절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

요약

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

초록

가성 점액종 복막종(PMP)은 점액성 원발성 종양의 파종과 그에 따른 복강 내 점액 분비 종양 세포의 축적으로 인해 발생하는 드문 질환입니다. PMP는 맹장암, 난소암, 결장직장암을 포함한 다양한 유형의 암에서 발생할 수 있지만 맹장 신생물이 단연코 가장 흔한 병인입니다. PMP는 (1) 희귀성, (2) 제한된 쥐 모델 및 (3) 점액성, 무세포 조직학으로 인해 연구하기 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 종양 미세 환경(TME)이 손상되지 않은 제제에서 환자 유래 생체 외 기관형 슬라이스를 사용하여 이러한 종양 유형을 실시간으로 시각화하고 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 비브라톰을 사용하여 종양 절편을 준비하고 후속 장기 배양을 설명합니다. 둘째, 종양 절편의 컨포칼 이미징과 생존력, 칼슘 이미징 및 국소 증식의 기능적 판독값을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 요컨대, 슬라이스에는 이미징 염료가 로드되고 컨포칼 현미경에 장착할 수 있는 이미징 챔버에 배치됩니다. 타임랩스 비디오와 컨포칼 이미지는 초기 생존력과 세포 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 이 절차는 또한 TME에서 번역 세포 이동 및 측분비 신호 상호작용을 탐구합니다. 마지막으로, 유세포 분석에 사용되는 종양 절편에 대한 해리 프로토콜을 설명합니다. 정량적 유세포 분석은 면역 환경 및 상피 세포 함량 내에서 발생하는 변화를 확인하기 위해 벤치 투 베드사이드 치료 테스트에 사용할 수 있습니다.

서문

복막가점액종(PMP)은 연간 발병률이 100만 명당 1명인 희귀 증후군입니다¹. 대부분의 PMP 사례는 맹장 신생물의 전이로 인해 발생합니다. 생쥐가 인간과 같은 맹장을 가지고 있지 않다는 점을 감안할 때, 이러한 유형의 암을 모델링하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 원발성 질환은 종종 외과적 절제로 치료할 수 있지만 전이성 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. 따라서 이 새로운 기관형 절편 모델을 개발하는 근거는 PMP의 병리학을 연구하는 것입니다. 현재까지 영구적으로 배양할 수 있는 맹장 오가노이드 모델은 없습니다. 그러나, 최근의 모델은 치료제 및 면역요법의 약리학적 시험에 유용한 것으로 나타났다². 따라서 우리는 뇌암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암 등과 같은 다른 유형의 인간 암에 사용된 기관형 절편 배양 시스템을 채택했습니다 3,4,5,6.

맹장 신생물 외에도 PMP는 난소암⁷을 포함한 다른 종양 유형에서 발생하는 경우도 있으며, 드물게 유두내 점액성 신생물⁸ 및 결장암⁹을 유발한다. 또한, 이들 종양은 천천히 성장하는 경향이 있으며, 환자 유래 이종이식(PDX) 모델에서 생착률이 낮다^(10,11). 이러한 문제를 감안할 때 PMP의 병리학을 이해하기 시작하고 이러한 암세포가 복막 표면으로 모집되고 증식하며 면역 감시를 피하는 방법을 이해하기 시작하기 위해 이 질병을 연구하기 위한 모델을 개발해야 할 미충족 요구가 있습니다.

전신 혈관 순환에서 절단되는 동안 종양 조각에는 세포외 기질, 기질 세포, 면역 세포, 암세포, 내피 세포 및 신경을 포함한 세포 및 무세포 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이러한 반온전한 미세환경은 이러한 세포 유형의 기능적 조사를 가능하게 하며, 이는 암세포로만 구성된 3D 오가노이드 배양에 비해 유일하게 유리하다¹². 기관형 절편 배양은 일부 측면에서 유리하지만, 확장이 가능한 3D 오가노이드에 비해 본질적으로 낮은 처리량 기반 접근 방식이며 다중 연구 치료 약물 스크리닝에 적합합니다^13,14,15. PMP의 경우, PMP 유래 오가노이드¹⁶의 신뢰할 수 있는 확립 및 영구적인 계대배양을 문서화한 보고는 없었다. 이는 PMP 유래 종양 세포의 느린 성장 특성과 이러한 점액성 종양 내에서 발견되는 악성 상피 세포의 수가 적기 때문일 수 있습니다. PMP를 연구하기 위한 모델을 개발할 필요성을 감안할 때 기관형 절편은 이 질병을 연구하는 데 고유하게 적합합니다. 우리는 인간 표본에서 PMP를 준비, 이미징 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

모든 조직의 비식별화 및 획득은 샌디에이고 캘리포니아 대학교에서 IRB 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 조직 가공 및 배양을 위한 인간 PMP 조직의 제조

1. 종양 조직의 운반 및 미세 해부
   1. 수송 및 배양 배지 준비: 10%(v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM), 10% FBS, 2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Pen Strep)을 완료합니다.
   2. 조직 도착 시 그리고 기관 IRB 승인 프로토콜에 따라 PMP 종양 조직을 완전한 DMEM을 포함하는 직경 6cm의 접시 35개로 옮깁니다.
   3. 메스를 사용하여 액화된 뮤신으로부터 종양의 고형 영역을 미세 해부합니다. 조직의 단단한 부분에 박힌 점액 결절을 절단할 수 있지만 종양의 모든 액화 영역을 제거합니다. 액화된 점액 또는 점액이 많은 조직 영역을 제거하는 것 외에도 메스로 자르기 어려운 조직을 제거합니다. 조직 결절을 약 1cm³ 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
      참고: 점액과 조밀한 ECM으로 제거된 종양 결절을 얻는 것은 비브라톰을 사용하여 성공적인 절단에 필수적입니다. 품질 관리를 위해 연구실에 도착한 종양 조직은 먼저 병리학자에 의해 절단된 후 UCSD 생물 저장소에 의해 배포됩니다. omental 케이크의 완화적 용적축소를 받는 조직 기증자는 높은 질병 부담을 감안할 때 이 프로토콜에 대한 최적의 사례이며, 이는 연구를 위한 조직 가용성의 증가된 질량으로 인해 더 많은 슬라이스 생산을 가능하게 합니다.
      주의 : 인체 조직으로 작업하려면 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 인증이 필요합니다. BSL2 절차에 대한 교육은 기관에 확인하십시오.
2. 아가로스 준비 및 조직 포매
   1. 조직 도착 당일에 FBS 없이 PBS 중의 저용융 아가로스의 5% 용액을 제조한다. agarose 용액은 빨리 끓는 경향이 있으므로 세심한주의를 기울이십시오.
      참고: 저융점 아가로스는 조직 조각을 매립하는 데 필수적입니다. 고용융 아가로스는 더 높은 온도에서 응고되어 매립될 경우 조직 절편의 생존력을 감소시킵니다. 또한 용해 용액의 FBS는 침전물을 형성합니다.
   2. 얻은 티슈 조각을 액체없이 6cm 접시에 담습니다. 6cm 접시 당 2-3 개 이하로 놓아서 다른 조직을 방해하거나 만지지 않고 아가 로스 큐브로 제거 할 수 있습니다.
   3. 액체 5% 아가로스 용액을 1^cm3 종양 표본을 함유하는 6 cm 디쉬에 첨가한다. 표본을 덮을 수 있을 만큼 충분한 아가로스를 추가합니다. 추가한 후 내장된 티슈를 4°C 냉장고에 30분 동안 넣습니다.
3. 비브라톰에 조직 표본 장착
   1. 냉장고에서 응고 된 한천을 꺼내고 메스를 사용하여 티슈 너비보다 약간 큰 아가로스 큐브를 자릅니다.
   2. 비브라톰 스테이지에 슈퍼 글루를 바르고 아가로스 큐브를 슈퍼 글루 위에 부드럽게 놓습니다. 접착제가 굳을 때까지 1-2분 정도 기다립니다. 이 시점에서, 조직이있는 아가로스 큐브는 스테이지에 고정되어야한다.
   3. 블레이드를 비브라톰에 고정하고 조직 섹션의 원하는 두께를 설정하십시오. 컨포칼 현미경을 사용한 최적의 다운스트림 이미징을 위해서는 단면이 대략 150-250미크론이어야 합니다. 시작 버튼을 누르고 조직이 완전히 절단될 때까지 아가로스 조직 블록의 절단을 계속 순환합니다.
      참고: 조직이 절단되지 않거나 아가로스 큐브에서 빠지는 경우 조직을 더 높은 농도의 아가로스에 삽입하고 너무 조밀하여 절단할 수 없거나 비브라톰 블레이드에 달라붙을 수 있는 추가 조직 조각을 잘라내는 것을 고려하십시오.
4. 투과성 삽입물에서 조직 절편 배양
   1. 투과성 멤브레인 위와 아래 3mL의 완전한 DMEM 배지 2mL를 추가하여 배양을 위한 투과성 삽입 플레이트를 준비합니다.
   2. 얇은 페인트 브러시를 사용하여 비브라톰의 절단실에서 조직 조각을 부드럽게 들어 올리고 완전한 DMEM 배지가 들어 있는 투과성 배양 접시에 2-4개의 조각을 넣습니다. 24시간 후, 피펫을 사용하여 배지를 흡인하고 배지를 신선한 배양 배지로 교체합니다.
   3. 슬라이스를 37°C/5%_CO2에서 최대 7일 동안 배양하고 24시간마다 배지를 교체합니다. 이 시점에서 세포 사멸(보르테조밉) 및 테스트 가능한 화학 요법 5-플루오루라실(5-FU)에 대한 대조군을 배양 배지에 추가하여 약리학적 개입을 수행합니다.
   4. 배양 7일 후, 비약물 처리 조건(완전 DMEM)에서 0일 시점(절단 직후)에 비해 생존율이 약 15%-25% 손실될 것으로 예상합니다. 칼세인 AM(살아 있음) 및 프로피듐 요오드화물(죽은)과 같은 살아있는 생존력 염료를 사용하여 생존율을 측정합니다.

2. 살아있는 인체 조직 절편의 컨포칼 이미징

참고: 기관형 종양 절편이 준비되면 효율적이고 최적화된 다운스트림 분석을 수행하기 위해 조직 생존력을 결정하는 것이 필수적입니다. 종양 표본의 두께가 150-250μm라는 점을 감안할 때 현장 연구를 결정하기 위해 광시야 현미경보다 공초점 또는 이광자 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 유세포 분석은 또한 생존력과 세포 집단을 결정하는 데 사용할 수 있습니다 (방법은 아래에 있음). 그러나 유세포 분석 중에 공간 분해능이 손실되고 기계적 및 화학적 방법으로 종양 절편을 분리해야 한다는 점을 감안할 때 생존력이 과소평가될 가능성이 높습니다.

1. 시약 준비 및 실험 설정
   1. 컨포칼 이미징 분석을 위해 종양 절편을 1% FBS가 포함된 PBS가 포함된 12웰 접시의 단일 웰에 놓습니다. 칼슘 이미징 실험을 위해, PBS 대신에, 슬라이스를 다음과 같이 제조된 세포외 칼슘 용액에서 인큐베이션한다: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM_CaCl2, 1 mM_MgCl2, 25 mM HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4, 3 mM 글루코스, 멸균 여과. 이 용액을 미리 준비하고 1°C에서 최대 4개월 동안 보관하십시오(섹션 2.1.8 참조).
   2. 제조업체에서 권장하는 농도 및 프로토콜에 따라 이미징 염료( 재료 표 참조)로 샘플을 염색하여 조직 절편의 생존 가능성을 결정합니다. 생존 염료를 첨가한 후 10분-1시간 동안의 이미지.
   3. 인큐베이션 후, 슬라이스를 컨포칼 이미징 장치에서 이미징에 사용할 1% FBS가 포함된 PBS가 포함된 광학적으로 투명한 유리 바닥 페트리 접시로 옮깁니다.
      참고: 컨포칼 이미징의 경우 Nikon A1R 컨포칼 플랫폼이 사용되었습니다.
   4. 컨포칼 이미징 소프트웨어를 엽니다. 10x에서 이미징을 시작하고 XYZ 이미징 모드를 선택합니다. 그런 다음 다음과 같이 획득 설정을 구성합니다.
      1. 488nm 및 561nm 레이저를 켭니다. 레이저 출력이 100%인 상태에서 게인을 1%로 조정합니다. 이미지 획득 중에 필요에 따라 레이저 출력과 게인을 조정합니다. 원하는 이미지 품질에 따라 더 높은 해상도를 위해 512 x 512 픽셀 또는 1024 x 1024 픽셀을 선택합니다.
   5. Remove Interlock(인터록 제거)을 선택한 다음 Scan(스캔)을 선택하여 이미징을 시작합니다.
   6. 칼슘 이미징의 경우 Fluo-4-AM으로 조직 조각을 빛으로부터 보호되는 1시간 동안 배양합니다. DMSO에서 Fluo-4-AM을 용해하기 위한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 1시간 후 세포외 칼슘 용액으로 슬라이스를 3배 세척하고 2.1.4-2.1.5단계의 이미징 프로토콜을 따릅니다.
   7. Fluo-4-AM을 사용한 칼슘 이미징 실험의 경우 XYZT를 선택하고 561nm 레이저를 선택 취소하여 획득 속도를 높입니다. 또한 공명 스캐너를 사용하여 이미징 속도를 더욱 높일 수 있습니다.

3. 유세포 분석을 위한 살아있는 절편의 분리

참고: 살아있는 조직 절편의 분리는 면역형 분석, 생존력 평가, 약리학적 개입 후 세포 집단 변화 조사를 포함한 여러 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 분리 과정에서 조직의 질과 세포 생존력이 유지되도록 조치를 취해야 합니다.

1. 1mL 피펫 팁의 끝에서 작은 조각을 잘라 1분 동안 피펫팅하여 격렬한 기계적 해리가 가능하도록 개구부를 넓힙니다.
2. 고포도당 DMEM, 10% 순 콜라게나제/히알루로니다제(GCH), 10% FBS 및 10% DNaseI(1mg/mL 스톡)로 구성된 1mL의 소화 완충액에서 37°C에서 5-15분 동안 회전하여 슬라이스를 배양합니다.
   참고: 콜라게나제/히알루로니다아제의 배치 의존적 변화가 종종 발견됩니다.
3. 배양 중에 2-3 회 기계적 해리를 사용하여 조직을 격렬하게 파괴하십시오. 완전한 소화의 증거가 있는지 5분마다 눈으로 소화를 확인하십시오. 필요한 경우 3.1.4 단계로 진행하여 효소 분해를 중지합니다.
4. 소화가 완료되면 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 70μm 필터 위에 슬라이스와 분해 배지를 피펫팅합니다. 멸균 집게 또는 피펫을 사용하여 더 큰 조각을 선택하십시오.
5. 플라스틱 5mL 주사기의 뭉툭한 뒷부분을 사용하여 해리되지 않은 더 큰 조각을 으깨고 2% FBS가 포함된 PBS 4mL로 추가로 세척합니다.
6. 분리된 세포 상층액을 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 300 x g 에서 5-10분 동안 회전시킵니다. 상층액을 제거하고 2% FBS를 함유하는 PBS 1mL로 펠릿을 세척합니다.
7. 유세포 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해 50 μL의 인간 Fc 블록이 포함된 블로킹 완충액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 방치합니다. 2% FBS를 함유한 PBS 50 μL에서 각각의 항체를 사용하여 세포외 염색을 수행한다.
   참고: 많은 유세포 분석 시스템이 있습니다. 유세포 분석을 위해 샘플이 준비되면 장치 작동에 대한 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오.

4. 생존력 및 증식 분석을 위해 생체 조직 절편을 이용한 약리학적 개입

참고: 기관형 종양 절편이 준비되면 약물 검사, siRNA 및 생체 조직 절편의 바이러스 감염을 포함한 여러 방법을 사용하여 중재적 접근을 수행할 수 있습니다. 여기에서는 약물 테스트와 국소 증식을 사용한 생존력 분석을 포함하는 다운스트림 기능 판독에 대해 논의할 것입니다.

1. 10% FBS, 2mM L-글루타민, 1% Pen Strep을 사용하여 10% v/v 완전 DMEM 10mL를 준비합니다.
2. 대조군 및 치료 조건에 대한 완전한 배지 5mL를 분취합니다. 나머지 5mL의 배지에 보르테조밉(2μM)을 추가하여 양성 대조군으로 종양 조각에서 세포 사멸을 유도합니다.
   참고: 고농도의 보르테조밉은 세포 사멸을 유도하는 세포독성 약물입니다. 다른 세포독성 약물은 세포 사멸을 위한 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.
3. 투과성 접시 상에 도말된 2 내지 4개의 조직 절편을 사용하여, 단계 4.2에서 제조된 배지 뿐만 아니라, 단계 2.1.2에 기술된 바와 같이 공초점 현미경을 이용한 다운스트림 생존율 LIVE/DEAD 분석에 사용될 임의의 추가 조합 요법을 접시에 첨가하거나, 순차적으로 매칭된 절편을 사용하는 상업적 발광 생존도 분석을 사용한다.
   참고: 발광 생존율 분석이 세포 ATP 함량에 의존한다는 점을 감안할 때 순차적 슬라이스 매칭은 발광 생존도 분석에 필수적입니다. 세포 용해 중에 내부 대조군이 손실되기 때문에 결과가 생존 가능한 세포의 시작 수에 따라 달라지기 때문에 유사한 크기의 슬라이스가 필요합니다(즉, 불균형한 슬라이스는 불균형한 결과를 초래함). 사용자가 순차적 슬라이스를 얻지 못하는 경우, 발광 생존도 분석이 불가능하며, 이와 같이 다른 생존도 평가 방법(유세포 분석 또는 공초점 이미징 기반 생세포 분석)이 요구될 것이다.
4. 조직 절편을 완전한 DMEM이 포함된 배양물에 2-5일 동안 그대로 두고 배지와 보르테조밉 및 5-FU를 격일로 교체합니다.
5. 발광 생존율 분석을 위해 500μL의 PBS를 12웰 접시에 넣고 순차적으로 일치하는 조직 조각을 페인트브러시를 사용하여 PBS 용액에 옮기거나 1mL 피펫을 흡입하여 부드럽게 옮겨 옮깁니다.
6. PBS를 제거하고 발광 생존도 분석 용액을 첨가하여 제조하였다. 시약 준비에 대해서는 사용 설명서를 참조하십시오.
7. 조건당 발광 생존도 용액 500μL를 추가하고 실온에서 30분 동안 셰이커에서 천천히 회전하면서 배양합니다. 발광 플레이트 리더를 사용하여 발광을 읽습니다.

결과

요컨대, PMP의 인간 종양 표본은 IRB 승인 프로토콜에 따라 얻어집니다. 조직을 준비하고, 미세 해부하고, 비브라톰을 사용하여 절단할 아가로스 주형에서 고형화한다(도 1A; 비디오 1). 절단된 조직 절편은 투과성 삽입막(그림 1B)에 배치되고 배양되며, 이는 현장 이미징 분석뿐만 아니라 유세포 분석, 컨포칼 이미징 분석 및 세포 독성 ?...

토론

이 원고는 인간 가성 점액종 복막종(PMP) 종양 표본을 배양, 심문 및 분석하는 데 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 종양 면역 미세 환경과 벤치 투 베드사이드 테스트를 위한 플랫폼을 조사하기 위해 수많은 다운스트림 기능 분석을 활용했습니다.

이 방법은 우리 손에서 매우 효율적이지만 비브라톰을 사용하여 종양 표본을 절단하는 데는 약간의 연습이 필요합니다. ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA