מודלים אורתוטופיים תרגומיים של גליובלסטומה מולטיפורמה

Summary

במאמר זה אנו מתארים מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני עבור GBM, שהוקם על ידי הזרקה תוך-גולגולתית של תאים שמקורם בגידולי מודל עכבר מהונדסים גנטית. מודל זה מציג את סימני ההיכר של המחלה של GBM אנושי. עבור מחקרים תרגומיים, הגידול במוח העכבר נמצא במעקב על ידי MRI in vivo והיסטופתולוגיה.

Abstract

מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) עבור גליובלסטומה מולטיפורמה אנושית (GBM) הם קריטיים להבנת ההתפתחות וההתקדמות של גידולי מוח. שלא כמו גידולי xenograft, ב- GEMs, גידולים מתעוררים במיקרו-סביבה הטבעית בעכבר כשיר חיסון. עם זאת, השימוש ב- GBM GEMs במחקרי טיפול פרה-קליניים מאתגר בשל השהיות ארוכות של גידולים, הטרוגניות בתדירות הניאופלזמה ועיתוי התפתחות הגידול בדרגה מתקדמת. עכברים המושרים באמצעות הזרקה אורתוטופית תוך גולגולתית ניתנים יותר למחקרים פרה-קליניים, ושומרים על מאפיינים של גידולי GEM. יצרנו מודל גידול מוח אורתוטופי הנגזר ממודל GEM עם סטיות Rb, Kras ו-p53 (TRP), המפתח גידולי GBM המציגים מוקדים ליניאריים של נמק על ידי תאים ניאופלסטיים, וכלי דם צפופים המקבילים ל-GBM אנושי. תאים שמקורם בגידולי GBM מסוג GEM מוזרקים תוך גולגולתית לעכברים מושתלים מסוג בר ומותאמים לזנים ומרבים גידולים בדרגה IV, ובכך עוקפים את תקופת החביון הארוכה של הגידול בעכברי GEM ומאפשרים יצירת קבוצות גדולות וניתנות לשחזור למחקרים פרה-קליניים. המאפיינים הרבים, החודרניים וכלי הדם של מודל TRP GEM עבור GBM משוחזרים בגידולים האורתוטופיים, וסמנים היסטופתולוגיים משקפים תת-קבוצות GBM אנושיות. צמיחת הגידול מנוטרת על ידי סריקות MRI סדרתיות. בשל האופי הפולשני של גידולים תוך גולגולתיים במודלים חיסוניים, מעקב קפדני אחר הליך ההזרקה המתואר כאן חיוני למניעת צמיחת גידול מחוץ לגולגולת.

Introduction

גליובלסטומה (GBM; גליומה דרגה IV) היא הגידול השכיח והממאיר ביותר במוח, והטיפולים הנוכחיים אינם יעילים, וכתוצאה מכך הישרדות חציונית של 15 חודשים¹. מודלים פרה-קליניים אמינים ומדויקים המייצגים את מסלולי האיתות המורכבים המעורבים בצמיחת גידולי מוח ופתוגנזה חיוניים כדי לזרז את ההתקדמות בהערכת משטרים טיפוליים חדשים עבור GBM. מודלים עכבריים שבהם שורות תאי גידול במוח האנושי מושתלים באופן תת-עורי בעכברים מדוכאי חיסון אינם משקפים את הסביבה החיסונית הטבעית של גידולי מוח, וגם לא ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את יכולתם של טיפולים לחצות את מחסום הדם-מוח². באופן אידיאלי, מודלים פרה-קליניים של עכברים צריכים גם לשחזר מקרוב את ההיסטופתולוגיה האנושית של GBM, כולל הרמה הגבוהה של פולשניות לתוך פרנכימה³ שמסביב. למרות שמודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) מפתחים גידולים בהקשר של מערכת חיסון שלמה, לעתים קרובות נדרשות תוכניות רבייה מסובכות, וגידולים עלולים להתפתח לאט ולא באופן עקבי⁴. מודלים של אלוגרפט שמקורם ב-GEM מתאימים יותר למחקרים טיפוליים פרה-קליניים, שבהם יש צורך בקבוצות גדולות של עכברים נושאי גידול במסגרת זמן קצרה יותר.

בדו"ח קודם, תיארנו מודל עכבר GBM אורתוטופי הנגזר ישירות מגידולי GEM. גידולים ב-GEM נובעים מאירועים גנטיים באוכלוסיות תאים (בעיקר אסטרוציטים) המבטאים חלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), הגורמים להתקדמות לגליובלסטומה. אבני חן TRP אלה מכילות טרנסגן TgGZT121 (T), המבטא T121 לאחר חשיפה לרקומבינאז Cre מונע GFAP. ביטוי חלבון T121 גורם לדיכוי פעילות החלבון Rb (Rb1, p107 ו-p103). ביטוי משותף של טרנסגן Cre מונע GFAP (GFAP-CreERT2) מכוון ביטוי לאסטרוציטים בוגרים לאחר השראת טמוקסיפן. עכברי TRP מחזיקים גם בקראס מוטנטי תלוי Cre (Kras^G12D; R) אלל, המייצגים הפעלה של מסלול הקולטן טירוזין קינאז, והם הטרוזיגוטיים לאובדן Pten (P)^5,6. סטיות גנים מקבילות ברשתות הקולטן טירוזין קינאז (RTK), PI3K ו-RB מעורבות ב-74% מפתוגנזה⁷ של GBM. לכן, מסלולי האיתות העיקריים שהשתנו בגליובלסטומה אנושית מיוצגים על ידי המוטציות המהונדסות בעכברי TRP, במיוחד גידולי GBM, שבהם מופעלות מטרות משותפות במורד הזרם של RTK⁵.

המודל האורתוטופי הסינגני שמקורו ב-GEM אומת כמודל המשחזר מאפיינים של גידולי מוח אנושיים, כולל פולשניות ונוכחות של סמנים ביולוגיים תת-סוגיים, לשימוש כפלטפורמה להערכת טיפולים בסרטן המתמקדים במסלולים חריגים בגליובלסטומה. תאים גודלו בתרבית מגידולים שנקצרו ממוחות TRP והושתלו מחדש במוחם של עכברים מותאמי זן, תוך שימוש בציוד סטריאוטקטי להזרקה תוך גולגולתית בקליפת המוח. מודל עכבר אורתוטופי פרה-קליני זה פיתח גידולי GBM שהיו תאיים מאוד, פולשניים, פלאומורפיים עם קצב מיטוטי גבוה, והציגו מוקדים ליניאריים של נמק על ידי תאים ניאופלסטיים וכלי דם צפופים, כפי שנצפה עבור GBM אנושי. נפחי הגידול וצמיחתו נמדדו על ידי דימות תהודה מגנטית in vivo (MRI).

בדו"ח זה, אנו מתארים את הטכניקה האופטימלית להזרקה תוך גולגולתית של תאי GBM ראשוניים או קווי תאים לתוך מוח עכבר מסוג פראי, תוך שימוש בגידולי TRP כדוגמה. אותו פרוטוקול עשוי להיות מותאם לעכברים מדוכאי חיסון ולקווי תאים אחרים של GBM. טיפים חיוניים ניתנים למניעת מלכודות נפוצות, כגון הכנת תאים תת-אופטימלית או דליפת תאים באתר ההזרקה, ולשימוש נכון בציוד הסטריאוטקטי כדי להבטיח שחזור ואמינות של המודל. למטרות תרגומיות, אנו מאמתים את המודל על ידי זיהוי MRI של גידול גידולי מוח בבעלי חיים חיים, אפיון היסטולוגי, ומציגים דוגמה לטיפול בעכברים נושאי גידול.

Protocol

פרוטוקול המחקר המתואר כאן אושר על ידי NCI בוועדת פרדריק לטיפול ושימוש בבעלי חיים. NCI-Frederick מוכר על ידי AAALAC International ועוקב אחר מדיניות שירותי בריאות הציבור לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הטיפול בבעלי חיים ניתן בהתאם לנהלים המפורטים ב"מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המועצה הלאומית למחקר, 2011; The National Academies Press, וושינגטון די.סי).

1. הכנת תאים להזרקה

הערה: תאים ראשוניים של גידול במוח עכבר (MBR) ששימשו למודל זה בודדו במקור מעכברי TRP GEM המושרים על ידי טמוקסיפן, כמתואר ב- El Meskini et ^al.5. פרטים על הכנת התא ניתן למצוא בהפניה זו.

1. בצע את השלבים הבאים בטכניקה סטרילית בארון בטיחות ביולוגית.
2. תרבית תאי גידול ראשוניים במוח במבחנה עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה המעריכי.
3. קצרו את התאים ב -0.25% טריפסין, ולאחר שהם התנתקו, דללו אותם עם מדיום צמיחה כדי להשבית את הטריפסין.
4. משחררים את התאים בצנטריפוגה ב 400 x גרם ושוטפים עם מדיה ללא סרום. יש לחזור על הפעולה פעם אחת לפני הספירה.
5. ספור את התאים באופן ידני או באמצעות מונה תאים אוטומטי. להשהות מחדש את התאים במתילצלולוז סטרילי 5% במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) בריכוז הרצוי, בהתבסס על נפח הזרקה סופי של 2 μL. ריכוז התאים הרצוי עשוי להשתנות בהתאם לקו התא ולמודל הגידול במוח. עבור תאי GBM GEM TRP, אנו מזריקים 2 μL של תמיסת 25 x 10⁶ תאים/מ"ל, או 50,000 תאים.

2. מתח עכבר

1. לגדל או לרכוש זן עכבר מתאים התואם את רקע הזן של תאי הגידול במוח. עבור תאי TRP, השתמש בעכברי B6D2F1/J בני 9 שבועות (מהכלאה בין נקבות C57BL/6J [B6] וזכרי DBA/2J [D2]) כמושתלי תאים סרטניים.

3. הקמת אזור הניתוח

הערה: כל שלבי הניתוח מתבצעים בטכניקה אספטית בסביבה נקייה ומחוטאת. פילינג וציוד מגן אישי, כולל מסכה, צריכים להילבש על ידי המנתח. כלי ניתוח חייבים להיות מעוקרים בחום לפני השימוש.

1. הניחו את מגיני המשטחים מתחת למנגנון הסטריאוטקסי ועל משטח העבודה.
2. חבר את צינור הוויניל ממכונת ההרדמה ליציאת IN של פלטפורמת ההרדמה בגז של המנגנון הסטריאוטקסי, וצינור נוסף ליציאת Out.
3. חבר את הצג הדיגיטלי למקור חשמל ולמנגנון.
4. חברו את בקר המיקרו-משאבה (איור 1A) למקור חשמל וחברו את המיקרו-משאבה (איור 1A) לזרוע המניפולטורית של המכשיר (ראו גם הוראות היצרן).
5. הגדר את המיקרו-משאבה ל- 5.6 nL/s עבור הזרקת נפח של 2,000 nL.
6. הפעל את מעקר החרוזים החם.
7. חבר את כרית החימום של העכבר לבקר הטמפרטורה וחבר למקור חשמל. מניחים את הצלחת על במת הבמה. כוונו את טמפרטורת הצלחת ל-37°C.
8. טען בחזרה מזרק מדויק 30 גרם, נזהר לא להכניס בועות. הכנס את הבוכנה וחבר את המחט. הקפד לאחוז את המחט על ידי הרכזת בלבד. לחץ על הבוכנה עד שטיפה של תערובת תאי מתילצלולוז יוצאת דרך המחט. נקו את המחט עם פד להכנת אלכוהול 70% על ידי ניגוב זהיר של דפנות המחט, או על ידי הנחת פד גזה סטרילי על משטח העבודה והכתמתו. היזהר לא לכופף או לשבור את המחט.
9. חבר את המזרק המדויק למיקרו-משאבה וסובב את זרוע המניפולטור הרחק מהבמה, כדי למנוע תזוזה של מחט המזרק לפני הנחת העכבר על הבמה.

4. הכנת העכבר לניתוח

1. הרדימו את העכבר על ידי הכנסתו לתא האינדוקציה עם וופורייזר איזופלורן המוגדר ל -2.5%, או על פי הנחיות מוסדיות. הפעל את זרימת האיזופלורן אל חרוט האף.
2. העבירו את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי והצמידו אותו לקונוס האף, כשהשיניים העליונות ממוקמות על תמיכת חרוט האף (איור 1B, 9). הדקו את הידית על חרוט האף כדי לאבטח (איור 1B). ודא רמה מתאימה של הרדמה על ידי ביצוע צביטת בוהן כדי לבדוק רפלקס.
   1. עקוב אחר צבע האוזניים, כפות הרגליים והריריות (ורוד) כדי להבטיח חמצון הולם. כמו כן, לפקח על קצב הנשימה (עלייה או ירידה יכולה להצביע על הצורך להתאים את רמות isoflurane).
3. הכניסו מוטות אוזניים (איור 1B) לשתי האוזניים והדקו את הידית כדי לאבטח את הראש.
4. החל משחת עיניים כדי לשמן את העיניים בזמן העכבר תחת הרדמה.
5. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי למרוט את השיער על ראשו של העכבר לאזור גדול בכ -150% מהחתך המתוכנן, כדי להבטיח תנאים אספטיים נאותים.
6. הזריקו 0.5-1 מ"ג/ק"ג buprenorphine SR analgesia תת עורית, או השתמשו במשכך כאבים אחר שאושר על ידי פרוטוקול.
7. מקם את הבדיקה הרקטלית של העכבר כדי לפקח על הטמפרטורה הפנימית ולמנוע היפותרמיה עקב הרדמה. שמור על טמפרטורת גוף העכבר בין 36.5 ל 38.5 ° C.
8. לחטא את שדה הניתוח באמצעות עיגולים חיצוניים, לסירוגין בין קרצוף כירורגי אתנול שלוש פעמים.
9. באמצעות מלקחיים כדי למשוך את העור מתוח, לעשות חתך של כ 1 ס"מ עם להב אזמל, החל בין העיניים. הברגמה צריכה להיות גלויה דרך החתך.
   הערה: לטכניקה סטרילית נכונה, גע באתר הניתוח רק עם קצות הכלים המעוקרים, והנח את קצות הכלים על משטח סטרילי בלבד (כגון החלק הפנימי של חבילת כלים אוטומטית).
10. השתמשו בקצה העץ של אפליקטור עם קצוות כותנה כדי לגרד רקמת חיבור עודפת, ולאחר מכן בקצה הכותנה של אפליקטור אחר לייבוש.

5. הזרקת תאים

1. החזר את זרוע המניפולטור עם חיבור המזרק מעל העכבר, הידוק הידית כדי לאבטח. השתמש בידיות X ו- Y במישור האופקי כדי להזיז את תושבת המזרק מעל ברגמה. הורידו את המחט באמצעות ידית Z כדי לאשר את מיקום הברגמה. הגדר את מסוף הקריאה הדיגיטלי לאפס.
2. השתמש בידיות X ו- Y ובקריאה הדיגיטלית המתאימה כדי להזיז את המחט למיקום הרצוי. עבור מיקום קליפת המוח, הקואורדינטות המתאימות הן 3 מ"מ אחורית, 2 מ"מ לרוחב ימינה לברגמה, ועומק 2 מ"מ מהדורה מאטר. השתמש בידית Z כדי להזיז את המחט לפני השטח של הגולגולת.
3. נקב חור בגולגולת באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G מחובר. מניחים את שיפוע המחט לכיוון מזרק ומחט מדויקים 30 G, ובזהירות לסובב את זרוע מניפולטור הצידה. בעזרת האגודל והאצבע, גלגלו את המחט קדימה ואחורה באיטיות ובלחץ עדין עד שקצה המחט פשוט חודר את כובע הגולגולת.
4. השתמש אפליקטור עם קצוות כותנה כדי לטפוח כל דם מחור המחט. החלף את זרוע המניפולטור למיקום המתאים עם מחט מזרק מדויקת טעונה מעל החור. יישרו את קצה המחט עם החור, השתמשו בידית Z כדי להוריד את המחט מטה אל הדורא של המוח, והגדירו את מסוף הקריאה הדיגיטלי לאפס.
5. באמצעות ידית Z, להוריד את המחט 1 מ"מ, ולאחר מכן לחכות 1 דקה. חזור על הפעולה עד לקבלת העומק הרצוי (2 מ"מ כפי שצוין).
   הערה: המחט מונמכת באיטיות כדי למנוע נזק נוסף לרקמת המוח שמסביב ולזרימה האחורית של תמיסת התא.
6. הפעל את המיקרו-משאבה ולאחר מכן עקוב כדי לוודא שהמשאבה מפסיקה כאשר הוזרק 2 מיקרוליטר. תהליך זה אמור להימשך כ -6 דקות במהירות שצוינה. לאחר מכן, המתן דקה לפני הזזת המחט.

6. הסרת המחט וסגירת הפצע

1. הרימו את המחט 1 מ"מ ולאחר מכן המתינו דקה. חזור על הפעולה עד שהמחט נקייה לחלוטין מהגולגולת.
2. במידת הצורך, השתמש במוליך עם קצוות כותנה כדי לטפוח כל דם הרחק מאתר ההזרקה.
3. בעזרת קצה העץ של מוליך כותנה, לוקחים חתיכה קטנה של שעוות עצם (~ 1 מ"מ) ומעצבים אותה לחרוט. מניחים אותו לתוך הפתח בגולגולת, דוחפים את השעווה לתוך החור.
4. מחממים מלקחיים באמצעות מעקר חרוזים ומשתמשים בהם כדי להמיס את שאריות השעווה על הגולגולת ולהחליק אותה.
5. יש לטפטף כשתי טיפות של תמיסת בופיוואקאין (חומר הרדמה) לתוך החתך ולהשתמש במלקחיים כדי למשוך את קצוות העור יחד.
6. משכו את העור מתוח והניחו קליפס פצע אחד או שניים כדי לסגור את העור.
7. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות נקי על כרית חימום באזור ללא טיוטות, והתבוננו בעכבר מקרוב. אפשר לעכבר להתעורר באופן מלא מההרדמה, לחזור לפעילות רגילה, לפני החזרתו לדיור רגיל.
8. בדוק את העכבר מדי יום לאחר ההליך הכירורגי ונהל טיפול בכאב, בהתאם להנחיות המוסדיות.
   1. אם buprenorphine SR (שלב 4.6) משמש לשיכוך כאבים, נוסחת שחרור מושהה נמשכת 72 שעות. חזור על הזריקה רק אם קיים כאב או אי נוחות נראים לעין לאחר 72 שעות. כאשר מבוצע כראוי, העכברים להתאושש היטב מן זריקות תוך גולגולתי ומשככי כאבים נוספים אין צורך.
   2. הסר את הסיכות 7-10 ימים לאחר הניתוח.
9. מעקב אחר צמיחת הגידול על ידי הדמיה חיה של בעלי חיים (MRI).
   1. הרדימו את העכברים כאשר מגיעים לנקודות קצה אנושיות (כלומר, אם בעל החיים מאבד 20% ממשקל גופו או הופך להיפותרמי).
   2. בשל האופי החודרני של גידולי מוח אלה, צפו בעכברים לתסמינים נוירולוגיים, כגון הליכה לא אחידה, שיתוק חלקי, ספינינג או הטיית ראש. הרדימו עכבר אם נצפים אחד מהסימנים הקליניים הללו לצמיחת גידול מתקדם.

תוצאות

עכברים המוזרקים עם תאי גידול במוח צריכים להיות במעקב יומי עבור סימנים של צמיחת הגידול כגון התקפים, אטקסיה, או ירידה במשקל. גידול במוח עשוי להיות מנוטר גם על ידי סריקת MRI במרווחי זמן קבועים. סריקות MRI שבועיות מאפשרות הדמיה של עומס הגידול הגובר במוח ומדידות נפח הגידול (איור 1C). ...

Discussion

מודלים פרה-קליניים חיוניים להערכת מטרות טיפוליות חדשות ואסטרטגיות טיפול חדשניות בגליובלסטומה. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית עבור GBM הם בעלי יתרון של הופעת הגידול באתר האוטוכתוני, אך לעתים קרובות עם חביון ארוך וצמיחת גידול בלתי צפויה¹³. גידולי מודל GEM מציגים שיהוי של 4-5 חודשי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T