneinheitlich entwickeln⁴. GEM-abgeleitete Allotransplantatmodelle eignen sich besser für präklinische therapeutische Studien, bei denen große Kohorten von tumortragenden Mäusen in kürzerer Zeit benötigt werden.

In einem früheren Bericht haben wir ein orthotopes GBM-Mausmodell beschrieben, das direkt von GEM-Tumoren abgeleitet wurde. Die Tumorgenese im GEM wird durch genetische Ereignisse in Zellpopulationen (hauptsächlich Astrozyten) initiiert, die das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) exprimieren und zu einer Progression zu GBM führen. Diese TRP-GEMs beherbergen ein TgGZT121-Transgen (T), das T121 nach Exposition gegenüber der GFAP-getriebenen Cre-Rekombinase exprimiert. Die Expression des T121-Proteins führt zu einer Unterdrückung der Aktivität des Rb-Proteins (Rb1, p107 und p103). Die Co-Expression eines GFAP-getriebenen Cre-Transgens (GFAP-CreERT2) zielt auf die Expression adulter Astrozyten nach Induktion mit Tamoxifen ab. TRP-Mäuse beherbergen auch eine Cre-abhängige Mutante Kras (Kras^G12D; R)-Allel, das die Aktivierung des Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwegs darstellt, und sind heterozygot für den Verlust von Pten(P)^5,6. Gleichzeitige Genaberrationen in den Netzwerken Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), PI3K und RB sind an 74% der GBM-Pathogenese beteiligt⁷. Daher werden die primären Signalwege, die im humanen GBM verändert sind, durch die manipulierten Mutationen in TRP-Mäusen, insbesondere GBM-Tumoren, repräsentiert, in denen gemeinsame nachgeschaltete Ziele von RTKs aktiviert werden⁵.

Das von GEM abgeleitete syngene orthotope Modell wurde als ein Modell validiert, das Merkmale menschlicher Hirntumore, einschließlich der Invasivität und des Vorhandenseins von Subtyp-Biomarkern, rekapituliert, um als Plattform für die Evaluierung von Krebstherapeutika zu dienen, die auf abweichende Signalwege bei GBM abzielen. Die Zellen wurden aus Tumoren kultiviert, die aus TRP-Gehirnen entnommen und mit stereotaktischen Geräten zur intrakraniellen Injektion in den Kortex wieder in das Gehirn von Mäusen implantiert wurden, die mit dem Stamm verglichen wurden. Dieses präklinische orthotope Mausmodell entwickelte GBM-Tumoren, die hochzellig, invasiv, pleomorph mit einer hohen Mitoserate waren und lineare Nekroseherde durch neoplastische Zellen und eine dichte Vaskularisation aufwiesen, wie sie für humanes GBM beobachtet wurden. Das Tumorvolumen und -wachstum wurde mittels in vivo Magnetresonanztomographie (MRT) gemessen.

In diesem Bericht beschreiben wir am Beispiel von TRP-Tumoren die optimale Technik für die intrakranielle Injektion von primären GBM-Zellen oder Zelllinien in das Wildtyp-Mäusegehirn. Das gleiche Protokoll könnte für immungeschwächte Mäuse und andere GBM-Zelllinien angepasst werden. Es werden wichtige Tipps gegeben, um häufige Fallstricke wie suboptimale Zellpräparation oder Zellleckage an der Injektionsstelle zu vermeiden und die stereotaktische Ausrüstung richtig einzusetzen, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit des Modells zu gewährleisten. Zu translationalen Zwecken validieren wir das Modell durch MRT-Detektion des Hirntumorwachstums bei lebenden Tieren, histologische Charakterisierung und präsentieren ein Beispiel für die Behandlung in tumortragenden Mäusen.

Protokoll

Das hier beschriebene Studienprotokoll wurde vom NCI des Frederick Animal Care and Use Committee genehmigt. NCI-Frederick ist von AAALAC International akkreditiert und befolgt die Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Verfahren, die im "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).

1. Vorbereitung der Zellen für die Injektion

HINWEIS: Die für dieses Modell verwendeten Hirntumor-Primärzellen (MBRs) der Maus wurden ursprünglich aus Tamoxifen-induzierten TRP-GEM-Mäusen isoliert, wie in El Meskini et ^al.5 beschrieben. Details zur Zellpräparation finden Sie in dieser Referenz.

1. Führen Sie die folgenden Schritte mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durch.
2. Kultur von primären Hirntumorzellen in vitro , bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichen.
3. Ernten Sie die Zellen in 0,25% Trypsin, und sobald sie sich gelöst haben, verdünnen Sie sie mit Wachstumsmedium, um das Trypsin zu inaktivieren.
4. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g und waschen Sie sie mit serumfreien Medien. Wiederholen Sie dies einmal, bevor Sie zählen.
5. Zählen Sie die Zellen manuell oder mit einem automatischen Zellzähler. Resuspendieren Sie die Zellen in 5%iger steriler Methylcellulose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in der gewünschten Konzentration, basierend auf einem endgültigen Injektionsvolumen von 2 μl. Die gewünschte Zellkonzentration kann je nach Zelllinie und Hirntumormodell variieren. Für GBM GEM TRP-Zellen injizieren wir 2 μl einer 25 x 10^6-Zellen /ml-Lösung oder 50.000 Zellen.

2. Mäusestamm

1. Züchten oder kaufen Sie einen geeigneten Mausstamm, der dem Stammhintergrund der Hirntumorzellen entspricht. Verwenden Sie für TRP-Zellen 9 Wochen alte B6D2F1/J-Mäuse (aus einer Kreuzung zwischen C57BL/6J [B6]-Weibchen und DBA/2J [D2]-Männchen) als Tumorzellempfänger.

3. Einrichten des Operationsbereichs

HINWEIS: Alle chirurgischen Schritte werden mit aseptischer Technik in einer sauberen, desinfizierten Umgebung durchgeführt. Peelings und persönliche Schutzausrüstung, einschließlich einer Maske, sollten vom Chirurgen getragen werden. Chirurgische Instrumente müssen vor der Verwendung hitzesterilisiert werden.

1. Platzieren Sie den Oberflächenschutz unter dem stereotaktischen Gerät und auf der Arbeitsfläche.
2. Befestigen Sie den Vinylschlauch des Anästhesiegeräts am IN-Anschluss der Gasanästhesieplattform des stereotaktischen Geräts und einen weiteren Schlauch am OUT-Anschluss.
3. Schließen Sie die Digitalanzeige an eine Stromquelle und an das Gerät an.
4. Schließen Sie die Mikropumpensteuerung (Abbildung 1A) an eine Stromquelle an und schließen Sie die Mikropumpe (Abbildung 1A) an den Manipulatorarm des Geräts an (siehe auch Herstelleranweisungen).
5. Stellen Sie die Mikropumpe für die Volumeninjektion von 2.000 nL auf 5,6 nL/s ein.
6. Schalten Sie den Heißperlensterilisator ein.
7. Schließen Sie das Mausheizkissen an den Temperaturregler an und schließen Sie es an eine Stromquelle an. Stellen Sie den Teller auf das Bühnenpodest. Stellen Sie die Plattentemperatur auf 37 °C ein.
8. Legen Sie eine 30-g-Präzisionsspritze zurück und achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Setzen Sie den Kolben ein und befestigen Sie die Nadel. Achten Sie darauf, die Nadel nur an der Nabe zu fassen. Drücken Sie den Kolben, bis ein Tropfen der Methylcellulose-Zellmischung durch die Nadel abgegeben wird. Reinigen Sie die Nadel mit einem Vorbereitungspad mit 70 % Alkohol, indem Sie die Seiten der Nadel vorsichtig abwischen oder ein steriles Mullkissen auf die Arbeitsfläche legen und abtupfen. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu verbiegen oder zu brechen.
9. Befestigen Sie die Präzisionsspritze an der Mikropumpe und drehen Sie den Manipulatorarm vom Tisch weg, um ein Verschieben der Spritzennadel zu verhindern, bevor Sie die Maus auf den Tisch setzen.

4. Vorbereitung der Maus auf die Operation

1. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in die Induktionskammer legen, wobei der Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % eingestellt ist, oder gemäß den institutionellen Richtlinien. Schalten Sie den Isofluranfluss zum Nasenkegel ein.
2. Setzen Sie die Maus in die stereotaktische Apparatur ein und befestigen Sie sie am Nasenkegel, wobei die oberen Zähne auf der Nasenkonusstütze positioniert werden (Abbildung 1B, 9). Ziehen Sie den Knopf am Nasenkonus fest, um ihn zu befestigen (Abbildung 1B). Stellen Sie ein angemessenes Maß an Anästhesie sicher, indem Sie einen Zehenkneifen durchführen, um den Reflex zu überprüfen.
   1. Überwachen Sie die Ohren, Füße und Schleimhäute auf Farbe (rosa), um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Überwachen Sie auch die Atemfrequenz (ein Anstieg oder eine Abnahme könnte darauf hindeuten, dass der Isofluranspiegel angepasst werden muss).
3. Setzen Sie die Ohrbügel (Abbildung 1B) in beide Ohren ein und ziehen Sie den Knopf fest, um den Kopf zu sichern.
4. Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen zu befeuchten, während die Maus unter Narkose steht.
5. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Haare auf dem Kopf der Maus auf einen Bereich zu zupfen, der etwa 150 % größer ist als der geplante Schnitt, um ausreichende aseptische Bedingungen zu gewährleisten.
6. Injizieren Sie 0,5-1 mg/kg Buprenorphin SR-Analgesie subkutan oder verwenden Sie ein anderes im Protokoll zugelassenes Analgetikum.
7. Positionieren Sie die Rektalsonde der Maus, um die Innentemperatur zu überwachen und eine Unterkühlung aufgrund der Anästhesie zu verhindern. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus zwischen 36,5 und 38,5 °C.
8. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit nach außen gerichteten Kreisen und wechseln Sie dreimal zwischen einem chirurgischen Peeling und Ethanol.
9. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette straff und machen Sie mit der Skalpellklinge einen Schnitt von ca. 1 cm, beginnend zwischen den Augen. Das Bregma sollte durch den Schnitt sichtbar sein.
   Anmerkungen: Berühren Sie die Operationsstelle für eine ordnungsgemäße sterile Technik nur mit den Spitzen sterilisierter Werkzeuge und legen Sie die Werkzeugspitzen nur auf eine sterile Oberfläche (z. B. das Innere eines autoklavierten Werkzeugpakets).
10. Verwenden Sie das hölzerne Ende des Applikators mit Wattespitze, um überschüssiges Bindegewebe abzukratzen, und dann das Baumwollende eines anderen Applikators zum Trocknen.

5. Zellinjektion

1. Ziehen Sie den Manipulatorarm mit dem Spritzenaufsatz über die Maus und ziehen Sie den Knopf fest, um ihn zu sichern. Verwenden Sie die X- und Y-Knöpfe in der horizontalen Ebene, um die Spritzenhalterung über Bremma zu bewegen. Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf ab, um die Bregma-Position zu bestätigen. Stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null.
2. Verwenden Sie die X- und Y-Knöpfe und die entsprechende Digitalanzeige, um die Nadel in die gewünschte Position zu bringen. Für die Lage der kortikalen Rinde sind die entsprechenden Koordinaten 3 mm posterior, 2 mm lateral rechts von der Bremma und 2 mm tief von der Dura mater. Verwenden Sie den Z-Knopf, um die Nadel auf die Oberfläche des Schädels zu bewegen.
3. Punktieren Sie ein Loch in den Schädel mit einer 1-ml-Spritze und einer angebrachten 25-G-Nadel. Setzen Sie die Abschrägung der Nadel in Richtung der 30-G-Präzisionsspritze und -nadel und drehen Sie den Manipulatorarm vorsichtig zur Seite. Rollen Sie die Nadel mit Daumen und Finger langsam und mit leichtem Druck hin und her, bis die Nadelspitze gerade noch die Schädeldecke durchsticht.
4. Verwenden Sie einen Applikator mit Wattestäbchenspitze, um jegliches Blut aus dem Nadelloch abzutupfen. Bringen Sie den Manipulatorarm wieder in die entsprechende Position, wobei sich die Präzisionsspritzennadel über dem Loch befindet. Richten Sie die Nadelspitze am Loch aus, senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf auf die Gehirndura ab und stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null.
5. Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf um 1 mm ab und warten Sie dann 1 Minute. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Tiefe erreicht ist (2 mm wie angegeben).
   Anmerkungen: Die Nadel wird langsam abgesenkt, um eine zusätzliche Schädigung des umgebenden Hirngewebes und einen Rückfluss der Zelllösung zu vermeiden.
6. Starten Sie die Mikropumpe und überwachen Sie dann, ob die Pumpe stoppt, wenn 2 μl injiziert wurden. Dieser Vorgang sollte bei der angegebenen Geschwindigkeit etwa 6 Minuten dauern. Warten Sie dann 1 Minute, bevor Sie die Nadel bewegen.

6. Entfernen der Nadel und Wundverschluss

1. Heben Sie die Nadel 1 mm an und warten Sie dann 1 Min. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Nadel vollständig frei vom Schädel ist.
2. Verwenden Sie bei Bedarf einen Applikator mit Wattespitze, um Blut von der Injektionsstelle wegzutupfen.
3. Nehmen Sie mit dem hölzernen Ende eines Applikators mit Wattestäbchen ein kleines Stück Knochenwachs (~1 mm) und formen Sie es zu einem Kegel. Setze es in die Öffnung im Schädel ein und drücke das Wachs in das Loch.
4. Erhitzen Sie die Pinzette mit einem Perlensterilisator und verwenden Sie sie, um das restliche Wachs auf dem Schädel zu schmelzen und zu glätten.
5. Geben Sie etwa zwei Tropfen Bupivacain-Lösung (Anästhesie) in den Schnitt und ziehen Sie die Hautränder mit einer Pinzette zusammen.
6. Ziehen Sie die Haut straff und platzieren Sie ein oder zwei Wundclips, um die Haut zu schließen.
7. Legen Sie die Maus in einen sauberen Erholungskäfig auf einem Heizkissen in einem zugfreien Bereich und beobachten Sie die Maus genau. Lassen Sie die Maus vollständig aus der Narkose aufwachen und ihre normale Aktivität wieder aufnehmen, bevor Sie sie wieder in die normale Unterbringung zurückbringen.
8. Kontrollieren Sie die Maus täglich nach dem chirurgischen Eingriff und führen Sie eine Schmerzbehandlung gemäß den institutionellen Richtlinien durch.
   1. Wenn Buprenorphin SR (Schritt 4.6) zur Analgesie verwendet wird, hält die Retardformel 72 h an. Wiederholen Sie die Injektion nur, wenn nach 72 h sichtbare Schmerzen oder Beschwerden vorhanden sind. Bei korrekter Durchführung erholen sich die Mäuse gut von den intrakraniellen Injektionen und eine zusätzliche Analgesie ist nicht erforderlich.
   2. Entfernen Sie die Klammern 7-10 Tage nach der Operation.
9. Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Bildgebung von Tieren (MRT).
   1. Einschläfern Sie die Mäuse ein, wenn humane Endpunkte erreicht sind (d. h. wenn das Tier 20 % Körpergewicht verliert oder unterkühlt wird).
   2. Aufgrund der invasiven Natur dieser Hirntumore sollten die Mäuse auf neurologische Symptome wie ungleichmäßiger Gang, teilweise Lähmung, Drehen oder Kopfneigung beobachtet werden. Euthanasieren Sie eine Maus, wenn eines dieser klinischen Anzeichen eines fortgeschrittenen Tumorwachstums beobachtet wird.

Ergebnisse

Mäuse, denen Hirntumorzellen injiziert wurden, sollten täglich auf Anzeichen von Tumorwachstum wie Krampfanfälle, Ataxie oder Gewichtsverlust überwacht werden. Das Wachstum von Hirntumoren kann auch durch MRT-Untersuchungen in regelmäßigen Abständen überwacht werden. Wöchentliche MRT-Scans ermöglichen die Visualisierung der zunehmenden Tumorlast im Gehirn und der Tumorvolumenmessungen (Abbildung 1C). Insbesondere TRP-Tumoren weisen ein aggressives Wachstum auf, und 3D-Tumorvolumina...

Diskussion

Präklinische Modelle sind essentiell für die Evaluierung neuer therapeutischer Zielstrukturen und neuartiger Behandlungsstrategien bei GBM. Gentechnisch veränderte Mausmodelle für GBM haben den Vorteil, dass Tumore an der autochthonen Stelle auftreten, aber oft mit einer langen Latenz und einem unvorhersehbaren Tumorwachstum¹³. Die Tumore des GEM-Modells weisen eine Latenz von 4-5 Monaten auf, und das ideale Zeitfenster für Bildgebung, Rekrutierung und Behandlung ist zwischen den einzelnen M?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T