תרבית והדמיה של פרוסות גידול Pseudomyxoma peritonei אורגנוטיפיות Ex vivo מדגימות גידול אנושי מנותחות

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לייצור, תרבות והדמיה של סוגי סרטן אנושיים, אשר שלחו גרורות למשטחי הצפק. דגימות גידול שנכרתו נחתכות באמצעות ויברטומה ומתורבתות על תוספות חדירות להגברת החמצון והכדאיות, ולאחר מכן הדמיה וניתוח במורד הזרם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וציטומטריית זרימה.

Abstract

Pseudomyxoma peritonei (PMP) הוא מצב נדיר הנובע מהפצת גידול ראשוני מוציני והצטברות של תאי גידול מפרישי מוצין בחלל הצפק. PMP יכול לנבוע מסוגים שונים של סרטן, כולל תוספתן, שחלות ומעי גס, אם כי גידולים בתוספתן הם ללא ספק האטיולוגיה הנפוצה ביותר. PMP מאתגר למחקר בשל (1) נדירותו, (2) מודלים מורינים מוגבלים, ו (3) היסטולוגיה mucinous, אצלולרי. השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה וחקירה בזמן אמת של סוגי גידולים אלה באמצעות פרוסות אורגנוטיפיות ex vivo שמקורן במטופל בתכשיר שבו מיקרו-סביבה הגידול (TME) נשארת שלמה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה את הכנת פרוסות הגידול באמצעות ויברטומה ולאחר מכן תרבית לטווח ארוך. שנית, אנו מתארים הדמיה קונפוקלית של פרוסות הגידול וכיצד לעקוב אחר קריאות תפקודיות של כדאיות, הדמיית סידן והתפשטות מקומית. בקיצור, הפרוסות עמוסות בצבעי הדמיה ומונחות בתא הדמיה שניתן להרכיבו על מיקרוסקופ קונפוקלי. סרטוני קיטועי זמן ותמונות קונפוקליות משמשים להערכת הכדאיות הראשונית והפונקציונליות הסלולרית. הליך זה בוחן גם תנועה תאית תרגומית, ואינטראקציות איתות פרקריניות ב- TME. לבסוף, אנו מתארים פרוטוקול דיסוציאציה עבור פרוסות גידול שישמשו לניתוח ציטומטריית זרימה. ניתוח ציטומטריית זרימה כמותית יכול לשמש לבדיקות טיפוליות מהספסל למיטה כדי לקבוע שינויים המתרחשים בנוף החיסון ובתכולת תאי האפיתל.

Introduction

Pseudomyxoma peritonei (PMP) היא תסמונת נדירה עם שיעור היארעות של 1 למיליון אנשים בשנה¹. רוב מקרי PMP נגרמים על ידי גרורות מ neoplasms appendiceal. בהתחשב בכך שלעכברים אין תוספתן דמוי אדם, מידול סוג זה של סרטן נותר מאתגר ביותר. בעוד המחלה הראשונית ניתנת לעתים קרובות לריפוי על ידי כריתה כירורגית, אפשרויות הטיפול במחלה גרורתית מוגבלות. לכן, הרציונל לפיתוח מודל פרוסה אורגנוטיפית חדשני זה הוא לחקור את הפתולוגיה של PMP. נכון להיום, אין מודלים אורגנואידים נספחים שניתן לתרבית לנצח; עם זאת, מודל עדכני הוכח כשימושי לבדיקות פרמקולוגיות של חומרים טיפוליים ואימונותרפיה². ככזה, התאמנו מערכת תרבית פרוסה אורגנוטיפית, אשר שימשה בסוגים אחרים של סרטן אנושי, כגון המוח, השד, הלבלב, הריאות, השחלות,^ואחרים 3,4,5,6.

בנוסף לגידולים בתוספתן, PMP נובע לעיתים מסוגי גידולים אחרים, כולל סרטן השחלות⁷, ובנסיבות נדירות, גידולים ריריים פפילריים אינטרדוקטליים⁸ וסרטן המעי הגס⁹. בנוסף, גידולים אלה נוטים לגדול לאט, עם שיעורי השתלה נמוכים במודלים שמקורם בחולה xenograft (PDX)^10,11. בהתחשב באתגרים אלה, יש צורך בלתי מסופק לפתח מודלים לחקר מחלה זו כדי להתחיל להבין את הפתולוגיה של PMP, וכיצד תאים סרטניים אלה: מגויסים למשטחי הצפק, מתרבים ומתחמקים ממעקב חיסוני.

בעוד פרוסות הגידול נחתכות ממחזור הדם המערכתי, פרוסות הגידול מכילות רכיבים תאיים ואצלולריים, כולל המטריצה החוץ תאית, תאי סטרומה, תאי מערכת החיסון, תאי סרטן, תאי אנדותל ועצבים. מיקרו-סביבה שלמה למחצה זו מאפשרת חקירה פונקציונלית של סוגי תאים אלה, יתרון ייחודי בהשוואה לתרביות אורגנואידים תלת-ממדיות, המורכבות רק מתאים סרטניים¹². בעוד תרביות פרוסות אורגנוטיפיות הן יתרון במובנים מסוימים, הן גם מטבען גישה מבוססת תפוקה נמוכה, בהשוואה לאורגנואידים תלת-ממדיים, הניתנים להרחבה, ומתאימים לבדיקת תרופות טיפוליות ניסיוניות מרובות^13,14,15. במקרה של PMP, לא היו דיווחים המתעדים ביסוס אמין והעברה מתמדת של אורגנואידים שמקורם ב-PMP¹⁶. זה כנראה בגלל אופי הגידול האיטי של תאים סרטניים שמקורם ב- PMP, כמו גם המספר הנמוך של תאי אפיתל ממאירים הנמצאים בתוך גידולים מוציניים אלה. בהתחשב בצורך לפתח מודלים לחקר PMP, פרוסות אורגנוטיפיות מתאימות באופן ייחודי לחקר מחלה זו. אנו מציגים פרוטוקול להכנה, הדמיה וניתוח PMP מדגימות אנושיות.

Protocol

הזיהוי והרכישה של כל הרקמות בוצעו תחת פרוטוקול שאושר על ידי IRB באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו.

1. הכנת רקמות PMP אנושיות לעיבוד רקמות ותרבית

1. הובלת רקמות גידול ומיקרודיסקציה
   1. הכן את אמצעי התחבורה והתרבות: להשלים 10% (v/v) של Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (Pen Strep).
   2. עם הגעת הרקמה ועל פי פרוטוקול מוסדי שאושר על ידי IRB, יש להעביר רקמות גידול PMP ל-35 צלחות בקוטר 6 ס"מ המכילות DMEM מלא.
   3. לנתח במיקרו אזורים מוצקים של הגידול מכל מוצין נוזלי באמצעות אזמל. בעוד גושי מוצין המוטבעים בתוך חלקים מוצקים של הרקמה ניתן לחתוך, להסיר את כל האזורים הנוזליים של הגידול. בנוסף להסרת כל מוצין נוזלי, או אזורי רקמה מאוד mucinous, להסיר כל רקמה כי קשה לחתוך עם אזמל. חותכים גושי רקמה לחתיכות קטנות יותר, בערך 1 ס"מ³ בגודל.
      הערה: קבלת גושים סרטניים מנוקים של מוצין ו- ECM צפוף תהיה חיונית לחיתוך מוצלח באמצעות ויברטום. כבקרת איכות, רקמת הגידול המגיעה למעבדת המחקר נחתכת תחילה על ידי פתולוג, אשר מופץ לאחר מכן על ידי המאגר הביולוגי של UCSD. תורמי רקמות שעוברים פירוק פליאטיבי של עוגת האומנטל הם מקרים אופטימליים לפרוטוקול זה בהינתן נטל מחלה גבוה, המאפשר ייצור פרוסות רב יותר מהמסה המוגברת של זמינות הרקמה למחקר.
      התראה: עבודה עם רקמות אנושיות דורשת אישור בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2). בדוק עם המוסד להכשרה על נהלי BSL2.
2. הכנת אגרוז והטמעת רקמות
   1. הכינו תמיסה של 5% של אגרוז נמס נמוך ב- PBS ללא FBS באותו יום של הגעת הרקמות. שימו לב היטב לתמיסת האגרוז מכיוון שהיא נוטה להרתיח במהירות.
      הערה: אגרוז נמס נמוך חיוני להטמעת חלקי רקמות. אגרוז נמס גבוה יתמצק בטמפרטורות גבוהות יותר, ויפחית את הכדאיות של פרוסות רקמה אם יוטמע. בנוסף, FBS בתמיסת ההתמוססות תגרום להיווצרות משקעים.
   2. מניחים את חתיכות הרקמה המתקבלות בכלים של 6 ס"מ ללא נוזל. מניחים לא יותר מ 2-3 חתיכות לכל צלחת 6 ס"מ, כך שניתן להסיר אותם כמו קוביות אגרוז מבלי להפריע או לגעת רקמות אחרות.
   3. הוסף את תמיסת האגרוז הנוזלית 5% לצלחות 6 ס"מ המכילות את דגימות הגידול^{בגודל 1} ס"מ 3. מוסיפים מספיק אגרוז רק כדי לכסות את הדגימה. לאחר ההוספה, הניחו את הרקמות המשובצות במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.
3. הרכבה של דגימות רקמה על הוויברטום
   1. מוציאים את האגר המוצק מהמקרר וחותכים את קוביות האגרוז מעט יותר גדולות מרוחב הרקמה בעזרת אזמל.
   2. מרחו דבק-על על שלב הוויברטומה והניחו בעדינות את קוביית האגרוז על דבק העל. המתינו 1-2 דקות עד שהדבק יתמצק. בשלב זה, קוביית agarose עם רקמה צריך להיות קבוע לבמה.
   3. תקן את הלהב לוויברטומה וקבע את העובי הרצוי של קטע הרקמה. להדמיה אופטימלית במורד הזרם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, המקטעים צריכים להיות בערך 150 עד 250 מיקרון. לחץ על כפתור התחל והמשך במחזוריות דרך חיתוך בלוק רקמת האגרוז עד שהרקמה נחתכת לחלוטין.
      הערה: אם הרקמה אינה נחתכת, או מתנתקת מקוביית האגרוז, שקול להטמיע את הרקמה באגרוז בריכוז גבוה יותר ולחתוך כל פיסת רקמה נוספת שעשויה להיות צפופה מדי לחיתוך או להידבק ללהב הוויברטום.
4. גידול פרוסות רקמה על תוספות חדירות
   1. הכן צלחת הוספה חדירה לתרבית על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיית DMEM שלמה מעל ו -3 מ"ל מתחת לקרום החדיר.
   2. הרימו בעדינות את פרוסות הרקמה מתא החיתוך של הוויברטומה בעזרת מברשת צבע דקה והניחו שתיים עד ארבע פרוסות בצלחות תרבית חדירות המכילות מדיית DMEM שלמה. לאחר 24 שעות, שאפו את המדיה באמצעות פיפטה והחליפו את המדיה במדיה תרבותית רעננה.
   3. תרכבו את הפרוסות עד 7 ימים בטמפרטורה של 37°C/5% CO₂, והחליפו את המדיה כל 24 שעות. בנקודת זמן זו, הוסף בקרות להרג תאים (bortezomib) וכימותרפיות הניתנות לבדיקה 5-fluoruracil (5-FU) למדיה התרבית כדי לבצע התערבות פרמקולוגית.
   4. לאחר 7 ימים של תרבית, צפו לאובדן כדאיות של 15%-25% בהשוואה ליום 0 נקודת הזמן (מיד לאחר החיתוך) בתנאים שאינם מטופלים בתרופות (DMEM מלא). מדוד את הכדאיות באמצעות צבעי כדאיות חיים-מתים כגון calcein AM (חי) ו propidium יודיד (מת).

2. הדמיה קונפוקלית של פרוסות רקמה אנושית חיה

הערה: לאחר הכנת פרוסות הגידול האורגנוטיפיות, חיוני לקבוע את כדאיות הרקמה לביצוע ניתוח יעיל וממוטב במורד הזרם. בהתחשב בכך שדגימות הגידול הן בעובי 150-250 מיקרומטר, מומלץ מאוד לבצע מיקרוסקופ קונפוקלי או שני פוטונים על פני מיקרוסקופים רחבי שדה לצורך קביעת מחקרים באתרם. ציטומטריית זרימה יכולה לשמש גם לקביעת הכדאיות ואוכלוסיות התאים (שיטות להלן). עם זאת, הרזולוציה המרחבית אובדת במהלך ניתוח ציטומטריית זרימה, וסביר להניח שהכדאיות אינה מוערכת כראוי בהתחשב בצורך לנתק פרוסות גידול בשיטות מכניות וכימיות.

1. הכנת מגיבים והגדרת ניסוי
   1. הניחו פרוסות גידול לניתוח הדמיה קונפוקלית בבאר אחת של צלחת בת 12 בארות המכילה PBS עם 1% FBS. לניסויי הדמיית סידן, במקום PBS, יש לדגור על הפרוסות בתמיסת סידן חוץ-תאית שהוכנה באופן הבא: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, 25 mM HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4, 3 mM גלוקוז, סטרילי מסונן. הכינו תמיסה זו מראש ואחסנו אותה עד חודש בטמפרטורה של 4°C (ראה סעיף 2.1.8).
   2. בהתאם לריכוזים ולפרוטוקולים המומלצים על ידי היצרן, יש להכתים דגימות בצבעי הדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את הכדאיות של פרוסות רקמה. התמונה למשך 10 דקות-שעה לאחר הוספת צבע הכדאיות.
   3. לאחר הדגירה, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית שקופה אופטית המכילה PBS עם 1% FBS לשימוש להדמיה במכשיר הדמיה קונפוקלית.
      הערה: עבור הדמיה קונפוקלית, נעשה שימוש בפלטפורמת Nikon A1R Confocal.
   4. פתח את תוכנת ההדמיה הקונפוקלית. התחל הדמיה ב- 10x ובחר במצב הדמיה XYZ. לאחר מכן, קבע את תצורת הגדרות הרכישה באופן הבא.
      1. הפעל את הלייזרים הבאים: 488 ננומטר ו- 561 ננומטר. התאם את הרווח ל- 100 עם עוצמת לייזר של 1%. התאם את עוצמת הלייזר והרווח לפי הצורך במהלך רכישת תמונה. בהתאם לאיכות התמונה הרצויה, בחר 512 x 512 פיקסלים או 1024 x 1024 פיקסלים לקבלת רזולוציה גבוהה יותר.
   5. בחר הסר אינטרלוק ולאחר מכן בחר סריקה כדי להתחיל בהדמיה.
   6. להדמיית סידן, יש לדגור על פרוסות רקמה עם Fluo-4-AM למשך שעה אחת המוגנות מפני אור. עקוב אחר פרוטוקול הייצור להמסת Fluo-4-AM ב- DMSO. לאחר שעה, שטפו פרוסות 3x בתמיסת סידן חוץ-תאית ועקבו אחר פרוטוקול ההדמיה בשלבים 2.1.4-2.1.5.
   7. לניסויי דימות סידן באמצעות Fluo-4-AM, בחר XYZT ובטל את הבחירה בלייזר 561 ננומטר כדי להגביר את מהירות הרכישה. בנוסף, השתמש בסורק התהודה כדי להגביר עוד יותר את מהירות ההדמיה.

3. ניתוק פרוסות חיות לציטומטריית זרימה

הערה: ניתן להשתמש בניתוק פרוסות רקמה חיה למספר יישומים במורד הזרם, כולל אימונוטיפינג, הערכת הכדאיות וחקירת השינויים באוכלוסיית התאים לאחר התערבות תרופתית. יש לנקוט צעדים כדי להבטיח שאיכות הרקמה ויכולת הקיום של התאים נשמרים במהלך תהליך הניתוק.

1. חותכים חתיכה קטנה מקצה פיפטה 1 מ"ל כדי להרחיב את הפתח כדי לאפשר דיסוציאציה מכנית נמרצת על ידי פיפטינג במשך 1 דקה.
2. יש לדגור על פרוסות בטמפרטורה של 37°C עם סיבוב במשך 5-15 דקות ב-1 מ"ל של מאגר עיכול המורכב מ-DMEM עתיר גלוקוז, 10% collagenase/היאלורונידאז עדין (GCH), 10% FBS ו-10% DNaseI (1 מ"ג/מ"ל מלאי).
   הערה: לעתים קרובות ניתן למצוא שינויים תלויי אצווה של collagenase/hyaluronidase.
3. לבצע הפרעה נמרצת של הרקמה באמצעות דיסוציאציה מכנית 2-3 פעמים במהלך הדגירה. הקפד לבדוק את העיכול, על ידי העין, כל 5 דקות עבור ראיות של עיכול מלא. במידת הצורך, עצור את העיכול האנזימטי על ידי המשך לשלב 3.1.4.
4. לאחר העיכול, פיפטה את הפרוסות ואת מצע העיכול על גבי מסנן 70 מיקרומטר מונח על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. בחרו חתיכות גדולות יותר באמצעות מלקחיים סטריליים או פיפטה.
5. בעזרת הקצה האחורי הקהה של מזרק פלסטיק 5 מ"ל, מעכו פרוסות גדולות יותר לא מנותקות ושטפו עוד יותר עם 4 מ"ל PBS המכיל 2% FBS.
6. קח את supernatant התא מנותק בצינור חרוטי 50 מ"ל ולהסתובב ב 300 x גרם במשך 5-10 דקות. הסר את supernatant ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של PBS המכיל 2% FBS.
7. כדי להכין את הדגימה לציטומטריית זרימה, הוסף את מאגר החסימה המכיל 50 μL של בלוק Fc אנושי והשאר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בצע צביעה חוץ-תאית באמצעות הנוגדנים המתאימים ב-50 מיקרוליטר של PBS המכילים 2% FBS.
   הערה: ישנן מערכות ציטומטריית זרימה רבות. לאחר הכנת הדגימה לציטומטריית זרימה, עיין בפרוטוקול היצרן להפעלת המכשיר.

4. התערבות פרמקולוגית באמצעות פרוסות רקמה חיה לצורך ניתוח כדאיות והתפשטות

הערה: לאחר הכנת פרוסות הגידול האורגנוטיפיות, ניתן לבצע גישות התערבותיות באמצעות מספר שיטות, כולל בדיקת תרופות, siRNA, כמו גם זיהום ויראלי של פרוסות רקמות חיות. כאן נדון בבדיקות סמים, כמו גם בקריאות פונקציונליות במורד הזרם, הכוללות ניתוח כדאיות באמצעות התפשטות מקומית.

1. הכן 10 מ"ל של 10% v/v DMEM מלא עם 10% FBS, 2 mM L-גלוטמין, 1% Pen Strep.
2. Aliquot 5 מ"ל של מדיה מלאה עבור תנאי בקרה וטיפול. ל -5 מ"ל הנותרים של מדיה, הוסף בורטזומיב (2 מיקרומטר) כדי לגרום למוות תאי בפרוסות הגידול כבקרה חיובית.
   הערה: בורטזומיב, בריכוזים גבוהים, היא תרופה ציטוטוקסית הגורמת למוות תאי. התרופות ציטוטוקסיות האחרות עשויות לשמש כבקרה חיובית להרג תאים.
3. באמצעות שתיים עד ארבע פרוסות רקמה, אשר צופו על הכלים החדירים, הוסף את המדיה שהוכנה בשלב 4.2 למנה, כמו גם כל טיפול משולב נוסף שישמשו לניתוח LIVE/DEAD במורד הזרם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כמתואר בשלב 2.1.2, או השתמש בניתוח כדאיות זוהרת מסחרית באמצעות פרוסות תואמות ברצף.
   הערה: התאמת פרוסות רציפות חיונית לניתוח כדאיות זוהרת, בהתחשב בכך שבדיקת כדאיות זוהרת מסתמכת על תוכן ATP סלולרי. מכיוון שהבקרות הפנימיות אובדות במהלך ליזה של תאים, נדרשות פרוסות בגודל דומה מכיוון שהתוצאות תלויות במספר ההתחלתי של תאים בני קיימא (כלומר, פרוסות לא מאוזנות יגרמו לתוצאות לא מאוזנות). אם המשתמש אינו משיג פרוסות רציפות, ניתוח כדאיות זוהרת אינו אפשרי, ולכן תידרש שיטת הערכת כדאיות אחרת (ציטומטריית זרימה או הדמיה קונפוקלית מבוססת ניתוח תאים חיים).
4. השאירו פרוסות רקמה בתרבית המכילות DMEM מלא למשך 2-5 ימים, החלפת מדיה וכן בורטזומיב ו-5-FU אחת ליומיים.
5. לניתוח כדאיות זוהרת, הוסף 500 μL של PBS לצלחת של 12 בארות והעבר את פרוסות הרקמה המתאימות ברצף לתמיסת PBS באמצעות מברשת צבע או השתמש בעדינות בשאיבה של פיפטה 1 מ"ל כדי להעביר אותן.
6. הסר את PBS והוסף את פתרון ניתוח הכדאיות הזוהרת שהוכן. עיין במדריך ההוראות להכנת המגיב.
7. הוסיפו 500 μL של תמיסת הכדאיות הזוהרת לכל מצב ודגרו עם סיבוב איטי על השייקר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. קרא זוהר באמצעות קורא לוחות זוהר.

תוצאות

בקיצור, דגימות גידול אנושיות מ- PMP מתקבלות תחת פרוטוקול שאושר על ידי IRB. הרקמה מוכנה, מנותחת במיקרו ומתמצקת בתבנית אגרוז לחיתוך באמצעות ויברטומה (איור 1A; סרטון 1). לאחר החיתוך, פרוסות הרקמה מונחות ומתורבתות על קרומי החדרה חדירים (איור 1B), אשר יכולים לש?...

Discussion

כתב יד זה מתאר טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לתרבית, לחקור ולנתח דגימות גידול של Pseudomyxoma peritonei (PMP) אנושי. השתמשנו במספר רב של בדיקות תפקודיות במורד הזרם כדי לחקור את המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול ופלטפורמה לבדיקות מהספסל למיטה.

בעוד השיטה יעילה מאוד בידינו, זה ידרוש קצת תרגול ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA