Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Résumé

Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Résumé

Le pseudomyxome peritonei (PMP) est une maladie rare qui résulte de la dissémination d’une tumeur primaire mucineuse et de l’accumulation résultante de cellules tumorales sécrétant de la mucine dans la cavité péritonéale. La PMP peut provenir de divers types de cancers, y compris l’appendice, l’ovaire et le colorectal, bien que les néoplasmes de l’appendice soient de loin l’étiologie la plus courante. La PMP est difficile à étudier en raison de (1) sa rareté, (2) ses modèles murins limités et (3) son histologie acellulaire mucineuse. La méthode présentée ici permet de visualiser et d’interroger en temps réel ces types de tumeurs à l’aide de tranches organotypiques ex vivo dérivées du patient dans une préparation où le microenvironnement tumoral (TME) reste intact. Dans ce protocole, nous décrivons d’abord la préparation de tranches tumorales à l’aide d’un vibratome et la culture ultérieure à long terme. Deuxièmement, nous décrivons l’imagerie confocale des tranches tumorales et comment surveiller les lectures fonctionnelles de la viabilité, de l’imagerie calcique et de la prolifération locale. En bref, les tranches sont chargées de colorants d’imagerie et sont placées dans une chambre d’imagerie qui peut être montée sur un microscope confocal. Des vidéos accélérées et des images confocales sont utilisées pour évaluer la viabilité initiale et la fonctionnalité cellulaire. Cette procédure explore également le mouvement cellulaire translationnel et les interactions de signalisation paracrine dans le TME. Enfin, nous décrivons un protocole de dissociation pour les tranches tumorales à utiliser pour l’analyse de cytométrie en flux. L’analyse quantitative par cytométrie en flux peut être utilisée pour les tests thérapeutiques du laboratoire au chevet du patient afin de déterminer les changements qui se produisent dans le paysage immunitaire et le contenu des cellules épithéliales.

Introduction

Le pseudomyxome péritonique (PMP) est un syndrome rare avec un taux d’incidence de 1 par million de personnes par an¹. La plupart des cas de PMP sont causés par des métastases de néoplasmes appendiceux. Étant donné que les souris n’ont pas d’appendice semblable à celui de l’homme, la modélisation de ce type de cancer reste extrêmement difficile. Bien que la maladie primaire soit souvent curable par résection chirurgicale, les options de traitement de la maladie métastatique sont limitées. Par conséquent, la raison d’être du développement de ce nouveau modèle de tranches organotypiques est d’étudier la pathobiologie de PMP. À ce jour, il n’existe aucun modèle organoïde appendice pouvant être cultivé perpétuellement; Cependant, un modèle récent s’est révélé utile pour les tests pharmacologiques d’agents thérapeutiques et d’immunothérapie². En tant que tel, nous avons adapté un système de culture de tranches organotypiques, qui a été utilisé dans d’autres types de cancers humains, tels que le cerveau, le sein, le pancréas, le poumon, l’ovaire et d’autres 3,4,5,6.

En plus des néoplasmes annexes, la PMP résulte occasionnellement d’autres types de tumeurs, notamment les cancers de l’ovaire⁷ et, dans de rares circonstances, les tumeurs mucineuses papillaires intracanalaires⁸ et le cancer du côlon⁹. De plus, ces tumeurs ont tendance à croître lentement, avec de faibles taux de greffe dans les modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX)^10,11. Compte tenu de ces défis, il existe un besoin non satisfait de développer des modèles pour étudier cette maladie afin de commencer à comprendre la pathobiologie de la PMP et comment ces cellules cancéreuses sont recrutées sur les surfaces péritonéales, prolifèrent et échappent à la surveillance immunitaire.

Bien que coupées de la circulation vasculaire systémique, les tranches tumorales contiennent des composants cellulaires et acellulaires, y compris la matrice extracellulaire, les cellules stromales, les cellules immunitaires, les cellules cancéreuses, les cellules endothéliales et les nerfs. Ce microenvironnement semi-intact permet l’investigation fonctionnelle de ces types cellulaires, ce qui est particulièrement avantageux par rapport aux cultures organoïdes 3D, qui ne sont constituées que de cellules cancéreuses¹². Bien que les cultures de tranches organotypiques soient avantageuses à certains égards, elles constituent également une approche intrinsèquement basée sur le faible débit, par rapport aux organoïdes 3D, qui peuvent être étendus et conviennent au criblage multiplexé de médicaments thérapeutiques expérimentaux^13,14,15. Dans le cas du PMP, il n’y a eu aucun rapport documentant l’établissement fiable et le passage perpétuel d’organoïdes dérivés du PMP¹⁶. Cela est probablement dû à la nature à croissance lente des cellules tumorales dérivées de la PMP, ainsi qu’au faible nombre de cellules épithéliales malignes trouvées dans ces tumeurs mucineuses. Compte tenu de la nécessité de développer des modèles pour étudier la PMP, les tranches organotypiques sont particulièrement adaptées à l’étude de cette maladie. Nous présentons un protocole de préparation, d’imagerie et d’analyse des PMP à partir de spécimens humains.

Protocole

La désidentification et l’acquisition de tous les tissus ont été effectuées selon un protocole approuvé par l’IRB à l’Université de Californie à San Diego.

1. Préparation de tissus PMP humains pour le traitement et la culture de tissus

1. Transport des tissus tumoraux et microdissection
   1. Préparer les milieux de transport et de culture : compléter 10 % (v/v) de milieux Eagle modifiés de Dulbecco (DMEM), 10 % FBS, 2 mM L-glutamine, 1 % Pénicilline/streptomycine (Pen Strep).
   2. À l’arrivée des tissus et selon un protocole institutionnel approuvé par l’IRB, transférer les tissus tumoraux PMP dans 35 boîtes d’un diamètre de 6 cm contenant du DMEM complet.
   3. Micro-disséquer les régions solides de la tumeur de toute mucine liquéfiée à l’aide d’un scalpel. Alors que les nodules de mucine incrustés dans les parties solides du tissu peuvent être coupés, enlever toutes les régions liquéfiées de la tumeur. En plus d’enlever toute mucine liquéfiée ou les régions tissulaires très mucineuses, enlevez tout tissu difficile à couper avec un scalpel. Couper les nodules tissulaires en morceaux plus petits, d’environ 1 cm³ .
      REMARQUE: L’obtention de nodules tumoraux nettoyés de la mucine et de l’ECM dense sera essentielle pour une coupe réussie à l’aide d’un vibratome. En tant que contrôle de qualité, le tissu tumoral qui arrive dans le laboratoire de recherche est d’abord coupé par un pathologiste, qui est ensuite distribué par le bioréférentiel UCSD. Les donneurs de tissus qui subissent une réduction tumorale palliative du gâteau omental sont des cas optimaux pour ce protocole étant donné une charge de morbidité élevée, ce qui permet une plus grande production de tranches à partir de la masse accrue de tissus disponibles pour la recherche.
      ATTENTION : Travailler avec des tissus humains nécessite une certification de niveau de biosécurité 2 (BSL2). Vérifiez auprès de l’établissement pour une formation sur les procédures BSL2.
2. Préparation de l’agarose et encastrement tissulaire
   1. Préparer une solution à 5% d’agarose à bas point de fusion dans du PBS sans FBS le jour même de l’arrivée des tissus. Portez une attention particulière à la solution d’agarose car elle a tendance à bouillir rapidement.
      REMARQUE: L’agarose à faible fusion est essentielle pour l’encastrement des morceaux de tissu. L’agarose à haute fusion se solidifie à des températures plus élevées, ce qui réduit la viabilité des tranches de tissu si elles sont incorporées. De plus, FBS dans la solution de dissolution provoquera la formation de précipités.
   2. Placer les morceaux de tissu obtenus dans des plats de 6 cm sans liquide. Ne placez pas plus de 2-3 morceaux par plat de 6 cm afin qu’ils puissent être enlevés sous forme de cubes d’agarose sans déranger ou toucher d’autres tissus.
   3. Ajouter la solution liquide d’agarose à 5% dans des boîtes de 6 cm contenant les échantillons tumoraux de 1 cm³ . Ajouter suffisamment d’agarose pour simplement couvrir le spécimen. Une fois ajoutés, placer les mouchoirs incrustés dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 30 min.
3. Montage d’échantillons de tissus sur le vibratome
   1. Retirer la gélose solidifiée du réfrigérateur et couper les cubes d’agarose légèrement plus grands que la largeur du tissu à l’aide d’un scalpel.
   2. Appliquez la super colle sur l’étage du vibratome et placez doucement le cube d’agarose sur la super colle. Laisser reposer 1 à 2 minutes pour que la colle se solidifie. À ce stade, le cube d’agarose avec du tissu doit être fixé à la scène.
   3. Fixez la lame au vibratome et définissez l’épaisseur souhaitée de la section de tissu. Pour une imagerie optimale en aval à l’aide de la microscopie confocale, les sections doivent être d’environ 150 à 250 microns. Appuyez sur le bouton Démarrer et continuez à couper le bloc de tissu d’agarose jusqu’à ce que le tissu soit complètement coupé.
      REMARQUE: Si le tissu ne coupe pas ou se déloge du cube d’agarose, envisagez d’incorporer le tissu dans une concentration plus élevée d’agarose et de couper tout morceau de tissu supplémentaire qui pourrait être trop dense pour être coupé ou collé à la lame du vibratome.
4. Culture de tranches de tissu sur des inserts perméables
   1. Préparer une plaque d’insertion perméable pour la culture en ajoutant 2 mL de média DMEM complet au-dessus et 3 mL au-dessous de la membrane perméable.
   2. Soulevez doucement les tranches de tissu hors de la chambre de coupe du vibratome à l’aide d’un pinceau fin et placez deux à quatre tranches dans des boîtes de culture perméables contenant un média DMEM complet. Après 24 h, aspirer le média à l’aide d’une pipette et remplacer le média par un milieu de culture frais.
   3. Culture des tranches jusqu’à 7 jours à 37 °C/5% CO₂, en remplaçant le milieu toutes les 24 heures. À ce stade, ajouter des contrôles pour la destruction cellulaire (bortézomib) et des chimiothérapies testables 5-fluoruracile (5-FU) dans les milieux de culture pour effectuer une intervention pharmacologique.
   4. Après 7 jours de culture, attendez-vous à une perte de viabilité d’environ 15% à 25% par rapport au point de temps du jour 0 (immédiatement après la coupe) dans des conditions non traitées par le médicament (DMEM complet). Mesurer la viabilité à l’aide de colorants vivants-morts tels que la calcéine AM (vivante) et l’iodure de propidium (mort).

2. Imagerie confocale de tranches de tissus humains vivants

REMARQUE: Une fois que les tranches de tumeur organotypiques ont été préparées, il est essentiel de déterminer la viabilité tissulaire pour effectuer une analyse en aval efficace et optimisée. Étant donné que les échantillons tumoraux ont une épaisseur de 150 à 250 μm, la microscopie confocale ou à deux photons est fortement recommandée par rapport aux microscopes à grand champ pour déterminer les études in situ. La cytométrie de flux peut également être utilisée pour déterminer la viabilité et les populations cellulaires (les méthodes sont ci-dessous). Cependant, la résolution spatiale est perdue lors de l’analyse par cytométrie en flux, et la viabilité est probablement sous-estimée étant donné la nécessité de dissocier les tranches tumorales par des méthodes mécaniques et chimiques.

1. Préparation du réactif et configuration expérimentale
   1. Placez les tranches tumorales pour l’analyse d’imagerie confocale dans un seul puits d’une boîte à 12 puits contenant du PBS avec 1% FBS. Pour les expériences d’imagerie calcique, au lieu de PBS, incuber les tranches dans une solution de calcium extracellulaire préparée comme suit: 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, 25 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, 3 mM glucose, filtré stérile. Préparez cette solution à l’avance et conservez-la jusqu’à 1 mois à 4 °C (voir rubrique 2.1.8).
   2. En suivant les concentrations et les protocoles recommandés par le fabricant, colorer les échantillons avec des colorants imageurs (voir le tableau des matériaux) afin de déterminer la viabilité des tranches de tissu. Image pendant 10 min-1 h après l’ajout du colorant de viabilité.
   3. Après l’incubation, transférer les tranches dans une boîte de Petri à fond de verre optiquement transparente contenant du PBS avec 1% de FBS à utiliser pour l’imagerie sur un appareil d’imagerie confocale.
      REMARQUE: Pour l’imagerie confocale, la plate-forme confocale Nikon A1R a été utilisée.
   4. Ouvrez le logiciel d’imagerie confocale. Commencez la création d’images à 10x et sélectionnez le mode d’imagerie XYZ. Ensuite, configurez les paramètres d’acquisition comme suit.
      1. Allumez les lasers suivants : 488 nm et 561 nm. Ajustez le gain à 100 avec une puissance laser à 1%. Ajustez la puissance laser et le gain selon les besoins lors de l’acquisition de l’image. Selon la qualité d’image souhaitée, sélectionnez 512 x 512 pixels ou 1024 x 1024 pixels pour une résolution plus élevée.
   5. Sélectionnez Supprimer le verrouillage, puis Analyser pour lancer la création d’imagerie.
   6. Pour l’imagerie calcique, incuber des tranches de tissu avec Fluo-4-AM pendant 1 h à l’abri de la lumière. Suivez le protocole du fabricant pour dissoudre Fluo-4-AM dans du DMSO. Après 1 h, laver les tranches 3x avec une solution de calcium extracellulaire et suivre le protocole d’imagerie des étapes 2.1.4-2.1.5.
   7. Pour les expériences d’imagerie calcique utilisant Fluo-4-AM, sélectionnez XYZT et désélectionnez le laser 561 nm pour augmenter la vitesse d’acquisition. De plus, utilisez le scanner de résonance pour augmenter encore la vitesse d’imagerie.

3. Dissociation des tranches vivantes pour la cytométrie en flux

REMARQUE : La dissociation de tranches de tissus vivants peut être utilisée pour plusieurs applications en aval, y compris l’immunotypage, l’évaluation de la viabilité et l’interrogation des changements dans les populations cellulaires après une intervention pharmacologique. Des mesures doivent être prises pour s’assurer que la qualité des tissus et la viabilité cellulaire sont maintenues pendant le processus de dissociation.

1. Couper un petit morceau à l’extrémité d’un embout de pipette de 1 mL pour élargir l’ouverture afin de permettre une dissociation mécanique vigoureuse en pipetant pendant 1 min.
2. Incuber des tranches à 37 °C en tournant de 5 à 15 minutes dans 1 mL de tampon de digestion composé de DMEM à haute teneur en glucose, de collagénase douce/hyaluronidase douce (GCH), de 10 % de FBS et de 10 % de DNaseI (1 mg/mL de stock).
   REMARQUE: Des changements dépendants des lots de collagénase / hyaluronidase sont souvent trouvés.
3. Effectuer une perturbation vigoureuse du tissu en utilisant la dissociation mécanique 2-3 fois pendant l’incubation. Assurez-vous de vérifier la digestion, à l’œil, toutes les 5 minutes pour des preuves de digestion complète. Si nécessaire, arrêtez la digestion enzymatique en passant à l’étape 3.1.4.
4. Une fois digérés, pipeter les tranches et le milieu de digestion sur un filtre de 70 μm placé sur un tube conique de 50 mL. Choisissez des morceaux plus gros à l’aide d’une pince stérile ou d’une pipette.
5. À l’aide de l’extrémité arrière émoussée d’une seringue en plastique de 5 mL, écraser toutes les tranches non dissociées plus grosses et laver davantage avec 4 mL de PBS contenant 2 % de FBS.
6. Prendre le surnageant cellulaire dissocié dans un tube conique de 50 ml et faire tourner à 300 x g pendant 5-10 min. Retirer le surnageant et laver la pastille avec 1 mL de PBS contenant 2 % de FBS.
7. Pour préparer l’échantillon à la cytométrie en flux, ajouter le tampon bloquant contenant 50 μL de bloc Fc humain et laisser à température ambiante pendant 15 min. Effectuer une coloration extracellulaire en utilisant les anticorps respectifs dans 50 μL de PBS contenant 2% de FBS.
   REMARQUE: Il existe de nombreux systèmes de cytométrie en flux. Une fois l’échantillon préparé pour la cytométrie en flux, reportez-vous au protocole de fonctionnement de l’appareil établi par le fabricant.

4. Intervention pharmacologique utilisant des tranches de tissus vivants pour l’analyse de viabilité et de prolifération

REMARQUE: Une fois que les tranches de tumeur organotypiques ont été préparées, des approches interventionnelles peuvent être effectuées en utilisant plusieurs méthodes, y compris les tests de médicaments, siRNA, ainsi que l’infection virale de tranches de tissus vivants. Ici, nous discuterons des tests de drogues, ainsi que des lectures fonctionnelles en aval, qui incluent l’analyse de viabilité à l’aide de la prolifération locale.

1. Préparer 10 mL de DMEM complet à 10 % v/v avec 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 % de Pen Strep.
2. Aliquote 5 mL de milieu complet pour les conditions de contrôle et de traitement. Aux 5 mL restants de milieux, ajouter le bortézomib (2 μM) pour induire la mort cellulaire dans les tranches tumorales en tant que témoin positif.
   NOTE: Le bortézomib, à des concentrations élevées, est un médicament cytotoxique qui induit la mort cellulaire. Les autres médicaments cytotoxiques peuvent être utilisés comme contrôle positif pour la destruction cellulaire.
3. À l’aide de deux à quatre tranches de tissu, qui ont été plaquées sur les boîtes perméables, ajouter le milieu préparé à l’étape 4.2 à la boîte, ainsi que toute thérapie combinée supplémentaire à utiliser pour l’analyse LIVE/DEAD de viabilité en aval par microscopie confocale comme décrit à l’étape 2.1.2, ou utiliser une analyse de viabilité luminescente commerciale utilisant des tranches appariées séquentiellement.
   REMARQUE: L’appariement séquentiel des tranches est essentiel pour l’analyse de viabilité luminescente, étant donné que le test de viabilité luminescente repose sur la teneur en ATP cellulaire. Comme les contrôles internes sont perdus pendant la lyse cellulaire, des tranches de taille similaire sont nécessaires puisque les résultats dépendent du nombre initial de cellules viables (c.-à-d. que des tranches déséquilibrées entraîneront des résultats déséquilibrés). Si l’utilisateur n’obtient pas de tranches séquentielles, l’analyse de viabilité luminescente n’est pas possible et, à ce titre, une autre méthode d’évaluation de la viabilité sera nécessaire (cytométrie en flux ou analyse confocale basée sur l’imagerie confocal de cellules vivantes).
4. Laisser en culture les tranches de tissu contenant du DMEM complet pendant 2 à 5 jours, en changeant de milieu ainsi que le bortézomib et le 5-FU tous les deux jours.
5. Pour l’analyse de viabilité luminescente, ajouter 500 μL de PBS dans une boîte à 12 puits et transférer les tranches de tissu appariées séquentiellement à la solution de PBS à l’aide d’un pinceau ou utiliser doucement l’aspiration d’une pipette de 1 ml pour les transférer.
6. Retirez le PBS et ajoutez la solution d’analyse de viabilité luminescente qui a été préparée. Voir le manuel d’instructions pour la préparation du réactif.
7. Ajouter 500 μL de la solution de viabilité luminescente par condition et incuber avec une rotation lente sur l’agitateur à température ambiante pendant 30 min. Lire la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques de luminescence.

Résultats

En bref, les échantillons de tumeurs humaines provenant du PMP sont obtenus dans le cadre d’un protocole approuvé par l’IRB. Le tissu est préparé, microdisséqué et solidifié dans un moule en agarose pour être coupé à l’aide d’un vibratome (figure 1A; Vidéo 1). Une fois coupées, les tranches de tissu sont placées et cultivées sur des membranes d’insertion perméables (Figure 1B), qui peuvent être utilisées pour des essai...

Discussion

Ce manuscrit décrit une technique qui peut être utilisée pour cultiver, interroger et analyser des échantillons tumoraux humains de pseudomyxome péritoné (PMP). Nous avons utilisé de nombreux tests fonctionnels en aval pour interroger le microenvironnement immunitaire tumoral et une plate-forme pour les tests du laboratoire au chevet du patient.

Bien que la méthode soit très efficace entre nos mains, il faudra un peu de pratique pour couper des échantillons tumoraux à l’aide d’u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA