زراعة وتصوير شرائح الورم المخاطي الكاذب البريتوني خارج الجسم الحي من عينات الورم البشري المقطوعة

Summary

نحن نصف بروتوكولا لإنتاج وثقافة وتصور السرطانات البشرية ، والتي انتشرت إلى الأسطح البريتونية. يتم قطع عينات الورم المقطوعة باستخدام اهتزاز وزراعتها على إدخالات منفذة لزيادة الأوكسجين والقدرة على البقاء ، تليها تحليلات التصوير والمصب باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي.

Abstract

الورم المخاطي الصفاق الكاذب (PMP) هو حالة نادرة تنتج عن انتشار ورم أولي مخاطي وما ينتج عن ذلك من تراكم الخلايا السرطانية التي تفرز الميوسين في التجويف البريتوني. يمكن أن ينشأ PMP من أنواع مختلفة من السرطانات ، بما في ذلك الزائدة الدودية والمبيض والقولون والمستقيم ، على الرغم من أن أورام الزائدة الدودية هي إلى حد بعيد المسببات الأكثر شيوعا. من الصعب دراسة PMP بسبب (1) ندرته ، (2) نماذج الفئران المحدودة ، و (3) الأنسجة المخاطية اللاخلوية. تسمح الطريقة المعروضة هنا بالتصور والاستجواب في الوقت الفعلي لأنواع الأورام هذه باستخدام شرائح النمط العضوي خارج الجسم الحي المشتقة من المريض في إعداد تظل فيه البيئة المكروية للورم (TME) سليمة. في هذا البروتوكول ، نصف أولا تحضير شرائح الورم باستخدام الاهتزاز والثقافة اللاحقة طويلة الأجل. ثانيا ، نصف التصوير البؤري لشرائح الورم وكيفية مراقبة القراءات الوظيفية للحياة وتصوير الكالسيوم والانتشار المحلي. باختصار ، يتم تحميل الشرائح بأصباغ التصوير ويتم وضعها في غرفة تصوير يمكن تركيبها على مجهر متحد البؤر. يتم استخدام مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني والصور متحدة البؤر لتقييم الجدوى الأولية والوظائف الخلوية. يستكشف هذا الإجراء أيضا الحركة الخلوية الانتقالية ، وتفاعلات إشارات paracrine في TME. أخيرا ، وصفنا بروتوكول تفكك لشرائح الورم لاستخدامها في تحليل التدفق الخلوي. يمكن استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي الكمي للاختبار العلاجي من مقاعد البدلاء إلى السرير لتحديد التغييرات التي تحدث داخل المشهد المناعي ومحتوى الخلايا الظهارية.

Introduction

الورم المخاطي الصفاق الكاذب (PMP) هو متلازمة نادرة بمعدل حدوث 1 لكل مليون شخص في السنة¹. تحدث معظم حالات PMP بسبب النقائل من الأورام الزائدة الدودية. بالنظر إلى أن الفئران ليس لديها ملحق شبيه بالإنسان ، فإن نمذجة هذا النوع من السرطان تظل صعبة للغاية. في حين أن المرض الأساسي غالبا ما يكون قابلا للشفاء عن طريق الاستئصال الجراحي ، فإن خيارات العلاج للمرض النقيلي محدودة. لذلك ، فإن الأساس المنطقي لتطوير نموذج الشريحة العضوية الجديد هذا هو دراسة البيولوجيا المرضية ل PMP. حتى الآن ، لا توجد نماذج عضوية ملحقة يمكن استزراعها بشكل دائم. ومع ذلك ، فقد ثبت أن النموذج الحديث مفيد للاختبار الدوائي للعوامل العلاجية والعلاج المناعي². على هذا النحو ، قمنا بتكييف نظام زراعة شرائح النمط العضوي ، والذي تم استخدامه في أنواع أخرى من السرطانات البشرية ، مثل الدماغ والثدي والبنكرياس والرئة والمبيض وغيرها³،^4،5،6.

بالإضافة إلى الأورام الزائدة الدودية ، ينتج PMP أحيانا عن أنواع أخرى من الأورام ، بما في ذلك سرطانات المبيض⁷ ، وفي ظروف نادرة ، الأورام المخاطية الحليمية داخل القناة⁸ وسرطان القولون⁹. بالإضافة إلى ذلك ، تميل هذه الأورام إلى النمو ببطء ، مع معدلات نقش ضعيفة في نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX)^10,11. بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك حاجة غير ملباة لتطوير نماذج لدراسة هذا المرض للبدء في فهم البيولوجيا المرضية ل PMP ، وكيف يتم تجنيد هذه الخلايا السرطانية على الأسطح البريتونية ، وتتكاثر ، وتهرب من المراقبة المناعية.

بينما يتم قطع شرائح الورم من الدورة الدموية الوعائية الجهازية ، فإنها تحتوي على مكونات خلوية وغير خلوية ، بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية والخلايا اللحمية والخلايا المناعية والخلايا السرطانية والخلايا البطانية والأعصاب. تسمح هذه البيئة المكروية شبه السليمة بالتحقيق الوظيفي لأنواع الخلايا هذه ، وهو أمر مفيد بشكل فريد مقارنة بالثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد ، والتي تتكون فقط من الخلايا السرطانية¹². في حين أن ثقافات الشرائح العضوية مفيدة في بعض النواحي ، إلا أنها بطبيعتها نهج قائم على الإنتاجية المنخفضة ، مقارنة بالمواد العضوية ثلاثية الأبعاد ، والتي يمكن توسيعها ، وهي مناسبة لفحص الأدوية العلاجية التجريبية المتعددة¹³،^14،15. في حالة PMP ، لم تكن هناك تقارير توثق إنشاء موثوق وتمرير دائم للعضويات المشتقة من PMP¹⁶. من المحتمل أن يكون هذا بسبب الطبيعة البطيئة النمو للخلايا السرطانية المشتقة من PMP ، فضلا عن انخفاض عدد الخلايا الظهارية الخبيثة الموجودة داخل هذه الأورام المخاطية. نظرا للحاجة إلى تطوير نماذج لدراسة PMP ، فإن شرائح النمط العضوي مناسبة بشكل فريد لدراسة هذا المرض. نقدم بروتوكولا لإعداد وتصوير وتحليل PMP من العينات البشرية.

Protocol

تم إجراء إزالة الهوية والحصول على جميع الأنسجة بموجب بروتوكول معتمد من IRB في جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو.

1. إعداد أنسجة PMP البشرية لمعالجة الأنسجة وزراعتها

1. نقل أنسجة الورم والتشريح المجهري
   1. تحضير وسائط النقل والثقافة: أكمل 10٪ (v / v) وسائط النسر المعدلة من Dulbecco (DMEM) ، 10٪ FBS ، 2 mM L-Glutamine ، 1٪ Penicillin / Streptomycin (Pen Strep).
   2. عند وصول الأنسجة ووفقا لبروتوكول مؤسسي معتمد من IRB ، انقل أنسجة الورم PMP إلى 35 طبقا بقطر 6 سم يحتوي على DMEM كامل.
   3. تشريح المناطق الصلبة الدقيقة من الورم من أي ميوسين مسال باستخدام مشرط. بينما يمكن قطع عقيدات الميوسين المضمنة داخل الأجزاء الصلبة من الأنسجة ، قم بإزالة جميع المناطق المسالة من الورم. بالإضافة إلى إزالة أي موسين مسال ، أو مناطق أنسجة شديدة المخاطية ، قم بإزالة أي نسيج يصعب قطعه بمشرط. قطع عقيدات الأنسجة إلى قطع أصغر ، بحجم 1 سم³ تقريبا.
      ملاحظة: سيكون الحصول على عقيدات الورم التي يتم تنظيفها من الميوسين و ECM الكثيف أمرا ضروريا للقطع الناجح باستخدام الاهتزاز. كمراقبة للجودة ، يتم قطع أنسجة الورم التي تصل إلى مختبر الأبحاث أولا بواسطة أخصائي علم الأمراض ، والذي يتم توزيعه لاحقا بواسطة المستودع الحيوي UCSD. المتبرعون بالأنسجة الذين يخضعون لإزالة الملطفة من كعكة omental هي الحالات المثلى لهذا البروتوكول نظرا لعبء المرض المرتفع ، مما يتيح إنتاج المزيد من الشرائح من الكتلة المتزايدة من توافر الأنسجة للبحث.
      تنبيه: يتطلب العمل مع الأنسجة البشرية شهادة السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL2). تحقق مع المؤسسة للتدريب على إجراءات BSL2.
2. إعداد الأغاروز وتضمين الأنسجة
   1. قم بإعداد محلول 5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في برنامج تلفزيوني بدون FBS في نفس يوم وصول الأنسجة. انتبه جيدا لمحلول الأغاروز لأنه يميل إلى الغليان بسرعة.
      ملاحظة: الأغاروز منخفض الذوبان ضروري لتضمين قطع الأنسجة. سوف يتجمد الأغاروز عالي الذوبان في درجات حرارة أعلى ، مما يقلل من صلاحية شرائح الأنسجة إذا تم تضمينها. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يتسبب FBS في محلول الذوبان في تكوين الرواسب.
   2. ضع قطع الأنسجة التي تم الحصول عليها في أطباق 6 سم بدون سائل. لا تضع أكثر من 2-3 قطع لكل طبق 6 سم بحيث يمكن إزالتها كمكعبات أغاروز دون إزعاج أو لمس الأنسجة الأخرى.
   3. أضف محلول الأغاروز السائل 5٪ إلى أطباق 6 سم تحتوي على عينات الورم 1 سم³ . أضف ما يكفي من الأغاروز لتغطية العينة فقط. بمجرد إضافته ، ضع المناديل المدمجة في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. تركيب عينات الأنسجة على الاهتزاز
   1. أخرج الآجار المتصلب من الثلاجة وقطع مكعبات الأغاروز أكبر قليلا من عرض الأنسجة باستخدام مشرط.
   2. ضع الغراء الفائق على مرحلة الاهتزاز وضع مكعب الأغاروز برفق على الغراء الفائق. اترك 1-2 دقيقة حتى يتجمد الغراء. عند هذه النقطة ، يجب تثبيت مكعب الأغاروز مع الأنسجة على المسرح.
   3. ثبت الشفرة على الاهتزاز واضبط السماكة المطلوبة لقسم الأنسجة. للحصول على التصوير الأمثل باستخدام المجهر متحد البؤر ، يجب أن تكون المقاطع حوالي 150 إلى 250 ميكرون. اضغط على زر ابدأ واستمر في التنقل خلال قطع كتلة أنسجة الأغاروز حتى يتم قطع الأنسجة تماما.
      ملاحظة: إذا لم يتم قطع الأنسجة أو إزاحتها من مكعب الأغاروز ، ففكر في تضمين الأنسجة في أغاروز عالي التركيز وقم بقص أي قطع أنسجة إضافية قد تكون كثيفة جدا بحيث لا يمكن قطعها أو تلتصق بشفرة الاهتزاز.
4. زراعة شرائح الأنسجة على إدخالات نفاذية
   1. قم بإعداد لوحة إدخال قابلة للنفاذ للثقافة عن طريق إضافة 2 مل من وسائط DMEM الكاملة أعلاه و 3 مل أسفل الغشاء القابل للاختراق.
   2. ارفع شرائح الأنسجة برفق من حجرة القطع بالاهتزاز باستخدام فرشاة رسم رقيقة وضع شريحتين إلى أربع شرائح في أطباق استزراع قابلة للنفاذ تحتوي على وسائط DMEM كاملة. بعد 24 ساعة ، قم باستنشاق الوسائط باستخدام ماصة واستبدل الوسائط بوسائط ثقافية جديدة.
   3. استزرع الشرائح لمدة تصل إلى 7 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO₂ ، مع استبدال الوسائط كل 24 ساعة. في هذه المرحلة الزمنية ، أضف عناصر تحكم لقتل الخلايا (bortezomib) والعلاجات الكيميائية القابلة للاختبار 5-fluoruracil (5-FU) إلى وسائط الثقافة لإجراء التدخل الدوائي.
   4. بعد 7 أيام من الزراعة ، توقع خسارة حوالي 15٪ -25٪ من الصلاحية مقارنة بالنقطة الزمنية لليوم 0 (مباشرة بعد القطع) في ظل ظروف غير معالجة بالعقاقير (DMEM كاملة). قم بقياس الصلاحية باستخدام أصباغ حيوية حية ميتة مثل الكالسيين AM (حي) وبروبيديوم يوديد (ميت).

2. التصوير البؤري لشرائح الأنسجة البشرية الحية

ملاحظة: بمجرد تحضير شرائح الورم العضوي ، من الضروري تحديد صلاحية الأنسجة لإجراء تحليل فعال ومحسن. بالنظر إلى أن عينات الورم يبلغ سمكها 150-250 ميكرومتر ، يوصى بشدة باستخدام المجهر البؤري أو ثنائي الفوتون على المجاهر واسعة المجال لتحديد الدراسات في الموقع. يمكن أيضا استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد الجدوى والسكان الخلويين (الطرق أدناه). ومع ذلك ، يتم فقدان الدقة المكانية أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي ، ومن المحتمل أن يتم التقليل من الجدوى نظرا للحاجة إلى فصل شرائح الورم بالطرق الميكانيكية والكيميائية.

1. إعداد الكاشف والإعداد التجريبي
   1. ضع شرائح الورم لتحليل التصوير متحد البؤر في بئر واحد من طبق مكون من 12 بئرا يحتوي على برنامج تلفزيوني مع 1٪ FBS. لتجارب تصوير الكالسيوم ، بدلا من PBS ، احتضان الشرائح في محلول الكالسيوم خارج الخلية أعدت على النحو التالي: 125 mM كلوريد الصوديوم ، 5.9 mM KCl ، 2.56 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl₂ ، 25 mM HEPES ، 0.1 ٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4 ، 3 mM الجلوكوز ، تصفيتها معقمة. قم بإعداد هذا الحل في وقت مبكر وتخزينه لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية (انظر القسم 2.1.8).
   2. باتباع التركيزات والبروتوكولات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة ، قم بأخذ عينات البقع بأصباغ التصوير (انظر جدول المواد) لتحديد صلاحية شرائح الأنسجة. صورة لمدة 10 دقائق -1 ساعة بعد إضافة صبغة الصلاحية.
   3. بعد الحضانة ، انقل الشرائح إلى طبق بتري زجاجي شفاف بصريا يحتوي على PBS مع 1٪ FBS لاستخدامه في التصوير على جهاز تصوير متحد البؤر.
      ملاحظة: بالنسبة للتصوير متحد البؤر، تم استخدام منصة نيكون A1R متحدة البؤر.
   4. افتح برنامج التصوير متحد البؤر. ابدأ التصوير بمعدل 10 أضعاف وحدد وضع التصوير XYZ. ثم قم بتكوين إعدادات الاستحواذ على النحو التالي.
      1. قم بتشغيل الليزر التالي: 488 نانومتر و 561 نانومتر. اضبط الكسب على 100 باستخدام طاقة الليزر بنسبة 1٪. اضبط طاقة الليزر واكتسابها حسب الحاجة أثناء التقاط الصورة. بناء على جودة الصورة المطلوبة، حدد 512 × 512 بكسل أو 1024 × 1024 بكسل للحصول على دقة أعلى.
   5. حدد إزالة التعشيق ، ثم حدد المسح الضوئي لبدء التصوير.
   6. لتصوير الكالسيوم ، احتضان شرائح الأنسجة مع Fluo-4-AM لمدة 1 ساعة محمية من الضوء. اتبع بروتوكول المصنع لإذابة Fluo-4-AM في DMSO. بعد ساعة واحدة ، اغسل الشرائح 3x بمحلول الكالسيوم خارج الخلية واتبع بروتوكول التصوير في الخطوات 2.1.4-2.1.5.
   7. لتجارب تصوير الكالسيوم باستخدام Fluo-4-AM ، حدد XYZT وقم بإلغاء تحديد ليزر 561 نانومتر لزيادة سرعة الاكتساب. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ماسح الرنين لزيادة سرعة التصوير.

3. تفكك الشرائح الحية لقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يمكن استخدام فصل شرائح الأنسجة الحية للعديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك التنميط المناعي ، وتقييم الجدوى ، واستجواب التغييرات في مجموعات الخلايا بعد التدخل الدوائي. يجب اتخاذ خطوات لضمان الحفاظ على جودة الأنسجة وصلاحية الخلية أثناء عملية التفكك.

1. اقطع قطعة صغيرة من نهاية طرف ماصة سعة 1 مل لتوسيع الفتحة للسماح بالتفكك الميكانيكي القوي عن طريق السحب لمدة دقيقة واحدة.
2. احتضان الشرائح على حرارة 37 درجة مئوية مع الدوران لمدة 5-15 دقيقة في 1 مل من محلول الهضم الذي يتكون من نسبة عالية من الجلوكوز DMEM ، 10٪ كولاجيناز لطيف / هيالورونيداز (GCH) ، 10٪ FBS ، و 10٪ DNaseI (1 مجم / مل مخزن).
   ملاحظة: غالبا ما يتم العثور على تغييرات تعتمد على الدفعات من كولاجيناز / هيالورونيداز.
3. أداء اضطراب قوي للأنسجة باستخدام التفكك الميكانيكي 2-3 مرات أثناء الحضانة. تأكد من فحص الهضم ، بالعين ، كل 5 دقائق للحصول على دليل على الهضم الكامل. إذا لزم الأمر ، أوقف الهضم الأنزيمي بالانتقال إلى الخطوة 3.1.4.
4. بمجرد هضمها ، ماصة الشرائح ووسائط الهضم فوق مرشح 70 ميكرومتر يوضع فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اختر قطعا أكبر باستخدام ملقط معقم أو ماصة.
5. باستخدام الطرف الخلفي الحاد لحقنة بلاستيكية سعة 5 مل ، اهرس أي شرائح أكبر غير منفصلة واغسلها مرة أخرى ب 4 مل من PBS تحتوي على 2٪ FBS.
6. خذ طاف الخلية المنفصل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتدويره عند 300 × جم لمدة 5-10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 1 مل من PBS تحتوي على 2٪ FBS.
7. لتحضير العينة لقياس التدفق الخلوي ، أضف المخزن المؤقت المانع الذي يحتوي على 50 ميكرولتر من كتلة FC البشرية واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. إجراء تلطيخ خارج الخلية باستخدام الأجسام المضادة المعنية في 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 2 ٪ FBS.
   ملاحظة: هناك العديد من أنظمة قياس التدفق الخلوي. بمجرد تحضير العينة لقياس التدفق الخلوي ، راجع بروتوكول الشركة المصنعة لتشغيل الجهاز.

4. التدخل الدوائي باستخدام شرائح الأنسجة الحية لتحليل الجدوى والانتشار

ملاحظة: بمجرد تحضير شرائح الورم ذات النمط العضوي ، يمكن إجراء الأساليب التدخلية باستخدام عدة طرق ، بما في ذلك اختبار الأدوية ، siRNA ، وكذلك العدوى الفيروسية لشرائح الأنسجة الحية. سنناقش هنا اختبار المخدرات ، وكذلك القراءات الوظيفية النهائية ، والتي تشمل تحليل الجدوى باستخدام الانتشار المحلي.

1. تحضير 10 مل من 10٪ v / v DMEM كاملة مع 10٪ FBS ، 2 mM L-Glutamine ، 1٪ Pen Strep.
2. Aliquot 5 مل من الوسائط الكاملة لظروف التحكم والعلاج. إلى ال 5 مل المتبقية من الوسائط ، أضف بورتيزوميب (2 ميكرومتر) للحث على موت الخلايا في شرائح الورم كعنصر تحكم إيجابي.
   ملاحظة: بورتيزوميب ، بتركيزات عالية ، هو دواء سام للخلايا يحفز موت الخلايا. يمكن استخدام الأدوية السامة للخلايا الأخرى كتحكم إيجابي لقتل الخلايا.
3. باستخدام شريحتين إلى أربع شرائح من الأنسجة ، والتي تم طلاؤها على الأطباق القابلة للنفاذ ، أضف الوسائط المحضرة في الخطوة 4.2 إلى الطبق ، بالإضافة إلى أي علاجات مركبة إضافية لاستخدامها في تحليل LIVE / DEAD الجدوى النهائية باستخدام المجهر متحد البؤر كما هو موضح في الخطوة 2.1.2 ، أو استخدم تحليل جدوى الإنارة التجارية باستخدام شرائح متطابقة بالتتابع.
   ملاحظة: تعد مطابقة الشرائح المتسلسلة ضرورية لتحليل جدوى الإنارة ، نظرا لأن مقايسة صلاحية الإنارة تعتمد على محتوى ATP الخلوي. نظرا لفقدان عناصر التحكم الداخلية أثناء تحلل الخلية ، يلزم وجود شرائح متشابهة الحجم نظرا لأن النتائج تعتمد على عدد البداية للخلايا القابلة للحياة (أي أن الشرائح غير المتوازنة ستؤدي إلى نتائج غير متوازنة). إذا لم يحصل المستخدم على شرائح متسلسلة ، فلن يكون تحليل الجدوى الانارة ممكنا ، وعلى هذا النحو ستكون هناك حاجة إلى طريقة أخرى لتقييم الجدوى (قياس التدفق الخلوي أو تحليل الخلايا الحية القائم على التصوير متحد البؤر).
4. اترك شرائح الأنسجة في مزرعة تحتوي على DMEM الكامل لمدة 2-5 أيام ، وتغيير الوسائط وكذلك bortezomib و 5-FU كل يوم.
5. لتحليل صلاحية الإنارة ، أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى طبق مكون من 12 بئرا وانقل شرائح الأنسجة المتطابقة بالتتابع إلى محلول PBS باستخدام فرشاة رسم أو استخدم شفط ماصة سعة 1 مل برفق لنقلها.
6. قم بإزالة PBS وإضافة حل تحليل الجدوى الانارة الذي تم إعداده. انظر دليل التعليمات لإعداد الكاشف.
7. أضف 500 ميكرولتر من محلول الصلاحية المضيئة لكل حالة واحتضانها مع دوران بطيء على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. قراءة التلألؤ باستخدام قارئ لوحة التلألؤ.

النتائج

باختصار ، يتم الحصول على عينات الورم البشري من PMP بموجب بروتوكول معتمد من IRB. يتم تحضير الأنسجة وتشريحها الدقيقة وتصلبها في قالب أغاروز ليتم قطعه باستخدام اهتزاز (الشكل 1 أ ؛ فيديو 1). بمجرد القطع ، يتم وضع شرائح الأنسجة واستزراعها على أغشية إدخال قابلة للاختراق (

Discussion

تصف هذه المخطوطة تقنية يمكن استخدامها لاستزراع عينات الورم المخاطي الكاذب الصفاق (PMP) البشرية واستجوابها وتحليلها. لقد استخدمنا العديد من المقايسات الوظيفية النهائية لاستجواب البيئة المكروية المناعية للورم ومنصة للاختبار من مقاعد البدلاء إلى السرير.

في حين أن الطريقة عال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA