来自切除人肿瘤标本的 离体 器官型腹膜假粘液瘤肿瘤切片的培养和成像

摘要

我们描述了一种用于人类癌症的生产，培养和可视化的方案，这些癌症已经转移到腹膜表面。使用振动切片机切割切除肿瘤标本，并在可渗透的插入物上培养以增加氧合和活力，然后使用共聚焦显微镜和流式细胞术进行成像和下游分析。

摘要

腹膜假黏液瘤 （PMP） 是一种罕见的疾病，由粘液原发性肿瘤的播散和分泌粘蛋白的肿瘤细胞在腹膜腔中积累引起。PMP可由各种类型的癌症引起，包括阑尾癌，卵巢癌和结直肠癌，尽管阑尾肿瘤是迄今为止最常见的病因。PMP由于其（1）罕见性，（2）有限的小鼠模型和（3）粘液，无细胞组织学，研究具有挑战性。这里介绍的方法允许在肿瘤微环境（TME）保持完整的制剂中使用患者来源的 离体 器官型切片对这些肿瘤类型进行实时可视化和询问。在该协议中，我们首先描述使用振动切片机制备肿瘤切片并随后进行长期培养。其次，我们描述了肿瘤切片的共聚焦成像以及如何监测活力、钙成像和局部增殖的功能读数。简而言之，切片装有成像染料，并放置在可以安装在共聚焦显微镜上的成像室中。延时视频和共聚焦图像用于评估初始活力和细胞功能。该程序还探索TME中的平移细胞运动和旁分泌信号传导相互作用。最后，我们描述了用于流式细胞术分析的肿瘤切片的解离方案。定量流式细胞术分析可用于从实验室到床边的治疗测试，以确定免疫景观和上皮细胞含量内发生的变化。

引言

腹膜假黏液瘤 （PMP） 是一种罕见综合征，发病率为每年每百万人 1 例¹。大多数PMP病例是由阑尾肿瘤转移引起的。鉴于小鼠没有类似人类的阑尾，对这种类型的癌症进行建模仍然极具挑战性。虽然原发性疾病通常可以通过手术切除治愈，但转移性疾病的治疗选择有限。因此，开发这种新型器官型切片模型的基本原理是研究PMP的病理生物学。迄今为止，还没有可以永久培养的阑尾类器官模型;然而，最近的模型被证明可用于治疗剂和免疫疗法的药理学测试²。因此，我们采用了一种器官型切片培养系统，该系统已用于其他类型的人类癌症，例如脑癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等3，⁴，^5，6。

除阑尾肿瘤外，PMP偶尔还由其他肿瘤类型引起，包括卵巢癌⁷，在极少数情况下，导管内状粘液肿瘤⁸ 和结肠癌⁹。此外，这些肿瘤往往生长缓慢，在患者来源的异种移植（PDX）模型中移植率低^10，11。鉴于这些挑战，开发模型来研究这种疾病的需求尚未得到满足，以开始了解PMP的病理生物学，以及这些癌细胞如何被招募到腹膜表面，增殖并逃避免疫监视。

虽然从体循环中切割出来，但肿瘤切片确实含有细胞和无细胞成分，包括细胞外基质、基质细胞、免疫细胞、癌细胞、内皮细胞和神经。这种半完整的微环境允许对这些细胞类型进行功能研究，与仅由癌细胞组成的3D类器官培养物相比，这是独特的优势¹²。虽然器官型切片培养在某些方面是有利的，但与可以扩增的3D类器官相比，它们本质上也是一种基于低通量的方法，适用于多重研究性治疗药物筛选¹³，^14，15。就PMP而言，没有报告记录PMP衍生类器官的可靠建立和永久传代¹⁶。这可能是由于PMP衍生的肿瘤细胞生长缓慢，以及在这些粘液肿瘤中发现的恶性上皮细胞数量很少。鉴于需要开发模型来研究PMP，器官型切片特别适合研究这种疾病。我们提出了一种用于制备，成像和分析人类标本PMP的方案。

研究方案

所有组织的去识别和采集均在加州大学圣地亚哥分校根据IRB批准的协议进行。

1. 制备用于组织处理和培养的人PMP组织

1. 肿瘤组织的运输和显微切割
   1. 准备运输和培养基:完成 10% （v/v） Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）、10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素（笔链球菌）。
   2. 组织到达后，根据机构IRB批准的方案，将PMP肿瘤组织转移到35个直径为6厘米的培养皿中，其中包含完整的DMEM。
   3. 使用手术刀从任何液化粘蛋白中显微解剖肿瘤的固体区域。虽然可以切割嵌入组织固体部分的粘蛋白结节，但去除肿瘤的所有液化区域。除了去除任何液化粘蛋白或高度粘液的组织区域外，还可以去除任何难以用手术刀切割的组织。将组织结节切成小块，大小约为 1 cm³ 。
      注意:获得清除粘蛋白和致密ECM的肿瘤结节对于使用振动切片机成功切割至关重要。作为质量控制，到达研究实验室的肿瘤组织首先由病理学家切割，随后由UCSD生物储存库分发。鉴于高疾病负担，接受网膜蛋糕姑息性减瘤术的组织供体是该方案的最佳案例，这使得从增加的组织可用性中产生更多的切片用于研究。
      注意:使用人体组织需要生物安全2级（BSL2）认证。请与该机构联系以获取有关BSL2程序的培训。
2. 琼脂糖制备和组织包埋
   1. 在组织到达的同一天，在不含FBS的PBS中制备5%的低熔点琼脂糖溶液。密切注意琼脂糖溶液，因为它往往会迅速沸腾。
      注意:低熔点琼脂糖对于包埋组织碎片至关重要。高熔点琼脂糖会在较高温度下凝固，如果嵌入，会降低组织切片的活力。此外，溶解溶液中的FBS会导致沉淀物的形成。
   2. 将获得的组织片放入6厘米的培养皿中，没有液体。每6厘米培养皿放置不超过2-3件，以便它们可以作为琼脂糖立方体取出，而不会干扰或接触其他组织。
   3. 将液体5%琼脂糖溶液加入含有1cm³ 肿瘤标本的6cm培养皿中。添加足够的琼脂糖以覆盖标本。加入后，将包埋的组织置于4°C冰箱中30分钟。
3. 在振动切片机上安装组织标本
   1. 从冰箱中取出凝固的琼脂，并使用手术刀切割略大于组织宽度的琼脂糖块。
   2. 将强力胶涂在振动切片机载物台上，然后将琼脂糖立方体轻轻地放在强力胶上。等待 1-2 分钟让胶水凝固。此时，应将带有组织的琼脂糖立方体固定在载物台上。
   3. 将刀片固定在振动切片机上，并设置组织切片的所需厚度。为了使用共聚焦显微镜进行最佳的下游成像，切片应约为150至250微米。点击 开始 按钮并继续循环切割琼脂糖组织块，直到组织完全切割。
      注意:如果组织没有切割或从琼脂糖立方体上脱落，请考虑将组织嵌入更高浓度的琼脂糖中，并修剪掉任何可能太致密而无法切割或粘在振动切片机刀片上的额外组织碎片。
4. 在渗透性插入物上培养组织切片
   1. 通过在渗透膜上方和下方添加 3 mL 的完整 DMEM 培养基来制备用于培养的渗透性插入板。
   2. 使用细画笔轻轻地将组织切片从振动切片机的切割室中取出，并将两到四个切片放入含有完整DMEM培养基的可渗透培养皿中。24小时后，使用移液管吸出培养基并用新鲜培养基替换培养基。
   3. 将切片在37°C / 5%CO₂下培养长达7天，每24小时更换一次培养基。此时，向培养基中添加细胞杀伤对照（硼替佐米）和可测试的化疗5-氟尿嘧啶（5-FU）以进行药物干预。
   4. 培养 7 天后，在非药物治疗条件下（完全 DMEM），与第 0 天时间点（切割后立即）相比，预计活力损失约 15%-25%。使用活死活力染料（如钙黄绿素AM（活）和碘化丙啶（死））测量活性。

2. 活体人体组织切片的共聚焦成像

注意:一旦制备了器官型肿瘤切片，就必须确定组织活力以进行高效和优化的下游分析。鉴于肿瘤标本的厚度为 150-250 μm，强烈建议使用共聚焦或双光子显微镜而不是宽视场显微镜来确定 原位研究。流式细胞术也可用于确定活力和细胞群（方法如下）。然而，在流式细胞术分析过程中会失去空间分辨率，并且由于需要通过机械和化学方法分离肿瘤切片，因此活力可能被低估了。

1. 试剂制备和实验设置
   1. 将肿瘤切片置于含有 1% FBS 的 PBS 的 12 孔培养皿的单孔中进行共聚焦成像分析。对于钙成像实验，代替PBS，将切片在细胞外钙溶液中孵育，制备如下:125mM NaCl，5.9mM KCl，2.56mM CaCl₂，1mM MgCl₂，25mM HEPES，0.1%BSA，pH 7.4，3mM葡萄糖，无菌过滤。提前准备该溶液，并在4°C下储存长达1个月（见第2.1.8节）。
   2. 按照制造商推荐的浓度和方案，用成像染料（参见 材料表）对样品进行染色，以确定组织切片的活力。添加活性染料后10分钟-1小时的图像。
   3. 孵育后，将切片转移到含有具有1%FBS的PBS的光学透明玻璃底培养皿中，用于共聚焦成像装置上的成像。
      注意:对于共聚焦成像，使用了尼康A1R共聚焦平台。
   4. 打开共聚焦成像软件。以 10x 开始成像并选择 XYZ 成像模式。然后，按如下方式配置采集设置。
      1. 打开以下激光器:488 nm 和 561 nm。将增益调整为 100，激光功率为 1%。在图像采集过程中根据需要调整激光功率和增益。根据所需的图像质量，选择 512 x 512 像素或 1024 x 1024 像素以获得更高的分辨率。
   5. 选择" 删除互锁"，然后选择" 扫描 "以启动映像。
   6. 对于钙成像，用Fluo-4-AM孵育组织切片避光1小时。遵循制造商在DMSO中溶解Fluo-4-AM的方案。1小时后，用细胞外钙溶液洗涤切片3x，并按照步骤2.1.4-2.1.5中的成像方案进行操作。
   7. 对于使用 Fluo-4-AM 的钙成像实验，请选择 XYZT 并取消选择 561 nm 激光器以提高采集速度。此外，使用共振扫描仪进一步提高成像速度。

3. 用于流式细胞术的活切片解离

注意:活组织切片的解离可用于多种下游应用，包括免疫分型、活力评估和询问药物干预后细胞群的变化。应采取措施确保在解离过程中保持组织质量和细胞活力。

1. 从 1 mL 移液器吸头的末端切下一小块以扩大开口，以便通过移液 1 分钟进行剧烈的机械解离。
2. 在 37 °C 下在 1 mL 消化缓冲液中孵育切片并旋转 5-15 分钟，该缓冲液由高葡萄糖 DMEM、10% 温和胶原酶/透明质酸酶 （GCH）、10% FBS 和 10% DNaseI（1 mg/mL 储备液）组成。
   注意:经常发现胶原酶/透明质酸酶的批次依赖性变化。
3. 在孵育期间使用机械解离2-3次对组织进行剧烈破坏。一定要每5分钟用肉眼检查一次消化，寻找完全消化的证据。如果需要，通过继续步骤3.1.4停止酶消化。
4. 消化后，将切片和消化培养基移液到放置在 50 mL 锥形管顶部的 70 μm 过滤器顶部。使用无菌镊子或移液管挑选较大的碎片。
5. 使用塑料 5 mL 注射器的钝后端，捣碎任何较大的未解离切片，并用含有 2% FBS 的 4 mL PBS 进一步洗涤。
6. 将解离的细胞上清液放入50mL锥形管中，以300× g 离心5-10分钟。除去上清液，用含有 1% FBS 的 1 mL PBS 洗涤沉淀。
7. 为了制备用于流式细胞术的样品，加入含有50μL人Fc封闭块的封闭缓冲液，并在室温下放置15分钟。在含有 2% FBS 的 50 μL PBS 中使用相应的抗体进行细胞外染色。
   注意:有许多流式细胞术系统。准备好用于流式细胞术的样品后，请参阅制造商的规程以了解设备的操作。

4. 使用活组织切片进行活性和增殖分析的药物干预

注意:一旦制备了器官型肿瘤切片，就可以使用多种方法进行干预方法，包括药物测试，siRNA以及活组织切片的病毒感染。在这里，我们将讨论药物测试以及下游功能读数，其中包括使用局部增殖进行活力分析。

1. 准备 10 mL 的 10% v/v 完整 DMEM，含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1% 笔链球菌。
2. 等分试样 5 mL 用于对照和处理条件的完整培养基。向剩余的 5 mL 培养基中加入硼替佐米 （2 μM） 以诱导肿瘤切片中的细胞死亡作为阳性对照。
   注意:高浓度的硼替佐米是一种诱导细胞死亡的细胞毒性药物。其他细胞毒性药物可用作细胞杀伤的阳性对照。
3. 使用已铺在渗透性培养皿上的两到四个组织切片，将步骤4.2中制备的培养基添加到培养皿中，以及用于使用共聚焦显微镜进行下游活力LIVE/DEAD分析的任何其他组合疗法，如步骤2.1.2中所述，或使用顺序匹配切片进行商业发光活性分析。
   注意:顺序切片匹配对于发光活力分析至关重要，因为发光活力测定依赖于细胞ATP含量。由于细胞裂解过程中内部对照丢失，因此需要相似大小的切片，因为结果取决于活细胞的起始数量（即，不平衡的切片将导致不平衡的结果）。如果用户没有获得连续切片，则无法进行发光活性分析，因此需要另一种活力评估方法（流式细胞术或基于共聚焦成像的活细胞分析）。
4. 将组织切片留在含有完整DMEM的培养物中2-5天，每隔一天更换培养基以及硼替佐米和5-FU。
5. 对于发光活性分析，将 500 μL PBS 加入 12 孔培养皿中，并使用画笔将顺序匹配的组织切片转移到 PBS 溶液中，或使用 1 mL 移液器轻轻抽吸以转移这些切片。
6. 取出PBS并加入制备的发光活性分析溶液。请参阅试剂制备说明手册。
7. 根据条件加入 500 μL 发光活性溶液，并在室温下在摇床上缓慢旋转孵育 30 分钟。使用发光读板器读取发光。

结果

简而言之，来自PMP的人肿瘤标本是根据IRB批准的方案获得的。制备组织，显微解剖并在琼脂糖模具中固化，以使用振动切片机切割（图1A;视频 1）。切割后，将组织切片放置在可渗透的插入膜上并培养（图1B），可用于原位成像测定，以及使用流式细胞术，共聚焦成像分析和细胞毒性测定进行细胞和功能检查。人PMP组织切片培养和处?...

讨论

本手稿描述了一种可用于培养、询问和分析人腹膜假黏液瘤 （PMP） 肿瘤标本的技术。我们利用了许多下游功能检测来询问肿瘤免疫微环境和从工作台到床边测试的平台。

虽然该方法在我们手中非常有效，但使用振动切片机切割肿瘤标本需要一些练习。也就是说，我们遇到了由于高度粘液的样品以及不正确地显微解剖以去除不可切割支架（腹壁，腹水，各种ECM蛋白）而导致的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA