Трансляционные ортотопические модели мультиформной глиобластомы

Резюме

Здесь мы описываем доклиническую ортотопическую модель мыши для GBM, созданную путем внутричерепной инъекции клеток, полученных из генетически модифицированных опухолей мыши. Эта модель отображает признаки заболевания ГБМ человека. Для трансляционных исследований опухоль головного мозга мыши отслеживается с помощью МРТ in vivo и гистопатологии.

Аннотация

Генетически модифицированные мышиные модели (GEM) для мультиформной глиобластомы человека (GBM) имеют решающее значение для понимания развития и прогрессирования опухолей головного мозга. В отличие от опухолей ксенотрансплантата, в ГЭУ опухоли возникают в нативном микроокружении у иммунокомпетентной мыши. Тем не менее, использование GBM GEM в доклинических исследованиях лечения является сложной задачей из-за длительных латентных периодов опухоли, гетерогенности частоты новообразований и сроков развития опухоли поздней степени. Мыши, индуцированные с помощью внутричерепной ортотопической инъекции, более пригодны для доклинических исследований и сохраняют черты опухолей GEM. Мы создали ортотопическую модель опухоли головного мозга, полученную из модели GEM с аберрациями Rb, Kras и p53 (TRP), в которой развиваются опухоли GBM, демонстрирующие линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотную васкуляризацию, аналогичную GBM человека. Клетки, полученные из опухолей GEM GBM, вводят внутричерепно мышам-реципиентам дикого типа, соответствующим штамму, и воспроизводят опухоли IV степени, таким образом, обходя длительный латентный период опухоли у мышей GEM и позволяя создавать большие и воспроизводимые когорты для доклинических исследований. Высокопролиферативные, инвазивные и сосудистые особенности модели TRP GEM для GBM повторяются в ортотопических опухолях, а гистопатологические маркеры отражают подгруппы GBM человека. Рост опухоли контролируется серийными МРТ-сканированиями. Из-за инвазивного характера внутричерепных опухолей в иммунокомпетентных моделях тщательное следование описанной здесь процедуре инъекции имеет важное значение для предотвращения роста экстракраниальной опухоли.

Введение

Глиобластома (GBM; глиома IV степени) является наиболее распространенной и злокачественной опухолью головного мозга, и современные методы лечения неэффективны, что приводит к средней выживаемости 15 месяцев¹. Надежные и точные доклинические модели, представляющие сложные сигнальные пути, участвующие в росте и патогенезе опухоли головного мозга, необходимы для ускорения прогресса в оценке новых терапевтических схем для ГБМ. Мышиные модели, в которых линии опухолевых клеток головного мозга человека имплантируются подкожно мышам с ослабленным иммунитетом, не отражают нативную иммунную среду опухолей головного мозга и не могут быть использованы для оценки способности терапевтических средств пересекать гематоэнцефалический барьер². В идеале доклинические мышиные модели должны также точно воспроизводить гистопатологию GBM человека, включая высокий уровень инвазивности в окружающей паренхиме³. Хотя генетически модифицированные модели мышей (GEM) развивают опухоли в контексте интактной иммунной системы, часто требуются сложные схемы разведения, и опухоли могут развиваться медленно и непоследовательно⁴. Модели аллотрансплантатов, полученные из GEM, лучше подходят для доклинических терапевтических исследований, где требуются большие когорты мышей с опухолями в более короткие сроки.

В предыдущем отчете мы описали ортотопическую модель мыши GBM, полученную непосредственно из опухолей GEM. Онкогенез в GEM инициируется генетическими событиями в клеточных популяциях (в первую очередь астроцитах), экспрессирующих глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), которые приводят к прогрессированию до GBM. Эти TRP GEM содержат трансген TgGZT121 (T), который экспрессирует T121 после воздействия рекомбиназы Cre, управляемой GFAP. Экспрессия белка T121 приводит к подавлению активности белка Rb (Rb1, p107 и p103). Совместная экспрессия трансгена Cre, управляемого GFAP (GFAP-CreERT2), нацелена на экспрессию во взрослые астроциты после индукции тамоксифеном. Мыши TRP также являются носителями Cre-зависимого мутанта Kras (Kras^G12D; R) аллель, представляющий собой активацию рецепторного тирозинкиназного пути, и гетерозиготны по потере Pten (P) ^5,6. Одновременные аберрации генов в цепях рецепторной тирозинкиназы (RTK), PI3K и RB участвуют в 74% патогенеза GBM⁷. Таким образом, первичные сигнальные пути, измененные в GBM человека, представлены сконструированными мутациями у мышей TRP, в частности опухолями GBM, в которых активируются общие последующие мишени RTK⁵.

Сингенная ортотопическая модель, полученная из GEM, была проверена как модель, которая повторяет особенности опухолей головного мозга человека, включая инвазивность и наличие биомаркеров подтипа, для использования в качестве платформы для оценки терапии рака, нацеленной на аберрантные пути в GBM. Клетки культивировали из опухолей, собранных из мозга TRP, и повторно имплантировали в мозг мышей, соответствующих штамму, с использованием стереотаксического оборудования для внутричерепной инъекции в кору. В этой доклинической ортотопической мышиной модели были разработаны опухоли GBM, которые были высококлеточными, инвазивными, плеоморфными с высокой частотой митоза и демонстрировали линейные очаги некроза опухолевыми клетками и плотной васкуляризацией, как это наблюдалось для GBM человека. Объемы и рост опухоли измеряли с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) in vivo .

В этом отчете мы описываем оптимальную технику внутричерепной инъекции первичных клеток GBM или клеточных линий в мозг мыши дикого типа, используя опухоли TRP в качестве примера. Тот же протокол может быть адаптирован для мышей с ослабленным иммунитетом и других клеточных линий GBM. Даны важные советы, позволяющие избежать распространенных ошибок, таких как неоптимальная подготовка клеток или утечка клеток в месте инъекции, а также правильное использование стереотаксического оборудования для обеспечения воспроизводимости и надежности модели. В трансляционных целях мы валидируем модель с помощью МРТ-обнаружения роста опухоли головного мозга у живых животных, гистологической характеристики и представляем пример лечения у мышей с опухолями.

протокол

Протокол исследования, описанный здесь, был одобрен NCI в Комитете по уходу за животными и их использованию Фредерика. NCI-Frederick аккредитован AAALAC International и следует Политике службы общественного здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию. Уход за животными осуществлялся в соответствии с процедурами, изложенными в «Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных» (Национальный исследовательский совет, 2011; Издательство Национальной академии, Вашингтон, округ Колумбия).

1. Подготовка клеток к инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные клетки опухоли головного мозга мыши (MBR), используемые для этой модели, были первоначально выделены из мышей TRP GEM, индуцированных тамоксифеном, как описано в El Meskini et ^al.5. Подробную информацию о подготовке клеток можно найти в этом справочнике.

1. Выполните следующие действия, используя стерильную технику в шкафу биобезопасности.
2. Культивируйте первичные опухолевые клетки головного мозга in vitro до тех пор, пока они не достигнут экспоненциальной фазы роста.
3. Соберите клетки в 0,25% трипсина, и после того, как они отсоединились, разбавьте их питательной средой, чтобы инактивировать трипсин.
4. Гранулируйте ячейки центрифугированием в дозе 400 x g и промойте средой, не содержащей сыворотки. Повторите один раз перед подсчетом.
5. Подсчитайте ячейки вручную или с помощью автоматического счетчика ячеек. Ресуспендируют клетки в 5% стерильной метилцеллюлозе в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) в желаемой концентрации, исходя из конечного объема инъекции 2 мкл. Желаемая концентрация клеток может варьироваться в зависимости от клеточной линии и модели опухоли головного мозга. Для клеток GBM GEM TRP мы вводим 2 мкл раствора 25 x 10⁶ клеток/мл или 50 000 клеток.

2. Напряжение мыши

1. Разводите или покупайте подходящий штамм мыши, который соответствует фону штамма опухолевых клеток головного мозга. Для клеток TRP используйте 9-недельных мышей B6D2F1 / J (от скрещивания самок C57BL / 6J [B6] и самцов DBA / 2J [D2]) в качестве реципиентов опухолевых клеток.

3. Настройка хирургической зоны

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические операции проводятся с использованием асептической техники в чистой, продезинфицированной среде. Хирург должен носить скрабы и средства индивидуальной защиты, включая маску. Хирургические инструменты должны быть подвергнуты термической стерилизации перед использованием.

1. Поместите поверхностные протекторы под стереотаксический аппарат и на рабочую поверхность.
2. Прикрепите виниловую трубку от наркозного аппарата к внутреннему порту платформы газовой анестезии стереотаксического аппарата, а другую трубку к выходному порту.
3. Подключите цифровой дисплей к источнику питания и к устройству.
4. Подключите контроллер микронасоса (рис. 1A) к источнику питания и прикрепите микронасос (рис. 1A) к манипулятору аппарата (см. также инструкцию производителя).
5. Установите микронасос на 5.6 нл/с для впрыска объемом 2,000 нл.
6. Включите стерилизатор горячих шариков.
7. Подключите грелку мыши к регулятору температуры и подключите к источнику питания. Поставьте тарелку на сценическую платформу. Установите температуру пластины на 37 °C.
8. Загрузите прецизионный шприц весом 30 г, стараясь не вводить пузырьки. Вставьте поршень и прикрепите иглу. Обязательно держите иглу только за ступицу. Нажимайте на поршень до тех пор, пока капля смеси метилцеллюлозных клеток не пройдет через иглу. Очистите иглу салфеткой с 70% спиртом, тщательно протерев стенки иглы или положив стерильную марлевую салфетку на рабочую поверхность и промокнув ее. Будьте осторожны, чтобы не согнуть и не сломать иглу.
9. Прикрепите прецизионный шприц к микронасосу и поверните руку манипулятора в сторону от сцены, чтобы предотвратить смещение иглы шприца перед размещением мыши на сцене.

4. Подготовка мыши к операции

1. Обезболите мышь, поместив ее в индукционную камеру с испарителем изофлурана, установленным на 2,5%, или в соответствии с руководящими принципами учреждения. Включите подачу изофлурана к носовому обтекателю.
2. Перенесите мышь в стереотаксический аппарат и закрепите на носовом обтекателе, расположив верхние зубы на опоре носового обтекателя (рис. 1B, 9). Затяните ручку на носовом обтекателе, чтобы закрепить (рис. 1B). Обеспечьте надлежащий уровень анестезии, выполнив ущипывание пальца ноги, чтобы проверить рефлекс.
   1. Следите за цветом ушей, ног и слизистых оболочек, чтобы обеспечить адекватное насыщение кислородом. Кроме того, следите за частотой дыхания (увеличение или уменьшение может указывать на необходимость корректировки уровня изофлурана).
3. Вставьте ушные вкладыши (рис. 1B) в оба уха и затяните ручку, чтобы зафиксировать голову.
4. Нанесите глазную мазь для смазывания глаз, пока мышь находится под наркозом.
5. Используйте изогнутые щипцы, чтобы выщипать волосы на голове мыши на площадь, примерно на 150% превышающую запланированный разрез, чтобы обеспечить адекватные асептические условия.
6. Вводите 0,5-1 мг / кг бупренорфина SR анальгезии подкожно или используйте другой одобренный протоколом анальгетик.
7. Расположите ректальный зонд мыши, чтобы контролировать внутреннюю температуру и предотвращать переохлаждение из-за анестезии. Поддерживайте температуру тела мыши от 36,5 до 38,5 °C.
8. Продезинфицируйте операционное поле, используя наружные круги, чередуя хирургический скраб и этанол три раза.
9. Используя щипцы, чтобы натянуть кожу, сделайте надрез примерно в 1 см лезвием скальпеля, начиная между глазами. Брегма должна быть видна через разрез.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной стерильной техники прикасайтесь к месту операции только кончиками стерилизованных инструментов и кладите кончики инструментов только на стерильную поверхность (например, на внутреннюю часть автоклавного набора инструментов).
10. Используйте деревянный конец аппликатора с ватным наконечником, чтобы соскрести лишнюю соединительную ткань, а затем ватный конец другого аппликатора для высыхания.

5. Инъекция клеток

1. Верните руку манипулятора с насадкой шприца на мышь, затянув ручку для фиксации. Используйте ручки X и Y в горизонтальной плоскости, чтобы переместить крепление шприца над брегмой. Опустите иглу с помощью Z-образной ручки, чтобы подтвердить положение брегмы. Установите консоль цифрового считывания на ноль.
2. Используйте ручки X и Y и соответствующие цифровые показания, чтобы переместить стрелку в нужное положение. Для расположения корковой коры соответствующие координаты: 3 мм назад, 2 мм сбоку от брегмы и 2 мм вглубь твердой мозговой оболочки. Используйте Z-образную ручку, чтобы переместить иглу на поверхность черепа.
3. Проколите отверстие в черепе с помощью шприца объемом 1 мл с прикрепленной иглой 25 G. Поместите скос иглы к прецизионному шприцу и игле 30 G и осторожно поверните руку манипулятора в сторону. Большим и указательным пальцами медленно катайте иглу вперед и назад с легким нажимом, пока кончик иглы не проткнет черепную крышку.
4. Используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы смазать кровь с отверстия иглы. Установите рычаг манипулятора в соответствующее положение на нагруженную прецизионную иглу шприца над отверстием. Совместите кончик иглы с отверстием, используя Z-образную ручку, чтобы опустить иглу вниз к твердой мозговой оболочке, и установите цифровую консоль считывания на ноль.
5. С помощью Z-образной ручки опустите иглу на 1 мм, а затем подождите 1 минуту. Повторяйте до тех пор, пока не будет достигнута желаемая глубина (2 мм, как указано).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игла опускается медленно, чтобы предотвратить дополнительное повреждение окружающей ткани мозга и обратный поток клеточного раствора.
6. Запустите микронасос, а затем следите за тем, чтобы насос остановился после впрыска 2 мкл. Этот процесс должен занять около 6 минут при указанной скорости. Затем подождите 1 минуту, прежде чем перемещать иглу.

6. Удаление иглы и закрытие раны

1. Поднимите иглу на 1 мм и подождите 1 мин. Повторяйте до тех пор, пока игла полностью не освободится от черепа.
2. При необходимости используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы смазать кровь с места инъекции.
3. Используя деревянный конец аппликатора с ватным наконечником, возьмите небольшой кусочек костного воска (~ 1 мм) и сформируйте из него конус. Поместите его в отверстие в черепе, проталкивая воск в отверстие.
4. Нагрейте щипцы с помощью стерилизатора бисера и используйте их, чтобы растопить оставшийся воск на черепе и разгладить его.
5. Поместите примерно две капли раствора бупивакаина (анестетика) в разрез и используйте щипцы, чтобы стянуть края кожи.
6. Натяните кожу и поместите один или два зажима для раны, чтобы закрыть кожу.
7. Поместите мышь в чистую клетку для восстановления на грелке в месте, свободном от сквозняков, и внимательно наблюдайте за мышью. Дайте мышке полностью проснуться от анестезии, возобновив нормальную активность, прежде чем вернуть ее в обычное жилье.
8. Ежедневно проверяйте мышь после хирургической процедуры и управляйте обезболиванием в соответствии с руководящими принципами учреждения.
   1. Если бупренорфин SR (этап 4.6) используется для обезболивания, формула с замедленным высвобождением действует в течение 72 часов. Повторяйте инъекцию только в том случае, если через 72 ч присутствует видимая боль или дискомфорт. При правильном выполнении мыши хорошо восстанавливаются после внутричерепных инъекций, и дополнительная анальгезия не требуется.
   2. Снимают скобы через 7-10 дней после операции.
9. Мониторинг роста опухоли с помощью визуализации живых животных (МРТ).
   1. Усыпляйте мышей, когда достигаются гуманные конечные точки (т.е. если животное теряет 20% массы тела или становится гипотермическим).
   2. Из-за инвазивной природы этих опухолей головного мозга наблюдайте за мышами на предмет неврологических симптомов, таких как неровная походка, частичный паралич, вращение или наклон головы. Усыпьте мышь, если наблюдаются какие-либо из этих клинических признаков прогрессирующего роста опухоли.

Результаты

Мышей, которым вводили опухолевые клетки головного мозга, следует ежедневно контролировать на наличие признаков роста опухоли, таких как судороги, атаксия или потеря веса. Рост опухоли головного мозга также можно контролировать с помощью МРТ-сканирования через регулярные промежутки ?...

Обсуждение

Доклинические модели необходимы для оценки новых терапевтических мишеней и новых стратегий лечения при ГБМ. Генетически модифицированные мышиные модели для GBM имеют преимущество возникновения опухоли в автохтонном участке, но часто с длительной латентностью и непредсказуемым росто?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T